第二章--蛋白质课件.ppt

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1、第第 二二 章章 蛋蛋 白白 质质 化化 学学蛋白质的分类蛋白质的分类蛋白质的组成单位蛋白质的组成单位肽肽蛋白质的结构蛋白质的结构蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系蛋白质的性质蛋白质的性质蛋白质的分离与分析技术蛋白质的分离与分析技术蛋白质分子中氨基酸序列的测定蛋白质分子中氨基酸序列的测定蛋蛋白白质质（proteinprotein）是是由由许许多多不不同同的的-氨氨基基酸酸按按一一定定的的序序列列通通过过酰酰胺胺键键（肽肽键键）缩缩合合而而成成的的，具具有有较较稳定构象稳定构象和和特定生物功能的生物大分子特定生物功能的生物大分子。ProteinProtein：源源自自希希腊腊文文“”，

2、意意指指“最最原原初的初的”、“第一重要的第一重要的”。蛋蛋白白质质存存在在于于所所有有的的生生物物细细胞胞中中，是是构构成成生生物物体体最最基本的基本的结构物质结构物质和和功能物质功能物质。蛋蛋白白质质是是生生命命活活动动的的物物质质基基础础，它它参参与与了了几几乎乎所所有有的生命活动过程。的生命活动过程。形状形状纤维状蛋白质：纤维状蛋白质：形状呈细棒或纤维状，形状呈细棒或纤维状，在生物体内主要起结构作用在生物体内主要起结构作用球状蛋白质：球状蛋白质：形状接近球形或椭球形，形状接近球形或椭球形，可溶于水可溶于水膜蛋白质：膜蛋白质：与细胞的各种膜系统结合而存在与细胞的各种膜系统结合而存在功能功

3、能酶：酶：荧光素酶荧光素酶调节蛋白：调节蛋白：胰岛素胰岛素储存蛋白：储存蛋白：卵清蛋白卵清蛋白转运蛋白：转运蛋白：血红蛋白血红蛋白运动蛋白：运动蛋白：肌球蛋白、肌动蛋白肌球蛋白、肌动蛋白防御蛋白与毒蛋白：防御蛋白与毒蛋白：免疫球蛋白、干扰素免疫球蛋白、干扰素受体蛋白：受体蛋白：胰岛素受体胰岛素受体支架蛋白：支架蛋白：SH2SH2组件组件结构蛋白：结构蛋白：胶原蛋白胶原蛋白异常功能蛋白：异常功能蛋白：胶质蛋白胶质蛋白 第二节第二节 蛋白质的组成单位蛋白质的组成单位有些还含微量的有些还含微量的P P、FeFe、ZnZn、CuCu、MoMo和和I I等元素。等元素。N N含量在各种蛋白质中比较接近含

4、量在各种蛋白质中比较接近，平均为平均为16%16%，1g 1g 氮氮 相当于相当于 6.25g 6.25g 的蛋白质的蛋白质 (蛋白质系数：蛋白质系数：6.25)6.25)。凯氏定氮法测定蛋白质含量的理论依据：凯氏定氮法测定蛋白质含量的理论依据：蛋白质含量蛋白质含量 蛋白质含蛋白质含N N量量 6.25 6.25一、元素组成一、元素组成元素元素CHONS含量含量50 556 820 2315 180 4（一）（一）（一）（一）氨基酸氨基酸（amino acidamino acid）：分子中既含氨基又含分子中既含氨基又含分子中既含氨基又含分子中既含氨基又含羧基的化合物，蛋白质中仅含有羧基的化合物

5、，蛋白质中仅含有羧基的化合物，蛋白质中仅含有羧基的化合物，蛋白质中仅含有2020种基本氨基酸种基本氨基酸种基本氨基酸种基本氨基酸。（二）氨基酸的结构通式：（二）氨基酸的结构通式：除脯氨酸（亚氨基酸）外，除脯氨酸（亚氨基酸）外，其他其他1919种均具有如下结构通式：种均具有如下结构通式：二、二、氨基酸组成氨基酸组成 氨基酸的结构通式氨基酸的结构通式除除脯氨酸脯氨酸外，均外，均为为-氨基酸氨基酸不对称碳原子上的不对称碳原子上的4 4个取代基在空间的取向可以有个取代基在空间的取向可以有两种方式（构型），称两种方式（构型），称D D型和型和L L型，型，D D型和型和L L型型这两种这两种构型互为对映

6、体。构型互为对映体。氨基酸的立体化学特性氨基酸的立体化学特性除甘氨酸外，其它除甘氨酸外，其它1919种基本氨基酸至少有两种异构种基本氨基酸至少有两种异构体。体。具有两个不对称碳原子的氨基酸（例如苏氨酸、异具有两个不对称碳原子的氨基酸（例如苏氨酸、异亮氨酸）可以有亮氨酸）可以有4 4种异构体。种异构体。构成蛋白质的氨基酸（除构成蛋白质的氨基酸（除脯氨酸和甘氨酸脯氨酸和甘氨酸脯氨酸和甘氨酸脯氨酸和甘氨酸外）外）外）外）均为均为为为L L型氨基酸。型氨基酸。蛋白质用碱进行水解时，或用一般的有机合成方法蛋白质用碱进行水解时，或用一般的有机合成方法合成氨基酸时，得到的氨基酸为合成氨基酸时，得到的氨基酸为

7、D D型氨基酸和型氨基酸和L L型氨型氨基酸的混合物。基酸的混合物。2020种基本氨基酸的中英文名称种基本氨基酸的中英文名称名名 称称 三字母三字母符号符号 单字母字母符号符号 名名 称称 三字母三字母符号符号 单字母字母符号符号 丙氨酸丙氨酸alanine alanine Ala Ala A A 亮氨酸亮氨酸leucine leucine Leu Leu L L 精氨酸精氨酸arginine arginine Arg Arg R R 赖氨酸氨酸lysine lysine Lys Lys K K 天冬天冬酰胺胺asparagine asparagine AsnAsn N N 甲硫氨酸甲硫氨酸m

8、ethionine methionine Met Met M M 天冬氨酸天冬氨酸aspartic aspartic acid acid Asp Asp D D 苯丙氨酸苯丙氨酸phenylalanine phenylalanine Phe Phe F F 半胱氨酸半胱氨酸cysteine cysteine Cys Cys C C 脯氨酸脯氨酸proline proline Pro Pro P P 名名 称称 三字母三字母符号符号 单字母字母符号符号 名名 称称 三字母三字母符号符号 单字母字母符号符号 谷氨谷氨酰胺胺glutanine glutanine GlnGln Q Q 丝氨酸氨酸se

9、rine serine Ser Ser S S 谷氨酸谷氨酸glutamic glutamic acid acid Glu Glu E E 苏氨酸氨酸threonine threonine Thr Thr T T 甘氨酸甘氨酸glycine glycine Gly Gly G G 色氨酸色氨酸tryptophan tryptophan TrpTrp W W 组氨酸氨酸histidinehistidineHis His H H 酪氨酸酪氨酸tyrosine tyrosine Tyr Tyr Y Y 异亮氨酸异亮氨酸isoleucine isoleucine Ile Ile I I 颉氨酸氨酸va

10、line valine Val Val V V 基本氨基酸的分类：基本氨基酸的分类：必需氨基酸：必需氨基酸：人体不能合成的，必需由食物中提供。人体不能合成的，必需由食物中提供。TrpTrp、ThrThr、MetMet、ValVal、LysLys、LeuLeu、IleIle和和PhePhe。半必需氨基酸：半必需氨基酸：在体内虽能合成，但其合成原料是在体内虽能合成，但其合成原料是必需氨基酸。必需氨基酸。CysCys、TyrTyr、ArgArg、SerSer和和GlyGly。非必需氨基酸：非必需氨基酸：人体能够合成，不必由食物供给。人体能够合成，不必由食物供给。根据人体的需要根据人体的需要脂肪族氨基

11、酸：脂肪族氨基酸：中性氨基酸：中性氨基酸：GlyGly、AlaAla、ValVal、LeuLeu、IleIle；含羟基或硫氨基酸：含羟基或硫氨基酸：SerSer、ThrThr、CysCys、MetMet；酸性氨基酸及其酰胺：酸性氨基酸及其酰胺：AspAsp、GluGlu、AsnAsn、GlnGln；碱性氨基酸：碱性氨基酸：ArgArg、LysLys芳香族氨基酸：芳香族氨基酸：PhePhe、TyrTyr、TrpTrp杂环氨基酸：杂环氨基酸：HisHis、ProPro根据根据R R基团的化学结构基团的化学结构根据根据R R基团的极性和带电性质基团的极性和带电性质非极性氨基酸：非极性氨基酸：Gly

12、Gly、AlaAla、ValVal、LeuLeu、IleIle、MetMet、PhePhe、ProPro、TrpTrp极性氨基酸：极性氨基酸：不带电：不带电：SerSer、ThrThr、AsnAsn、GlnGln、TyrTyr、CysCys；带正电：带正电：HisHis、LysLys、ArgArg；带负电：带负电：AspAsp、GluGlu共同特点：共同特点：R R基团为芳香环基团为芳香环亚氨基酸，没有自由的亚氨基酸，没有自由的 氨基，氨基，氨基酸的侧氨基酸的侧链取代了自身氨基上的链取代了自身氨基上的一个氢原子形成的一个氢原子形成的5 5元杂元杂环结构。环结构。非极性氨基酸非极性氨基酸共同特点

13、：共同特点：R R基团含有羟基、巯基基团含有羟基、巯基不带电荷的极性氨基酸不带电荷的极性氨基酸带负电荷的极性氨基酸（带负电荷的极性氨基酸（pH=7pH=7时）时）共同特点：共同特点：R R基团带有负电基团带有负电共同特点：共同特点：R R基团带有正电基团带有正电带正电荷的极性氨基酸（带正电荷的极性氨基酸（pH=7pH=7时）时）非蛋白质氨基酸非蛋白质氨基酸自然界中还有自然界中还有150150多种不参与构成蛋白质的氨基酸。多种不参与构成蛋白质的氨基酸。它们大多是基本氨基酸的衍生物，也有一些是它们大多是基本氨基酸的衍生物，也有一些是D-D-氨基酸或氨基酸或、-氨基酸。氨基酸。鸟氨酸鸟氨酸(orni

14、thineornithine)和和瓜氨酸瓜氨酸(citrullinecitrulline)：尿素代谢的中间产物。尿素代谢的中间产物。丙氨酸丙氨酸:维生素（遍多酸）的成分。维生素（遍多酸）的成分。氨基丁酸氨基丁酸:由谷氨酸脱羧产生的，它是传递神经由谷氨酸脱羧产生的，它是传递神经冲动的化学介质（神经递质）。冲动的化学介质（神经递质）。1 1、一般物理性质、一般物理性质无色晶体，熔点极高，一般在无色晶体，熔点极高，一般在200200以上；以上；不同氨基酸有不同的味感；不同氨基酸有不同的味感；能溶于稀酸或稀碱，不溶于有机溶剂；能溶于稀酸或稀碱，不溶于有机溶剂；具有旋光性和极性；具有旋光性和极性；紫外吸

15、收和荧光性质。紫外吸收和荧光性质。（五）氨基酸的理化性质（五）氨基酸的理化性质紫外吸收光谱和荧光光谱紫外吸收光谱和荧光光谱构成蛋白质的构成蛋白质的2020种氨基酸在可见光区都没有光吸收，种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区但在远紫外区(200nm)(97%97%以上）；以上）；知道蛋白质的相对分子质量；知道蛋白质的相对分子质量；知道蛋白质由几个亚基组成。知道蛋白质由几个亚基组成。三、测定蛋白质一级结构的策略三、测定蛋白质一级结构的策略通过末端分析确定蛋白质分子的多肽链数；通过末端分析确定蛋白质分子的多肽链数；拆开并分离提纯每条多肽链；拆开并分离提纯每条多肽链；拆开多肽链内部的二硫键；拆

16、开多肽链内部的二硫键；完全水解完全水解多多肽链，测定其氨基酸组成和比例；肽链，测定其氨基酸组成和比例；鉴定每条鉴定每条多肽多肽链的链的N N末端和末端和C C末端；末端；酶促法或化学法部分裂解多肽链，使其降解成一酶促法或化学法部分裂解多肽链，使其降解成一套大小不等的肽段，并将分离各肽段；套大小不等的肽段，并将分离各肽段；测定每个多肽段的氨基酸顺序；测定每个多肽段的氨基酸顺序；同样的多肽链样品再用另一种方法部分裂解成同样的多肽链样品再用另一种方法部分裂解成另一套肽段，其断裂点与第一种的不同，分离另一套肽段，其断裂点与第一种的不同，分离肽段并测序。肽段并测序。比较两套肽段的氨基酸顺序，根据其重叠部

17、分比较两套肽段的氨基酸顺序，根据其重叠部分拼凑出整个多肽链的氨基酸顺序；拼凑出整个多肽链的氨基酸顺序；测定原来的多肽链中二硫键的位置。测定原来的多肽链中二硫键的位置。N-N-末端分析：末端分析：二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFB）法、丹磺酰氯法、）法、丹磺酰氯法、苯异硫氰酸酯苯异硫氰酸酯(PITC)(PITC)法、氨肽酶法。法、氨肽酶法。C-C-末端分析：末端分析：肼解法、肼解法、羧肽酶法。羧肽酶法。多肽与肼在无水条件下加热，多肽与肼在无水条件下加热，C-C-端氨基酸即从肽端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛

18、缩合成不溶于水的物质而与物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-C-端氨端氨基酸分离基酸分离。羧肽酶能从多肽链的羧肽酶能从多肽链的C-C-端逐个的水解。端逐个的水解。将蛋白质将蛋白质在在pH 8.0,30pH 8.0,30与羧肽酶一起保温，按一定时间间与羧肽酶一起保温，按一定时间间隔取样，用纸层析测定释放出来的氨基酸，根据氨隔取样，用纸层析测定释放出来的氨基酸，根据氨基酸的量与时间的关系，就可以知道基酸的量与时间的关系，就可以知道C C末端氨基酸末端氨基酸的顺序。的顺序。二硫键的拆开和肽链的分离：二硫键的拆开和肽链的分离：如果肽链之间不是共价交联的，可用酸、碱、高如果肽链之间不是共价交联的，

19、可用酸、碱、高浓度的盐或其他变性剂处理蛋白质，把肽链分开。浓度的盐或其他变性剂处理蛋白质，把肽链分开。如果肽链之间以二硫键交联；或肽链中含有链内如果肽链之间以二硫键交联；或肽链中含有链内二硫键，用还原剂拆开二硫键。二硫键，用还原剂拆开二硫键。用纸层析、离子交换柱层析、电泳等方法分离拆用纸层析、离子交换柱层析、电泳等方法分离拆开的多肽链。开的多肽链。肽链的完全水解和氨基酸组成的测定：肽链的完全水解和氨基酸组成的测定：用酸水解（如用酸水解（如6 mol/l6 mol/l盐酸），同时辅以碱水解（如盐酸），同时辅以碱水解（如5 mol/l 5 mol/l NaOHNaOH），得到氨基酸混合物，再分离测

20、定氨基酸。），得到氨基酸混合物，再分离测定氨基酸。肽链的部分裂解：肽链的部分裂解：化学裂解法：溴化氰选择性地切割由甲硫氨酸的化学裂解法：溴化氰选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键羧基所形成的肽键。酶裂解法：酶裂解法：蛋白酶蛋白酶可水解的肽键可水解的肽键胰蛋白酶胰蛋白酶羧基端为羧基端为赖氨酸和精氨酸赖氨酸和精氨酸胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶羧基端为芳香氨基酸（羧基端为芳香氨基酸（PhePhe、TrpTrp、TyrTyr）或有较大非极性侧链的氨基酸或有较大非极性侧链的氨基酸胃蛋白酶胃蛋白酶羧基端或氨基端为芳香氨基酸或疏水氨基酸羧基端或氨基端为芳香氨基酸或疏水氨基酸凝血酶凝血酶Arg-GlyArg-

21、Gly肽段的分离纯化：肽段的分离纯化：用层析或电泳分离提纯多肽部分用层析或电泳分离提纯多肽部分裂解后的小肽段。裂解后的小肽段。肽段氨基酸序列的测定肽段氨基酸序列的测定EdmanEdman降解法：肽段的末端氨基与降解法：肽段的末端氨基与苯异硫氰酸酯苯异硫氰酸酯（PITCPITC）在弱碱性条件下形成相应的苯氨基硫甲酰）在弱碱性条件下形成相应的苯氨基硫甲酰衍生物，后者在无水强酸介质中与酸作用发生环化，衍生物，后者在无水强酸介质中与酸作用发生环化，然后转变为相应的苯乙内酰硫脲衍生物而从肽链上然后转变为相应的苯乙内酰硫脲衍生物而从肽链上掉下来，产物可与残余肽段分离并鉴定。掉下来，产物可与残余肽段分离并鉴

22、定。质谱法法测序质谱法法测序：裂解寡肽随机产生一套大小只差裂解寡肽随机产生一套大小只差1 1个氨基酸残基的肽段；根据每两个长度相邻的肽段个氨基酸残基的肽段；根据每两个长度相邻的肽段的相对分子质量之差，确定唯一有区别（一个有另的相对分子质量之差，确定唯一有区别（一个有另一个没有）的氨基酸残基的类型。一个没有）的氨基酸残基的类型。根据核苷酸序列推定。根据核苷酸序列推定。肽段在多肽链中次序的决定肽段在多肽链中次序的决定肽段在多肽链中次序的决定肽段在多肽链中次序的决定用两种或两种以上的方法断裂多肽样品，分离每套用两种或两种以上的方法断裂多肽样品，分离每套肽段的各肽段并测序；比较几套肽段的氨基酸顺序，肽

23、段的各肽段并测序；比较几套肽段的氨基酸顺序，找出其重叠部分，据此确定每个肽段的适当位置，找出其重叠部分，据此确定每个肽段的适当位置，拼凑出整个多肽链的氨基酸顺序。拼凑出整个多肽链的氨基酸顺序。二硫键位置的确定：二硫键位置的确定：胃蛋白酶水解带有二硫键的蛋胃蛋白酶水解带有二硫键的蛋白质，从部分水解产物中分离出含二硫键的肽段，白质，从部分水解产物中分离出含二硫键的肽段，再拆开二硫键，将两个肽段分别测序，再与整个多再拆开二硫键，将两个肽段分别测序，再与整个多肽链比较，即可确定二硫键的位置。肽链比较，即可确定二硫键的位置。蛋白质的分类蛋白质的分类蛋白质的组成单位蛋白质的组成单位肽肽蛋白质的结构蛋白质的

24、结构蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系蛋白质的性质蛋白质的性质蛋白质的分离与分析技术蛋白质的分离与分析技术蛋白质分子中氨基酸序列的测定蛋白质分子中氨基酸序列的测定蛋白质的定义与功能蛋白质的定义与功能蛋白质的组成单位蛋白质的组成单位元素组成：元素组成：C H O N SC H O N S，蛋白质系数，蛋白质系数6.256.25氨基酸组成：氨基酸组成：2020种基本氨基酸，代表符号、结构特种基本氨基酸，代表符号、结构特点、紫外吸收、等电点、点、紫外吸收、等电点、成肽反应、脱羧与脱氨基成肽反应、脱羧与脱氨基反应反应肽：肽：定义、命名、肽键的定义及特性、定义、命名、肽键的定义及特性、肽链骨架

25、、肽链骨架、书写规则、肽平面、肽的构象、书写规则、肽平面、肽的构象、谷胱甘肽谷胱甘肽蛋白质的结构：蛋白质的结构：结构层次、定义、结构层次、定义、稳定蛋白质结稳定蛋白质结构的作用力、构的作用力、结构类型及其特点结构类型及其特点蛋白质结构与功能的关系：蛋白质结构与功能的关系：一级结构和高级结构功一级结构和高级结构功能的关系能的关系蛋白质的性质：蛋白质的性质：相对分子量相对分子量 kDkD、等电点、变性与、等电点、变性与复性（变性蛋白质的特征）、胶体性质（水化层与复性（变性蛋白质的特征）、胶体性质（水化层与双电层）、蛋白质的可逆沉淀、双电层）、蛋白质的可逆沉淀、双缩二脲反应，含双缩二脲反应，含量测定（量测定（福林福林-酚试剂法、考马斯亮蓝酚试剂法、考马斯亮蓝G-250G-250法和紫法和紫外吸收法外吸收法）蛋白质的分离与分析技术：蛋白质的分离与分析技术：分离纯化的一般程序、分离纯化的一般程序、分离纯化的方法和原理分离纯化的方法和原理蛋白质一级结构的测定：蛋白质一级结构的测定：测定策略测定策略