输送生物分离【机械工程】.pdf

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1、cheng cheng 第一章 生物分离的一般步骤 1、不溶物的去除（固液分离）预处理 包括过滤、离心、细胞破碎等，产物浓度和质量得到了提高。2、产物提取（浓缩）产物初步纯化的过程。将目标产物与性质差异较大的杂质分开，可大幅提高产物浓度。往往多单元协同操作，如吸附、萃取、沉淀、超滤等。以上分离过程不具备特异性，只是进行初分，除去主要杂质 3、产品的纯化 产物被高度纯化，除去与目标物性质接近的杂质。采用的技术具有产物的高选择性和杂质的去除性，即可以除去微量的杂质。如色谱、电泳、层析等。4、产品精制 将纯化的产品按要求制成商用成品。按商品要求的用途、纯度、剂型等进行最后加工。如结晶、喷雾干燥、冷冻

2、干燥等。生物分离基本原理 生物分离的基本原理是指根据混合物（包括原子、离子、分子、分子复合物、分子聚合体、和细胞、细胞碎片和颗粒等）中各种溶质间具有物理、化学和生物学性质的差别，利用能够识别这些差别的分离介质和能够扩大这些差别的分离设备，实现各种物质的分离，或使被分离的目的产物得以纯化。第二章 发酵液预处理的目的 预处理的目的：促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离的效率：（1）改变发酵液的物理性质，包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸，降低液体黏度。（2）相对纯化，去除发酵液中的部分杂质（高价无机离子和杂蛋白质），以利于后续各步操作。（3）尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数是液相）。发

3、酵液预处理的方法 1.加热法（Heating）2.调节悬浮液的 pH 值（Regulation of pH）3.助滤剂和反应剂（Filter aids and Reactant)4.杂蛋白的去除（Removal of useless protein）5.高价无机离子的去除（Removal of inorganic ion）6.凝聚和絮凝（Coagulation and flocculation）凝聚：凝聚是指在电解质作用下，由于胶粒之间扩散双电层电位下降，电排斥作用降低，破坏胶体体系的分散状态，使之不稳定相互凝集成 1mm 左右块状凝聚体的现象。常用的凝聚剂电解质有：硫酸铝 Al2(SO4)3

4、18H2O（明矾）；氯化铝 AlCl36H2O;三氯化铁 FeCl3;硫酸亚铁 FeSO47H2O；石灰；ZnSO4；MgCO3 絮凝：指在某些高分子絮凝剂的作用下，基于架桥作用，使胶粒交联成团、形成 10mm 大小的较大絮凝团的过程。影响絮凝效果的因素 絮凝剂分子量和类型 絮凝剂用量 溶液 pH 搅拌时间 搅拌转速 混 凝：包括了凝聚和絮凝机理的过程称为混凝 cheng cheng 高价无机离子的除去 1、Ca2+的去除 一般加草酸，生成不溶性的草酸钙，还能使蛋白质絮凝凝固，提高滤液（也称为原液）质量。草酸价格较高，溶解度较小，用量大时，可用其可溶性盐，如草酸钠。应注意回收草酸。2、Mg2+

5、的去除 加入三聚磷酸钠 Na5P3O10，它和镁离子形成可溶性络合物后，即可消除对树脂的影响。Na5P3O10+Mg2+MgNa3P3O10+2Na+3、Fe3+的去除 可加黄血盐使其形成普鲁士兰沉淀而除去。4Fe3+3K4Fe(CN)6=Fe4Fe(CN)63+12K+杂蛋白的去除方法：沉淀法 变性法 吸附法 澄清过滤 介质为硅藻土、砂、颗粒活性炭、玻璃珠、塑料颗粒等，填充于过滤器内构成过滤层，固体颗粒被阻拦式吸附，使滤液澄清。滤饼过滤 A、滤饼过滤的特点：过滤介质为滤布，当悬浮液通过滤布时，固体颗 粒被滤布阻拦而逐渐形成滤饼（滤渣）。在滤饼过滤中，当滤饼至一定厚度时即起主要的过滤作用。适合

6、于固体含量大于 0.1%的悬浮液的过滤分离。B、过滤推动力 悬浮液自身压强差、重力；悬浮液的外加压力；过滤介质的抽真空；离心力。滤饼的质量比阻 衡量过滤特性的主要指标是滤饼的质量比阻 rB，它表示单位滤饼厚度的阻力系数，决定过滤的流速。与滤饼的结构特性有关。对于可压缩性滤饼，rB 是操作压力差的函数：rBr(P)m r-不可压缩滤渣的比阻，对于一定的料液为常数；m-压缩性指数，一般取 0.5-0.8，对不可压缩性滤饼 m 为 0。对于不可压缩性滤饼，rB 为常数，恒压下的过滤方程 恒压下，可压缩性滤饼的比阻应为常数。如过滤介质 的阻力相对较小可以忽略不计，q 到时间时通过单位过滤面积的滤液量，

7、m3；P 压力差，Pa；滤液粘度，Pas；rB 滤饼的质量比阻，m/kg；XB 通过单位体积滤液所形成的滤渣重量(干重),kgm3；过滤时间，s 过滤速度的强化 降低滤饼比阻力 rB 降低滤液黏度 降低悬浮液中悬浮固体的浓度 对发酵液进行预处理，改善滤液性质 错流过滤：又称切向流过滤,即液体的流向和滤膜相切。离心分离的概念:基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程.14(22BBXrpqcheng cheng 离心分离颗粒沉降速度 d 颗粒直径；p 颗粒密度；m 液体介质密度；液体介质粘度；旋转角速度；r 转轴中心到颗粒中心距离。与颗粒直径有关，大颗

8、粒容易沉降。与颗粒密度和介质密度之差(p-m)成正比。与介质粘度成反比，随介质粘度增大而减小。增大离心力（2r）可提高沉降速度。对沉降速度小的颗粒，提高转速是有效的方法。分离因数 Fr（离心力强度）：离心力与重力的比值，表示粒子在离心机中产生的离心加速度与自由下降的加速度之比;沉降系数 S：指物质在单位离心场的沉降速度，是关于蛋白质等生物大分子的一个重要参数，一般用斯维德贝格（Svedberg）单位表示，1S=10-13s。在生物化学研究中，沉降系数 S 有两个重要用途(1）预计沉降时间(2）测定物质分子质量 第三章 机械破碎法又可分为 高压匀浆破碎法（homogenization）高速珠研磨

9、破碎法（bead grinding）超声波破碎法（ultrasonication）高压匀浆法适用的范围 高压匀浆法适用的范围：酵母和大多数细菌细胞的破碎；料液细胞浓度可以很高，20%左右。影响高压匀浆器细胞破碎因素：被破碎的细胞分率符合如下公式：ln1/(1-R)=KNP R 破碎率，为 N 次循环后，蛋白质的释放量Rn 与最大释放量 Rm 之比；K 与温度有关的速度常数；P 操作压力，MPa；与微生物种类有关的常数。升高压力有利于破碎，减少细胞的循环次数，甚至一次通过匀浆阀就可达到几乎完全的破碎，这样就可避免细胞碎片不至过小。但 p 大到一定值时对匀浆器的磨损增加，也有实验表明 p 超生一定

10、值时，R 增加但很慢。在工业生产中，通常采用的压力为 5570Mpa。破碎性能还随菌体种类和生长环境的不同而不同 大肠杆菌的细胞比酵母细胞容易破碎，生长在简单的合成培养基上的大肠杆菌比生长在复杂培养基上容易破碎。非机械法：酶溶破碎法（enzyme lysis）化学破碎法（chemical treatment）去垢剂破碎法（detergents）渗透压冲击破碎法（osmotic shock）冻融破碎法（freezing and thawing）其中酶法和化学法溶胞应用最广。化学渗透法：（1）酸、碱处理法（2）表面活性剂（3）有机溶剂（4）EDTA 螯合剂 物理法：渗透压冲击法 冻结-融化法 22

11、()(14 6)18pmpdurcheng cheng 干燥法 破碎率的测定 1.直接测定法：采用染色法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色；采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色，而受损害的细胞呈亮红色。2.目的产物测定法：将破碎后的细胞悬浮液离心，测定上清液中目的产物含量或活性，并与 100%破碎率的标准值比较，计算其破碎率。3.导电率测定法：细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。包涵体的构成 包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。包

12、涵体的形成：大肠杆菌中目标产物的表达水平过高，超过正常代谢水平，过多表达产物聚集在细胞内，形成不溶性的包涵体。高表达产生的积聚物在细胞内部形成不溶物原因：蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀；蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀；蛋白生成太快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀；表达蛋白过多，与其结合/诱导组分不足，不能形成溶解状态 蛋白质自身不稳定 包涵体获得几种常见的工艺路线(一)路线 1 的特点 特点:是利用了包涵体与细胞碎片的密度差，用离心法将包涵体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，获得了干净的包涵体，再对包涵体溶解复性。优点：摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂质，使后面的分

13、离纯化简单了。从这个角度上讲，包涵体的形成对分离纯化亦有好处。缺点:要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎片，加工时间较长。目标蛋白的变性溶解 包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才能进一步纯化。一般水溶液很难将其溶解，只有采用蛋白质变性才能使其形成可溶性的形式。常用变性剂：5-8 mol/L 盐酸胍和 6-8 mol/L 尿素,作用：破坏离子间相互作用；表面活性剂如 1-2 SDS，作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。pH9.0 的碱溶液和有机溶剂，使用较少。影响变性因素：时间、pH、离子强度、变性剂种类和浓度。目标蛋白的复性：原理：在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即蛋白质高级

14、结构被破坏，但一级结构和共价键没有破坏。当部分变性剂被除去后，蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该过程称复性。机械破碎(高压匀浆、高速珠磨）cheng cheng 复性方法：稀释法除变性剂 加入大量水或缓冲液。膜分离法除变性剂 透析、超滤、电渗析。层析法：凝胶层析，高效疏水层析 第四章 沉淀法的目的 浓缩；有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分，初步纯化；将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。盐析的概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。盐析

15、是可逆的，而变性是不可逆的。盐析法机理（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。（2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。（3）中和电荷，减少静电斥力，中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠。硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂。蛋白质溶解度与盐浓度的关系 S=-s 和 Ks 的物理意义 代表截距，即当离子

16、强度为零，也就是纯水中的假想溶解度的对数。与蛋白质种类、温度、pH 值有关，与盐无关；Ks盐析常数，代表图中直线的斜率；Ks 与温度和 pH 无关，但和蛋白质与盐的种类有关。但这种变化不大。用盐析法分离蛋白质的二种方法 第一类叫 Ks 分段盐析法 第二种叫 分段盐析法 等电点沉淀法的概念：在低的离子强度下，调 pH 至等电点，使蛋白质所带净电荷为零，降低了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，形成沉淀的操作称为等电点沉淀。有机溶剂沉淀法机理：A 降低溶剂介电常数（介电常数 D 有机 D水），减小溶剂极性，削弱溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加带电粒子间的作用力，因相互吸引而聚合沉淀。B

17、破坏水化膜：使用的有机溶剂与水互溶，从蛋白质分子周围的水化层中夺走水分子，降低蛋白质分子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化层，使蛋白质沉淀。C 相反力：疏水基团暴露并与有机溶剂疏水基团结合形成疏水层。常用的有机溶剂沉淀剂：沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。乙醇是最常用的沉淀剂。cheng cheng 有机溶剂沉淀法的影响因素；1、温度 2、pH 3、离子强度 4、样品浓度 5、金属离子助沉作用 选择性变性沉淀法的概念:选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀下来，而与目的物分开。选择性变性沉淀法的方法:(1)利用表面活性剂或有机溶剂引起

18、变性；(2)利用对热的不稳定性，加热破坏某些组分，而保存另一些组分；(3)酸碱变性。第五章 结晶的概念：结晶是从液相或气相中产生形状一定、分子（或原子、离子）有规则排列的晶体的现象。饱和曲线和过饱和曲线：稳定区和介稳区：SS 曲线下方为稳定区，在该区域任意一点溶液均是稳定的；而在 SS 曲线和 TT 曲线之间的区域为介稳区，此刻如不采取一定的手段（如加入晶核），溶液可长时间保持稳定；加入晶核后，溶质在晶核周围聚集、排列，溶质浓度降低，并降至 SS 线；介于饱和溶解度曲线和过饱和溶解度曲线之间的区域，可以进一步划分养晶区和刺激结晶区 不稳定区：在 TT 曲线的上半部的区域称为不稳定区，在该区域任

19、意一点溶液均能自发形成结晶，溶液中溶质浓度迅速降低至 SS 线（饱和）；因此，工业生产中通常采用加入晶种（加入的晶体），并将溶质浓度控制在养晶区，以利于大而整齐的晶体形成。结晶的步骤：1、过饱和溶液的形成（1）热饱和溶液冷却（等溶剂结晶）（2）部分溶剂蒸发法（等温结晶法）（3）真空蒸发冷却法（4）化学反应结晶 2、晶核的形成（1）初级成核 过饱和溶液中的自发成核现象。发生区域：不稳定区。发生机理：胚种及溶质分子相互碰撞的结果。（2）二次成核 向介稳态过饱和溶液中加入晶种，会有新晶核产生，叫二次成核。工业结晶的成核现象通常为二次成核。二次成核的机理 尚不十分清楚。晶体生长 扩散传质（以浓度差推动

20、力）晶体表面反应（晶格排列）两步串联过程 常用的工业起晶方法 1、自然起晶法 2、刺激起晶法 3、晶种起晶法 结晶的条件 1、浓度 2、纯度 3、pH 值 4、溶剂环境 5、温度 6、时间和晶种 结晶的方法 1、盐析结晶法 2、透析结晶法 3、有机溶剂结晶法 cheng cheng 4、等电点结晶法 5、温度诱导法 6、微量扩散法 第六章 离子交换树脂结构：骨架、功能基团、活性离子、待交换分子 阳离子交换树脂：强酸性阳离子交换树脂、弱酸性阳树脂 影响树脂膨胀度的主要因素：交联度 活性基团的性质和数量 活性离子的性质 介质性质和浓度 骨架结构 交联度：单体中交联剂的含量百分数称为交联度 湿真密度

21、：又称堆积密度，指单位体积湿树脂的含量 交换容量是表征树脂活性基团数量交换能力的重要参数。总交换容量：每克干树脂上活性功能团的总数（3-6 mmol/g 干树脂）。工作交换容量也叫实用交换容量，即在某一指定的应用条件下树脂表现出来的交换容量，它与树脂种类和总交换容量以及具体工作条件如溶液的组成，流速、稳定等因素有关。再生交换容量：由于树脂失效后要经再生方能重新使用，在指定的再生剂用量条件下的交换容量称再生交换容量，三者之间的关系：工作交换容量 总交换容量 再生交换容量 0.51.0(交换容量)工作交换容量0.30.9(再生交换容量)影响交换速度的因素：（1）树脂粒度：愈小越快（2）交联度（3）

22、温度：越高越快。（4）离子化合价（5）离子大小：越小越快（6）搅拌速度（7）离子浓度 离子交换树脂的选择性影响因素：离子水化半径 离子化合价 溶液的酸碱度 交联度，膨胀度 辅助力 有机溶剂 离子强度 第七章 截 留 率：膜 对溶 质的 截 留 能 力 以 截 留率 R（rejection）来表示，其定义为 R1 CpCb 截断曲线：得到的截留率与分子量之间的关系称为截断曲线。截断分子量:（molecular weight cut-off，MWCO）相当于一定截留率(通常为 90或 95)的分子量，随厂商而异。由截断分子量按可估计孔道大小。透析：利用具有一定孔径大小、高分子溶质不能透过的亲水膜，

23、将含有高分子溶质和其它小分子溶质的溶液与水溶液或缓冲液分隔；由于膜两侧的溶质浓度不同，在浓差的作用下，高分子溶液中的小分子溶质（如无机盐）透过膜向水透渗透，这就是透析。微 滤：以多孔薄膜为过滤介质，压力差为推动力，利用筛分原理使不溶性粒子（0.1-10um）得以分离的操作。操作压力 0.05-0.5MPa。反渗透：利用反渗透膜选择性的只能通过溶剂（通常是水）而截留离子物质性质，以膜两侧静压差为推动力，克服渗透压，使溶剂通过反渗透膜实现对液体混合物进行分离的过程。操作压差一般为1.510.5MPa，截留组分为小分子物质。再生交换容量工作交换容量离子交换树脂的利用率cheng cheng 电渗析原

24、理：利用待分离分子的荷点性质和分子大小的差别，以外电场电位差为推动力，利用离子交换膜的选择透过性，从溶液中脱除或富集电解质的膜分离操作；电渗析器主要组成部分是离子交换膜。分为阳膜，阴膜。阳膜只充许阳离子通过而阴离子被阻挡；阴膜只充许阴离子通过而阳离子被阻挡。阳离子交换膜C和阴离子交换膜A各两张交错排列，将分离器隔成 5 个小室，两端与膜垂直的方向加电场，即构成电渗析装置。膜的污染大体可分为：沉淀污染 吸附污染 生物污染 第八章 超临界流体萃取特点：萃取和分离合二为一 压力和温度都可以成为调节萃取过程 的参数 萃取温度低 临界 CO2 流体常态下是气体，无毒 超临界流体的极性可以改变 反胶束萃取

25、的原理：胶束：将表面活性剂溶于水中，表面活性剂会在水溶液中聚集而形成聚集体，这种聚集体是水溶液中的胶束，称为正常胶束。在胶束中，表面活性剂的极性基团在外，与水接触，非极性基团在内，形成一个非极性的核心，在此核心可以溶解非极性物质。反胶束：若将表面活性剂溶于非极性有机溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度（CMC），便会在有机溶剂中形成聚集体，这种表面活性剂的聚集体称为反胶束。在反胶束中，表面活性剂的非极性基团在外，与非极性有机溶剂接触；而极性基团则排列在内，形成一个极性核。此极性核具有溶解极性物质的能力。极性核溶解水后，就形成了一个“水池”。当含有此种反胶束的有机溶剂与蛋白质的水溶液接触后，蛋白质

26、能够进入此水池，由于周围水层和极性基团的保护，保持了蛋白质的天然构型，不会造成失活，蛋白质更加稳定。常用的表面活性剂及相应的有机溶剂：AOT 异辛烷 CTAB 己醇/异辛醇、己醇/辛烷 TOMAC 环己烷 Triton X 己醇/环己烷 卵磷脂 苯、庚烷等 反胶束萃取的影响因素；1、pH 对萃取的影响 2、离子强度对萃取的影响 3、表面活性剂类型 4、表面活性剂的浓度 静电引力：主要是蛋白质的表面电荷与反胶束内表面电荷（离子型表面活性剂）之间的静电引力作用。空间位阻作用：增大反胶束极性核的尺寸，以减小大分子蛋白进入胶核的传质阻力。凡是能够引起静电引力，能够促使反胶束尺寸增大的因素均有利于提高分

27、配系数。当两种高聚物水溶液相互混合时，它们之间的相互作用可以分为三种情况：1.完全互溶，形成均相的高聚物水溶液。2.复合凝集，形成两个水相，两种高聚物都分配于一相，另一相几乎全部为溶剂水。3.互不相溶，也形成两个水相，但两种高聚物分别富集于上下两相。可以构成双水相的体系：双聚物：PEG/DEX、聚乙二醇/聚乙烯醇、聚乙烯醇/甲基纤维素、聚丙二醇/葡聚糖、聚丙二醇/甲氧基乙二醇等 聚合物-低相对分子质量的化合物：PEG/磷酸钾、PEG/磷酸胺、PEG/硫酸钠、PEG/葡萄糖等 常用聚合物：聚乙二醇葡聚糖 cheng cheng 聚乙二醇无机盐系统 双水相萃取的原理 利用物质在不相溶的两水相间分配系数的差异进行萃取。由于双水相系统的形成，物质在互不相溶的两水相间的分配系数不同，在适当的条件下，不同的物质分别分布在上相和下相，从而达到物质的分离。悬浮粒子与其周围物质具有的复杂的相互作用：（a）氢键 （b）电荷力 （c）疏水作用 （d）范德华力 （e）构象效应 影响双水相系统萃取的因素：1、成相高聚物浓度界面张力 2、成相高聚物的相对分子质量 3、电化学分配 4、温度的影响 在双水相系统中，由于成相高聚物对蛋白质有稳定化作用，所以蛋白质等大分子的分配系数对温度的变化不敏感，室温操作。相系统的黏度比冷却时低，有助于相的分离，并节省了能源。5、疏水反应 6、生物亲和分配