化妆品美白功效测试体外重组3D黑色素模型测试方法(T-SHRH 021—2019).pdf

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1、ICS 71.100.70 C2682 Y42 团团 体体 标标 准准 T/SHRH 021-2019 _ 化妆品美白功效测试 体外重组 3D 黑色素模型 测试方法 Comestics whitening efficacy test-In vitro Reconstructed human skin contaning melanocytes test method 2019-12-30 发布 2020-01-30 实施 上海日用化学品行业协会 发布 T/SHRH T/SHRH 021-2019 1 目目 次次 前言 2 1 范围 3 2.规范性引用文件 3 3.术语和定义 3 4.试验原则.

2、3 5.试剂及仪器设备 4 6.试验步骤 4 7.结果计算 5 8.质量控制 6 9.结果判定 6 附录 A:（资料性附录）7 T/SHRH 021-2019 2 前前 言言 本标准按照 GB/T1.1-2009 给出规则起草。本标准由上海日用化学品行业协会提出和归口。本标准的某些内容可能涉及专利，本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准起草单位：广东博溪生物科技有限公司、上海家化联合股份有限公司、上海上美化妆品有限公司、上海创元化妆品有限公司、福建片仔癀化妆品有限公司、东阿阿胶股份有限公司、上海绿瑞生物科技有限公司、云南贝泰妮生物科技集团股份有限公司、上海清轩生物科技有限公司、上海天

3、祥质量技术服务有限公司、上海日用化学品行业协会。本标准主要起草人：卢永波、李潇、张艳云、曹平、陈田、陈静、廖筝筝、曾四立、吴梅芳、陈贞明、谢阿贵、廖峰、姜春鹏、赵奕竹、马骁、王飞飞、高宏旗、朱翠翠、李琼、金坚、陈亦华 T/SHRH 021-2019 3 化妆品化妆品美白功效美白功效测试测试 体外重组体外重组 3D 黑色素模型黑色素模型 测试方法测试方法 1 范围范围 本标准规定了一种基于体外重组3D黑色素模型的化妆品原料及化妆品成品的美白功效测试方法。本标准可作为化妆品美白功效测试替代方法之一，也可结合其他方法对化妆品美白功效进行评价。本标准适用于具有生物化学美白作用的化妆品原料及成品的美白功

4、效测试，不适用于物理遮盖类美白原料或成品。2 规范性引用文件规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 化妆品安全技术规范 3 术语和定义术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。3.1 体外重组 3D 黑色素皮肤模型 in vitro reconstructed human skin containing melanocytes 采用人原代表皮角质形成细胞及黑素细胞共培养形成的一种复层化、高度分化的三维重建皮肤模型。

5、该类模型需对外界刺激（UVB、-MSH、ET-1 等）具有黑化响应，及对美白剂（曲酸等）具有美白响应。3.2 吸光度 optical density,OD 入射光强度与透射光强度比值的常用对数值。表示被检测物吸收的光学密度。特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成正比关系。4 试验原则试验原则 4.1 方法简要步骤 本标准采用体外重组 3D 黑色素模型（MelaKutis）对具有生物化学美白机理的化妆品原料及成品进行美白功效性测试。化妆品原料采用液下给药方式，在气液面培养的第 6 天（TA6）开始给药，连续给药 6 次，单次孵育时长为 24h。化妆品成品采用表面给药方式，在模型气液面培

6、养第 6 天（TA6），第 8 天（TA8）进行 2 次给药，剂量为 10L/次，单次给药后孵育时长为 48h。待测物给药、孵育全部结束后，去除待测物残留，对暴露后的体外重组 3D 黑色素模型进行表观色度，L*值，黑色素分布及黑素含量等测试。4.2 方法测试终点 生物化学美白主要通过抑制黑色素的合成、阻断黑色素的转运及加快黑色素的代谢等机制达到美白功效。体外重组 3D 黑色素皮肤模型（MelaKutis）具有类似天然皮肤的黑化和美白响应能力，在化T/SHRH 021-2019 4 妆品原料或成品暴露后，通过如下四个测试终点评价受试物美白功效。其中，表观色度与 L*值用于测定待测物的亮白作用；黑

7、素颗粒分布用于测定待测物的黑素转运抑制作用；黑素含量用于测定待测物的黑素合成抑制作用。5 试剂及仪器设备试剂及仪器设备 5.1 材料及试材料及试剂剂 5.1.1 体外重组 3D 黑色素皮肤模型（MelaKutis）。5.1.2 体外重组 3D 黑色素皮肤模型培养液（M-TA 培养液）。5.1.3 PBS 缓冲液。5.1.4 曲酸（Kojic Acid，KA）。5.1.5 二甲基亚砜（Dimethylsulfoxide，DMSO）。5.1.6 乙醇。5.1.7 乙醚。5.1.8 氢氧化钠（NaOH）。5.1.9 丙二醇。5.1.10 黑素标准品（CAS 号：29512-49-0）。5.1.11

8、多聚甲醛（4%）。5.1.12 Masson-Fontana 黑色素染色试剂盒。5.2 仪器仪器设备设备 5.2.1 UVB 辐照仪：50mJ/cm2。5.2.2 酶标仪：405nm。5.2.3 超净工作台。5.2.4 CO2细胞培养箱：371，51%CO2，95%相对湿度。5.2.5 分析天平(精度 0.1mg)。5.2.6 移液器：连续加样器和相应吸头、M25 活塞排代式移液器和相应吸头、2L10L、10L 100L、20200L、1001000L 移液器及相应吸头。5.2.7 通风柜。5.2.8 电热恒温水浴锅（80）。5.2.9 单反相机。5.2.10 色度仪。5.2.11 正置显微镜

9、。5.2.12 低温高速离心机。6 试验步骤试验步骤 6.1 体外重组体外重组 3D 黑色素皮肤模型的准备黑色素皮肤模型的准备 该步骤在超净工作台中进行。每轮测试中，空白对照组、阳性对照组、阴性对照组和各待测物组均需要 1 块 6 孔板。标记 6 孔板，在每个孔中加入 3.7 mL 的 M-TA 培养液，并放入无菌悬架，将气液面培养 3 天（TA3）的体外重组 3D 黑色素皮肤模型转移至无菌悬架中，置于 CO2培养箱中培养（371、51%CO2、95%相对湿度）。每组需用 6 个模型，其中表观色度、黑素颗粒分布测定需 3 个重复模型；L*值、黑素含量测定需 3 个重复模型。6.2 UVB 诱导

10、诱导 T/SHRH 021-2019 5 阳性对照组、阴性对照组、待测样品组自TA3开始，连续进行7天UVB辐照，辐照剂量为50mJ/cm2/次。每次辐照结束后，更换培养液，液量为 3.7 mL/孔。空白对照组不进行 UVB 辐照，每天仅更换培养液，液量为 3.7 mL/孔。6.3 给药给药 6.3.1 化妆品成品给药方式 在气液面第 6 天（TA6）和气液面第 8 天（TA8）进行表面给药，给药量为 10L。阳性对照选用曲酸，给药浓度为 0.05%。6.3.2 化妆品原料给药方式 从气液面第 6 天（TA6）开始每天进行液下给药，共 6 次，给药间隔时间为 24h。阳性对照组每孔添加含 42

11、.67g/mL 曲酸的 M-TA 培养液；待测物每孔添加含一定浓度受试物的 M-TA 培养液。阴性对照组、空白对照组仅更换培养液。6.4 清洗：清洗：化妆品成品给药全部结束后，采用超纯水对皮肤模型表面清洗三次，去除受试物残留。化妆品原料类给药全部结束后，用无菌棉签擦拭皮肤模型底面，去除受试物残留。6.5 检测检测 6.5.1 表观表观色度色度 将比色卡置于单反相机正下方，用镊子将单个模型放置于比色卡色圈内，进行拍照。单反相机参数设置为手动拍照模式，焦距调至 5.8 mm，孔径设置为 f/8，光圈调至 F22，快门速度设置为 1/80s，ISO 设置为 1600。6.5.2 L*值测定值测定 用

12、手术刀片沿模型边缘进行环切后，用干净的镊子置于相片纸上，保证角质层朝上放置；色差仪自校后，将色差仪检测孔垂直按压于模型表面进行三次读数，取平均值作为单个模型的 L*值最终读数。6.5.4 黑素黑素颗粒颗粒分布分布测定测定 将表观色度拍照结束后的模型，用手术刀片沿模型边缘进行环切后，放入装有 4%多聚甲醛溶液的 1.5mL 离心管中，固定 2h。采用乙醇脱水、二甲苯透明后，进行石蜡包埋，切片（厚度 58m）。二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化结束后，根据 Masson-Fontana 黑色素染色试剂盒说明书进行染色，封片后，置于正置显微镜下 40 倍物镜下拍照，观察黑素颗粒分布。6.5.3 黑色素含量检测

13、黑色素含量检测 将 L*值测定后的模型置于 1.5mL 离心管中，加入 1mL PBS 缓冲液，涡旋振荡仪震荡 3min，低温高速离心机 2000r/min 离心 10min，弃上清；向 1.5mL 离心管中依次加入 200L 蒸馏水，500L 无水乙醇和 500L 乙醚，充分混匀后，室温静置 20min，3000r/min 离心 5min，弃上清；加入 1mL 含 10%DMSO 的 1mol/L NaOH 水溶液，80水浴中加热 40min，用移液器吸取 200L 至 96 孔板中，酶标仪 405nm 波长下读取 OD 值。7 结果结果计算计算 T/SHRH 021-2019 6 7.1

14、L*值值 根据每组三个重复模型的 L*值，计算平均值（Mean）及标准差（Standard Deviation，SD），结果采用 MeanSD 形式表示。7.2 黑素含量黑素含量 以黑色素标准品的浓度为纵坐标，OD 值为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程式，将测定的OD 值代入回归方程式，计算黑素含量。计算每组三个重复模型的黑素含量平均值及标准差，结果采用 MeanSD 形式表示。7.3 黑素颗粒分布黑素颗粒分布 每个模型选 3 个区域，于 40X 镜下拍照，用图像分析软件（如 Image J 等）计算黑色素颗粒面积。8 质量控制质量控制 8.1 基本原则：每批次试验均需设置空白对照、阴性对照

15、和阳性对照。实验中设置的各种对照应符合以下标准。如任一种对照出现非下述标准，则视为质控不合格。8.2 阴性对照：与空白对照组相比，表观色度呈现明显黑化，L*值呈现 10%以上下降，黑素含量呈现10%以上升高、黑素分布呈现明显升高，且具有统计学差异。每组中，三个重复模型的 L*值与黑素含量标准偏差均小于等于 15%。8.3 阳性对照：与阴性对照组相比，表观色度呈现明显变白，L*值呈现 10%以上升高，黑素含量呈现10%以上下降、黑素分布呈现明显下降，且具有统计学差异。每组中，三个重复模型的 L*值与黑素含量标准偏差均小于等于 15%。8.4 待测样品：三个重复模型的 L*值与黑素含量标准偏差均小于等于 15%。9 结果判定结果判定 以下条件说明待测物具有美白功效:与阴性对照组相比，待测物表观色度明显变白，L*值具有统计学显著性差异；与阴性对照组相比，待测物黑色素颗粒分布减少，且有统计学显著性差异；与阴性对照组相比，待测物黑色素含量降低，且有统计学显著性差异；如待测物有部分指标满足上述条件，仍可说明待测物具有美白功效。_ T/SHRH 021-2019 7 基底层 棘 层 颗粒层 角质层 附录 A（资料性附录）图 A.1 体外重组 3D 黑色素模型实物图 图 A.2 体外重组 3D 黑色素模型 Masson-Fontana 染色图片 黑色素细胞