蛋白酶活性的测定方法4997.pdf

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1、蛋白酶活性的测定方法(GB/T23527-2009)1 原理 蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林-酚试剂，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合物）。由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力。2 仪器和设备 2.1 分析天平：精度 0.0001g 2.2 恒温水浴：精度0.2 2.3 计时表 2.4 分光光度计 2.5 沸水浴器 2.6 振荡混合器 2.7 pH 计:精度 0.01p

2、H 单位 3 试剂和溶液 3.1 乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶 甲液：称取乳酸（80%-90%）10.6g,加水溶解并定容至 1000ml。乙液：称取乳酸钠（70%）16g,加水溶解并定容至 1000ml.使用溶液：取甲液 8ml,加乙液 1ml,摇匀，稀释一倍，即成 0.05mol/L 乳酸缓冲溶液。3.2 磷酸缓冲液的制备（pH=7.5）适用于中性蛋白酶 准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO3.12H2O）6.02 和磷酸二氢钠（NaH2PO3.2H2O）0.5g,加水定容至 1000ml 3.3 硼酸缓冲液(pH=10.5)适用于碱性蛋白酶 甲液：称取硼酸钠 19.08g,加水

3、溶解并定容至 1000ml。乙液：称取氢氧化钠 4.0g,加水溶解并定容至 1000ml.使用溶液：取甲液 500ml,加乙液 400ml,摇匀，用水稀释至 1L。3.4 0.4mol/L 碳酸钠溶液：准确称取无水碳酸钠 42.4g,以蒸馏水溶解定溶至 1000ml.3.5 0.4mol/L 的三氯醋酸液：准确称取 65.4 三氯醋酸,以蒸馏水溶解定溶至 1000ml 3.6 0.5mol/L 的 NaOH：准确称取 2g NaOH 溶解并定至 100ml 3.7 10.00mg/ml 酪素溶液 称取酪素 1.000g,准确至 0.001g,用少量的 0.5mol/L 的氢氧化钠溶液(若为酸性

4、蛋白酶则用浓乳酸 2-3 滴)润湿,加入适量的各适宜的缓冲液约80ml,在沸水浴中边加热边搅拌,直至完全溶解,冷却后,转入 100ml 容量瓶中,用适宜的缓冲液稀释至刻度,此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天.3.8 100g/ml 酪氨酸标准溶液 3.8.1 准确称取预先于 105干燥至恒重的 L-酪氨酸 0.1000g,用 1mol/L的盐酸 60ml 溶解后定容至 100ml,即为 1.00mg/ml 的酪氨酸溶液.3.8.2 吸取 1.00mg/ml 酪氨酸标准溶液 10.00ml,用 0.1mol/L 盐酸定容至100ml,即得 100.0g/ml L-酪氨酸标准溶液.3.9 酶样的制备

5、 准确称取 1.000g 固体酶或移取 1ml 液体酶样，用少量的适宜缓冲液溶解并用玻璃棒捣研,然后将上清液倒入 100ml 容量瓶,沉渣中再添入少量缓冲液捣研多次,最后全部移入容量瓶,稀释到刻度,用四层纱布过滤。滤液可作为测试酶用.该酶已经稀释 100 倍。4 分析步骤 4.1 标准曲线的绘制 L-酪氨酸标准溶液按下表配制。试管号 0 1 2 3 4 5 取 100 g/ml 酪氨溶液（ml）0 1 2 3 4 5 蒸馏水（ml）10 9 8 7 6 5 酪氨酸实际浓度（g/ml）0 10 20 30 40 50 4.2 分别取上述溶液各 1.00ml(须做平行试验)，各加 0.4mol/L

6、 碳酸钠溶液5.00ml。福林试剂使用溶液1.00ml,置于40+0.2水浴中显色20min,取出用分光光度计于波长 680nm,比色，以不含酪氨酸的 0 管为空白管调零点，分别测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。计算出当 OD 为 1 时的酪氨酸的量（g），即为吸光常数 K 值，其 K 值应在 95100 范围内。4.3 样品测定：4.3.1 先将酪素溶液放入 400.2恒温水浴中，预热 5min 4.3.2 取 4 支试管，各加入 1ml 酶液 4.3.3 取一支作为空白管，加 2ml 三氯乙酸，其他 3 管作为测试管各加入1ml 酪素，摇

7、匀，40保温 10min 4.3.4 取出试管，3 支测试管中各加入 2ml 三氯乙酸，空白管中加 1ml 酪素。4.3.5 静置 10min，过滤沉淀 4.3.5 各取 1ml 滤液，分别加 0.4mol/L 的 Na2CO3 5ml、福林试剂 1ml。在 40显色 20min。680nm 处测 OD 值。以空白管调零点。注：1.398 中性蛋白酶制剂和 166 中性蛋白酸制剂，除反应与显色温度为300.2外，其他操作同上，标准曲线做同样处理。5.计算 5.1 酶活定义：1g 固体酶粉（或 1ml 液体酶），在 40（酸性 pH=3.0、中性 pH=7.5、碱性 pH=10.5）条件下，1min 水解酪素产生 1g 酪氨酸为一个酶活力单位。5.2 计算酶的活性单位依据以下公式 蛋白酶的活力=AK4/10n U/g(ml)A：样品平行试验的平均 OD 值