[VIP专享]0809皮肤干细胞的研究进展及应用(定1)6102.pdf

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1、1皮肤干细胞的研究进展及应用皮肤是人体最大的器官,它被覆于身体表面，由表皮、真皮、皮下组织及附属器组成。在抵御微生物入侵、紫外线辐射以及防止水分的丢失、调节体温和维持人的外貌等方面起着十分重要的作用。表皮约每月更新一次,始终处于持续的增殖、分化、脱落、消亡状态,且增殖与消亡的速度保持一致,以保证皮肤的完整性。皮肤具极强的修复和再生能力，这与皮肤干细胞的存在具有直接的关系。皮肤干细胞是一类存在于皮肤（包括表皮、真皮、附属器）中的成体干细胞，始于胚胎发育阶段，并保持增殖分化潜能直至成年。皮肤干细胞是皮肤发生、修复、重塑的关键性源泉,是皮肤组织工程理想的种子细胞。了解皮肤干细胞增殖及调控机制,在创伤

2、愈合、组织移植、基因治疗及医疗美容等方面有着广泛的应用前景。1 表皮干细胞的分类及定位皮肤干细胞是各种皮肤细胞的祖细胞,在胚胎发育过程中,具有双向分化的能力,一方面可向下迁移分化为表皮基底层,进而生成毛囊;另一方面则可向上迁移,并最终分化为各种表皮细胞。在成体,皮肤干细胞在正常情况下大多处于休眠状态,在病理状态或在外因诱导下具有不同程度的再生和更新能力。研究者们已从表皮中分离出表皮干细胞（Epidermal stem cells，ESCs）、从毛囊侧部分离出毛囊干细胞以及从真皮中分离出的干细胞。表皮干细胞存在于环境稳定、血管丰富的区域,但对它在皮肤中的确切定位还有争论。一般认为表皮干细胞在表皮

3、基底层呈片状分布,而在没有毛发的部位如手掌、脚掌,则仅存在于基底层与真皮乳头顶部相连处。表皮基底层中有 1%10%的细胞为干细胞,随着年龄的增大,表皮脚(伸向真皮层内的表皮基底层)与真皮乳头逐渐平坦,2表皮干细胞的数量也随之减少。这也是成人的创伤愈合能力较小儿弱的重要原因之一。目前，人们对毛囊间干细胞和毛囊内干细胞研究的相对较广。1.1 毛囊间干细胞我们都知道，上皮细胞的增殖和自我更新主要发生于皮肤的基底层。正常情况下，基底层细胞的增殖分裂是不需要其他附属物，如毛囊的协助的，其具有自我增殖能力。整个生命过程中，都有上皮细胞的不断更新，所以人们假设，在上皮的基底层存在一部分干细胞。有学者提出类似

4、的模型，认为基底层的干细胞通过短暂的增殖，增殖后的细胞具有定向分化成某种终末分化细胞的能力，这些细胞通过几次或者几十次的增殖分裂，最终形成了表皮中其他类型的组织细胞。根据这个模型，每一个上皮细胞都可以产生一个子上皮细胞，人们把这种干细胞称为上皮增殖单位（Epidermal proliferative unit，EPU）。每一个EPU 在都会有不同的终端分化，皮肤的每一层细胞均是以一个 EPU 为中心，然后向周围逐渐分化增殖形成的。同时，在鼠皮肤模型的研究中，通过使用逆转录病毒感染基底部位的细胞，发现一些表皮细胞来源于基底膜处。此外，脉冲标签的研究也证明了基底膜处确实存在表皮干细胞。然而，Cla

5、yton 等通过实验发现，有些细胞并不是完全遵循 EPU 模型。其发现基底部的一些细胞，有些并没有分化增殖而只是数目上的不断增加，于是其用数学分析的方法，提出了定向祖细胞（Committed progenitor，CP）模型。有些上皮干细胞能够定向分裂出两种新的基底细胞，同样也能随机分裂出两种不同类型的定向基底细胞。毛囊间干细胞的分裂模式究竟是 CP 模型还是 EPU 模型，目前还存在争议。但近期的研究表明，两种模型可能同时存在于毛囊干细胞的增殖过程。此外，体外培养人角质细胞时发现暳 1-integrin 阳性的细胞具有很高的增殖潜能，并且这类细胞主要分布于基底层。因此有学者认为1-integ

6、rin 可以作为毛囊间干细胞的标记物之一。但是，1-integrin 的表达水平与表皮干细胞的直接关系尚未明确，还需进一步验证。1.2 毛囊干细胞3人们不仅从皮肤表皮基底层中分离出了表皮干细胞,还在位于表皮之下的毛囊侧部的隆突处发现了干细胞的存在,并将其命名为毛囊干细胞。Cotsarelis 等首先在毛囊的隆突部发现了毛囊干细胞。毛囊是哺乳动物重要的皮肤附属结构，在此之前，人们一直认为包囊中所产生的细胞全部为基质细胞。但是随着研究的深入，人们发现当把毛囊中的基质细胞全部杀死后，毛囊还是可以从外根鞘中重新长出。此后，Ito 等用遗传跟踪的方法发现毛囊中的一类细胞不仅能促进毛囊增殖-凋亡的循环过程

7、，而且能够协助表皮的生长，帮助损伤再修复。Quan 等把大鼠的毛囊进行体外培养发现，体外培养的克隆中，95%的克隆细胞来源于隆突。由此，越来越多的人认为毛囊中的干细胞发挥着重要的作用，所以人们通常把位于隆突部分的干细胞称为毛囊干细胞。并且人们在毛囊干细胞表面发现了一些特有的表面分子，如角蛋白 15（Krt15 为大部分隆突干细胞的表面分子，表达这类分子的隆突干细胞具有协助毛囊和表皮生长的功能）、Lgr5（主要促进毛囊的生长）、CD34、Sox9、Lhx2、Tcf3 及 Nfatc 等。1.3 其他部位表皮干细胞最近,加拿大学者又从大鼠真皮中提取出干细胞,并利用这些干细胞成功培养出神经细胞、脂肪

8、细胞和平滑肌细胞,这些研究成果加深了人们对皮肤干细胞临床应用价值的认识。此外，在皮脂腺，汗腺等部位也有表皮干细胞的存在。利用逆转录病毒追踪技术发现，在皮脂腺内有些细胞可以被标记。在近期的研究中，Plikus 等在汗腺中也发现了表皮干细胞，这些干细胞能协助汗腺导管的产生和修复。2 皮肤干细胞的来源皮肤干细胞,主要来源于胚胎干细胞,也可由成体干细胞产生。成体干细胞在自然条件下倾向于分化成所在组织的各种细胞,用于维持机体的新陈代谢,但在特定的外界条件诱导下,一种组织细胞可以“横向分化”成其他组织的功能细胞,参与组织的损伤修复,即成体干细胞的“可塑性”。虽有研究对成体干细胞4“可塑性”提出了质疑,但有

9、实验结果已证实作者在方法学上是可靠的,因而可塑性是客观存在的。3 皮肤干细胞的增殖和分化皮肤干细胞皮肤干细胞具有强大的自我更新能力,在体外培养时呈克隆性生长。通常情况下,皮肤干细胞通过不对称分裂产生一个子代干细胞和一个定向祖细胞即短暂增殖细胞。子代干细胞具有高度的增殖潜能,但分化较慢。短暂增殖细胞增殖潜能有限,但可不断增加分化细胞数量,产生终末分化细胞。表皮干细胞及其产生的短暂增殖细胞、终末分化细胞构成一个表皮增殖单位,分布在表皮不同的空间。表皮更新时,由基底层表皮干细胞分化产生的短暂增殖细胞失去对基底膜的黏附,向上迁移,最后经过一系列生物化学和形态学变化,达到表皮最外层,形成角质化表皮细胞,

10、角质化表皮细胞最终脱落为皮屑。表皮受到外来损伤时,还可通过对称分裂产生两个干细胞或两个祖细胞,增加干细胞或分化细胞的数量,从而更好地适应机体的需要。Bickenbach 等将用酶消化法分离的鼠表皮细胞进行长期培养,不断传代、克隆。在器官型培养中可形成分化完全的表皮。Dun-nwald 等使用 Hoechest 和碘化丙啶联合染色,流式细胞仪分选的纯角质形成细胞群,具有干细胞所有的功能特征。4 皮肤干细胞的基本特征皮肤干细胞具有以下基本的特征:体内慢周期性:表现为活体细胞标记滞留。标记滞留细胞可以长期探测到放射活性,表明他们在体内分裂很慢,具有干细胞在体内慢周期性的特点。具有自我更新能力:表现为

11、体外培养时细胞呈克隆状生长,大约能进行 140 次分裂,产生 11040个子代细胞。对皮肤基底膜的黏附性,主要通过表达整合素实现。整合素表达也是维持皮肤干细胞特征的一个基本条件。5 皮肤干细胞的表面标志及鉴定5迄今为止,有关皮肤干细胞的特异性标志物的研究报道不一。目前学术界认可并应用广泛的是依据其在形态学上表现为非成熟细胞特征、具有较强的自我更新能力及表皮干细胞一些相对特异的细胞表面标记。5.1 表皮干细胞形态及动力学特征 显微镜下表皮干细胞为角蛋白,形态较为原始,体积小,核大,核浆比例大,流式细胞仪分析表皮干细胞多数处于静止期、DNA 合成前期,其分裂增殖活动相对静止。体外培养时干细胞体现了

12、无限的增殖能力,呈克隆状生长。5.2 整合素整合素包括 和 两种亚基,干细胞高水平表达3种整合素家族:21,31 和51。各种 整合素作为受体分子与基底膜各种成分的配体结合,是干细胞维持其特性的基本条件,由于表皮干细胞及短暂增殖细胞表面高表达 1 整合素,而有丝分裂后细胞及终末分化细胞不表达 1 整合素,因而可以用 1 整合素的抗体来鉴别表皮干细胞及暂时增殖细胞。最近 Cotsarelis 等研究证实表皮中 1 整合素高表达的基底细胞数目大于实际干细胞，故 1 整合素，作为鉴别皮肤干细胞的表面标志,仍有待进一步研究。另有学者利用表皮干细胞表面 6 整合素及另一个与增殖有关的表面标志 10G7

13、的单抗来区分表皮干细胞、暂时增殖细胞和终末分化细胞,6 表达阳性和 10G7 表达阴性为干细胞;6 和 10G7 表达均阳性的细胞为暂时增殖细胞;6表达阴性、角蛋白10 表达阳性的细胞为终末分化细胞。同时表皮基底层 6 表达阳性、10G7 表达阴性的细胞(6bri10 G7dim)比 1 表达阳性、10G7 表达阴性的细胞(1bri10G7dim)具有更高的增殖潜能。5.3 角蛋白角蛋白是表皮细胞的结构蛋白,随着分化程度的不同,表皮细胞表达不同的角蛋白,因而可用于鉴别表皮干细胞、短暂增殖细胞和终末分化细胞。表皮干细胞表达角蛋白 19;短暂增殖细胞表达角蛋白 5 和 14;终末分化细胞表达角蛋白

14、 1 和 10。一般认为皮肤基底层、毛囊隆突部干细胞角蛋白 19 表达阳性,但有毛发皮肤基底层的表皮干细胞角蛋白 9 表达阴性。Roh 等在实验中发现毛囊隆突部6表皮干细胞表达角蛋白 15,而且在干细胞的分化过程中,角蛋白 15 表达的减少较角蛋白 19 表达的减少角蛋白 15 阴更早,而角蛋白 19 阳性的细胞可能是“早期”短暂增殖细胞,在鉴别毛囊干细胞方面,角蛋白 15 可能比角蛋白 19 更有意义。但 Porter 等研究结果显示角蛋白 15 存在于整个毛囊根部外鞘中。总之表皮干细胞和角蛋白 15 的关系还需进一步研究和探索。谢举临等通过研究发现,在生理和病理条件的刺激下,干细胞能够表达

15、角蛋白,其中角蛋白 10 角蛋白是分化程度高的表皮细胞的特征蛋白,因此可以认 10 角蛋白是表皮干细胞和短暂增殖细胞的阴性表面分子标志,对于表皮干细胞和短暂增殖细胞的鉴定和分选有重要意义。其他分子标志:p63:p63 是肿瘤抑制因子之一,结构和功能与 p53 类似;Pellegrini 等发现在角膜缘的基底细胞有 p63 表达,在角膜表面的短暂增殖细胞没有 p63 表达,因而认为 p63 是表皮干细胞的标志物。p63 在表皮的发育中起重要作用,在成人皮肤他则是基底角质形成细胞活动性增生或具有增生能力的一个标志。CD71:CD71 为表皮干细胞表面转铁蛋白受体。从细胞数量、形态、分布部位和所含标

16、记保留细胞比例等多方面看,低水平表达 CD71 的那部分表皮细胞均符合表皮干细胞特征。连接蛋白 43(Connexin43,Cx43):Roh 等通过实验显示 Cx43 可能是两种不同组织(角膜和表皮)干细胞的阴性表面标志物。CD34:CD34 是一种属于型跨膜蛋白的磷酸糖蛋白,主要在造血(祖)细胞上表达。通过实验发现在培养条件下 CD34+细胞比 CD34-细胞具有更强的克隆能力,证实 CD34+上皮细胞比 CD34-上皮细胞具有更高的增殖潜能。此外证实 CD34+细胞位于毛囊的隆突部,它们处于静止期或在培养条件下有巨大的克隆能力,而且同标记保留细胞一样,用免疫组织化学和放射自显影法可以将

17、CD34 表达定位于毛囊的同一区域。因此这些细胞在生物学行为上与干(祖)细胞相似,故可以将其作为鉴别具有干细胞或祖细胞特征的毛囊细胞的标志物。皮肤干细胞的分子标志众多,但没有定论。6 皮肤干细胞的应用前景与展望7近年来,由于干细胞特有的生物学特性使其逐渐成为临床治疗多种疾病的新策略。特别是干细胞领域的重大突破-成体干细胞具有强大的可塑性,即一种组织的细胞可分化为另一种无关组织的细胞,甚至不同胚层的细胞在一定条件下也可相互转化,为干细胞的利用开辟了更广泛的空间。6.1 细胞治疗 当皮肤受到损伤时,位于皮肤表皮基底层和毛囊隆突的皮肤干细胞就会在内外因素的调控下,及时增殖分化为相关细胞,以修复机体受

18、损的表皮、毛囊等结构。据此人们将体外培养扩增的表皮细胞膜片或复合皮用于异体移植、烧伤或整形创面的修复。结果显示该移植物可形成完整的表皮结构,而且培养的异体表皮细胞不发生排斥,解决了创面的早期覆盖问题。近年来,有关成功应用复合皮移植的报道也日渐增多,即将创面上覆盖的异体皮于 35 d 后去除表皮,在保留的真皮上植以自体表皮细胞,随访发现表皮在11 个月后出现。可能由于培养条件的限制,基底层细胞损伤等造成的干细胞耗竭目前临床效果不是很理想。利用纤维蛋白作为细胞培养的支持物,是皮肤干细胞治疗的重大进步 ,它不影响细胞的克隆形成能力及长期的增殖潜能。这样的培养物移植可实现细胞的长期增殖,快速持久地覆盖

19、大面积损伤,并且费用低廉。徐荣祥等创建的原位干细胞培植技术就是直接利用皮肤干细胞对组织进行原位修复的。6.2皮肤组织工程 组织工程皮肤是应用组织工程学的基本原理和方法,将体外培养的细胞扩增后吸附于一种生物相容性良好并被人体逐步吸收的细胞外基质上,对其进行构建和移植,从而实现创伤的修复和重建。大面积度烧伤、广泛瘢痕切除、外伤性皮肤缺损、皮肤癌以及皮肤溃疡等导致的严重皮肤缺损,就可利用组织工程皮肤对其进行治疗。应用于细胞培养的细胞外基质是种植、支持、转运细胞的三维支架,目前开发的有3T3细胞、聚乌拉坦、透明质酸、纤维蛋白胶与脱细胞真皮等。随着科学的不断进步,利用组织工程皮肤治疗皮肤损伤疾病的效果日

20、渐改善,已成为临床皮肤大面积损伤患者皮源缺乏的根本途径,然而仍8存在一些问题有待解决,如自体细胞在体外培养所需周期较长(大约一两周),不适于急性伤口的治疗;异体或异种细胞移植后仍有延迟排斥反应的存在等。6.3 基因治疗 干细胞除应用于外伤性皮肤缺损以及皮肤溃疡等导致的严重皮肤缺损的移植治疗外,还可以用来研究基因的作用以及某些疾病发病的基因机制,同时也可以用来对一些遗传性皮肤病进行基因治疗,包括导入标志性基因或一个异源基因,使细胞内原有基因过度表达(增加功能),或基因打靶(失去功能)以及诱导某个基因的突变等。由于表皮的不断更新,必须对干细胞进行基因转染以确保外源基因在表皮细胞的长期表达。为使外源

21、基因在足够多的干细胞中表达,而不是在短暂增殖细胞中表达,需将表皮干细胞与短暂增殖细胞分离开,这是实现基因治疗的重要环节。6.4 抗衰老与美容保健 在众多类型的干细胞中与抗衰老、美容护肤保健最为密切是成体干细胞，尤其是间充质干细胞和皮肤干细胞等。6.4.1 干细胞抗衰老保健治疗体内干细胞的数量和生物活性与人体的各种生理和病理性改变密切相关。研究发现，老年人的干细胞的数量减少，增殖和分化能力下降。骨髓干细胞功能下降可能引起造血免疫功能不足，皮肤干细胞减少可能导致皮肤细胞更新缓慢，皮肤皱缩等。设法促进干细胞增殖，增加体内干细胞的数量或提供干细胞的生物活性，是抗衰老的有效措施，也是医学美容的重要方面。

22、干细胞抗衰老保健治疗的技术方式包括干细胞动员、体内活化与诱导、干细胞输注等。干细胞动员:干细胞在生理情况下处于静止状态，只有在接收动员信号后才启动其自我更新和分化机制，更新衰老死亡细胞和修复损伤组织。体内干细胞如何动员并启动增殖分化的详细机制并不十分清楚，但已经观察到在组织损伤时肌肉、皮肤、肝脏等组织中的干细胞增殖分化。目前还发现某些细胞因子可以动员干细胞进入增殖和分化状态。脂肪干细胞是未来发展的方向，取材方便，易培养，有着广泛的广泛的发展前景。9体内活化与诱导:用于保健治疗的干细胞可以来源于异体或自体，可以是胚胎干细胞或自体组织中的成体干细胞。从分化潜能上讲，越早期的干细胞，其分化功能越强，

23、移植后更新组织细胞的效率越高。胚胎干细胞是比较原始的未分化细胞，可以向所有组织类型的成熟细胞分化，应用潜能最大，但目前尚存在许多理论和技术问题，真正用于人体还有一段时间。自体干细胞，尤其是骨髓、脂肪来源的干细胞具有自体资源自己利用、取材容易、含量丰富、操作性和可行性强等优势，是目前抗衰老保健治疗的首选材料。干细胞输注:干细胞活化的策略是通过输注自体干细胞，自体干细胞警惕外增殖培养后，数量庞大，输入体内的干细胞可以产生大量的细胞因子，这些细胞因子，可以激活体内处于静止、休眠状态的成体干细胞，使其焕发活力，起到更新、修复受损、衰老器官和组织的作用。也可以给予机体某些活化因子，动员和活化体内处于休眠

24、状态的干细胞或移植进入人体的干细胞，提高自我更新和分化潜能。最近几年，已有较多涉及干细胞动员与活化的研究，但真正的高效干细胞活化因子较少。有报道认为，干细胞活化因子具有增加深层皮肤细胞的数量、促进皮肤表皮细胞活性等抗衰老功能。因而，唤醒或激活休眠的成体干细胞，恢复其再造和修复功能。同时干细胞对新陈代谢有重要的调节功能。干细胞保健治疗能提高皮肤的新陈代谢，改善微循环的功效具有着重大应用价值。研究统计发现，干细胞保健有显著的美容美肤效果：能使松驰下坠的皮肤光滑收紧，恢复皮肤弹性，减少皮肤皱纹和色素沉着。6.4.2 干细胞与医疗美容组织工程自体皮肤成纤维前体细胞注射除皱祛疤治疗技术：组织工程自体细胞

25、除皱治疗技术，是通过采取患者自体成纤维细胞经过分离、扩增，然后注射到皱纹和疤痕部位，这些活体细胞产生自体的胶原蛋白，产生的这些胶原蛋白可将皱纹和疤痕填充从而达到治疗的目的。该技术在美国和欧洲已经有临床10报告，经长达 7 年的应用研究，证明此技术尤其对 55 岁以下的参验者疗效明显，治愈后的满意率较高。组织工程自体皮肤干细胞复合皮肤：采用自体上皮细胞和真皮细胞在体外扩增后，接种到可降解的皮肤支架上进行培养，在体外构建组织工程皮肤，其和天然皮肤具有类似的结构和功能。然后再移植到病人自体，用于大面积烧伤患者和皮肤溃疡患者的皮肤移植和修复。到目前为止美国 FDA 已经批准同种异体细胞生产的组织工程皮

26、肤在临床使用，具有良好的临床效果，但异体细胞仍然存在着存活周期短、交叉感染等问题。组织工程自体复合皮肤采用患者自体的细胞，采用自体细胞在体外扩增培养制成，不存在免疫排斥反应和传染性疾病的交叉传染问题，是目前治疗皮肤烧伤病人非常有效的方法。可以广泛应用于治疗皮肤烧伤、溃疡、创伤等多种原因造成的皮肤缺损，尤其是能用于大面积皮肤烧伤的急救及康复治疗。干细胞护肤是通过正向平衡调节和减缓皮肤功能细胞凋亡两种方式来实现回复年轻皮肤状态的目的，这正是干细胞美容的精髓所在。皮肤干细胞的应用目前仍有许多问题尚未解决:在体外扩增获得足够量的干细胞以修复皮肤缺损的同时,如何保持自我特性;如何改进干细胞的分离培养技术

27、并控制干细胞向皮肤特有的生理结构分化;如何缩短干细胞的体外扩增时间。尽管如此,皮肤干细胞的无限增殖及多向分化潜能将使其在皮肤组织工程中有着非常广阔的应用前景。特别是干细胞在医学美容中的应用，虽然仍然处于实验室研究的初步阶段，但是它带来的前景让很多业内人士都非常关注。在日前举行的第十一届国际美容皮肤科学学术大会，由国内外专家介绍的干细胞毛发移植、自体干细胞治疗疗减皱、干细胞移植丰胸等新兴项目就是目前正处于基础研究阶段的医学美容尖端科技，虽然目前仅限于实验室研究阶段，离市场推广应用还有一段距离，但是这一新的趋势已经预示了医学美容的广阔前景。11参考文献1 胡葵葵,胡琼华 戴育成,等.皮肤干细胞的研

28、究进展J.国外医学皮肤性病学分册，2004，30（2）：105-1072 谢举临,利天增,祁少海,等.正常人皮肤表皮干细胞定位特征对修复皮肤创伤的意义J.中国临床康复,2003,7(4):570-5713 耿松梅,王剑利,王万卷,等.毛囊干细胞定位和体外向表皮分化J.中国医学科学院学报，2006，28（3）：360-3634 刘 娜,杜永军,杨光,谭家驹,等.皮肤干细胞的生物性状及其临床应用J.中国临床康复，2006，10(41):114-117 5 雷万军,王肖蓉.表皮干细胞临床应用现状J.中国组织工程研究与临床康复,2007,11(28):5610-56136 黄珊珊，王青，李利,等.皮肤干细胞的定位J.中国组织工程研究与临床康复，2008，12(34):6723-67267 钟建桥，胡念芳,李利，等.真皮干细胞与皮肤衰老关系的研究进展J.中国皮肤性病学杂志，2010，24(5):479-4808 周志强，杨蓉娅,等.微(无)创面部皮肤年轻化的临床进展J.实用皮肤病学杂志，2015，8(6):438-4409 中华医学会医学美学与美容学分会皮肤美容学组.注射美容专家共识J.临床皮肤科杂志，2015，44(5):435-43710 肖永强.脂肪干细胞在皮肤组织工程中的研究应用进展J.中国美容医学，2016，25(6):30-3312