发酵工艺学整理资料12977.pdf

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1、发酵工艺学整理资料 1.发酵工程的概念:指利用微生物的生长繁殖和代谢活动来大量生产人们所需产品过程的理论和工程体系。2.发酵工程的内容：微生物菌种选育和保藏，培养基和发酵设备的灭菌技术，空气净化技术，菌种的扩大培养，代谢产物发酵生产，发酵过程中参数检测、分析和控制技术，发酵过程中补料技术，产品分离纯化技术 3.巴斯德证明了酒精是由活的酵母发酵引起的 4.发酵产品的类型：A 微生物菌体发酵 目的：获得微生物菌体细胞 例如酵母和藻类、担子菌、苏云金芽杆菌、疫苗等 特点：细胞的生长与产物积累成平行关系，生长稳定期产量最高。B 微生物酶发酵 目的：获得酶制剂和酶调节剂 例如青霉素酰化酶、糖苷酶抑制剂

2、特点：需要诱导作用，或遭受阻遏、抑制等调控作用的影响，在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需给予注意 C 微生物代谢产物发酵:包括初级代谢产物（无种属特异性）和次级代谢产物（微量、有种属特异性、特殊活性）D 微生物转化发酵 生物转化：是利用生物细胞对一些化合物某一特定部位(基团)的作用，使它转变成结构相类似但具有更在经济价值的化合物 实质：利用微生物代谢过程中的某一酶或酶系将一种化合物转化成含有特殊功能集团产物的生物化学反应。E 基因工程发酵 F 动、植物细胞产物的发酵 5.发酵的方法：A 表面发酵培养 固体表面发酵培养：投资小、设备少、简单易行、适于小型化生产 B 液体深层发酵培养 微生

3、物细胞在液体深层中进行纯种培养的过程 6.液体深层发酵流程 保藏菌种 斜面活化 扩大培养 种子罐 主发酵 产物分离纯化 7.微生物转化与发酵的区别 发酵是通过微生物的生长繁殖和代谢活动，产生人们所需产品的过程。其核心是微生物 8.菌种选育的目的：提高发酵产量；改进菌种性能；去除多余组分；产生新的发酵产物 9.菌种选育基本理论：遗传与变异;遗传与变异的物质基础；基因突变的本质 10.菌种选育技术：A 自然选育 用途：分离、纯化、复壮菌种 B 诱变育种 用途：发酵工业广泛应用 C 原生质体融合 用途：有两个合适亲本时的菌种选育 D 基因工程育种 用途：清楚微生物的遗传背景时的菌种选育 11.菌种退

4、化和变异的原因 A 遗传基因型的分离 要点：遗传物质的多样化，群体繁殖 B 自发突变的结果 可能原因：1）沙土管长期保藏 2)连续传代 3）新陈代谢产成品 生的诱变物质 4）增变基因、死亡基因的存在 C 经诱变剂处理后的退化变异。12.自然选育流程图 C 诱变剂及诱变剂剂量的选择：诱变剂种类选择：对遗传稳定的出发菌株，最好采用以前未使用过的、突变谱较宽的、诱变率高的强诱变剂(NTG,EMS)。对遗传不稳定的出发菌株，采用温和诱变剂(UV)。对诱变史较长的高产菌株，如多次使用某一诱变剂，可能出现“钝化”现象，此时则需改用另外的诱变剂。最佳剂量的选择：常以杀菌率来表示相对剂量（剂量-存活率曲线)。

5、在产量变异工作中，常采用相对杀菌率为 7585%,甚至 90%的剂量。但对多核细胞菌株，一般用高剂量处理，便于形成较纯的菌落和增加多细胞菌株的稳定性 D 突变株的筛选：随机筛选和理性筛选 随机筛选之一：摇瓶筛选：初筛一般是一个菌株只做一个摇瓶，从大量菌株中选出 10-20%较好的菌株，淘汰 80-90%的菌株；而复筛中摇瓶培养一般是一个菌株培养 3 瓶，并要重复3-5 次，选出 3-5 个较好的菌株，再做进一步比较，选出最佳的菌株 随机筛选之二;琼脂块筛选法 之三：自动化筛选 13.营养缺陷型菌株的浓缩：一般包括：诱变处理、中间培养、淘汰野生型菌株、检出营养缺陷型、鉴定营养缺陷型的种类等 5

6、个步骤 14.淘汰野生型的方法有抗生素法和菌丝过滤法 抗生素法：常用于细菌和酵母菌营养缺陷型菌株的富集，前者用青霉素法，后者用制霉菌素法。青霉素作用细菌的原理：未曾突变的野生型在基本培养基上能生长，突变为营养缺陷型的菌株被抑制。营养缺陷型菌株在基本培养基上不生长，也不分裂，因此不受青霉素的作用而保存。制霉菌素作用真菌的机理：制霉菌素可与真菌细胞膜上的甾醇作用，从而引起膜的损伤，也是只能杀死生长繁殖着的酵母菌或霉菌。在基本培养基中加入抗生素，野生型生长被杀死，营养缺陷型不能在基本培养基中生长而被保留下来 菌丝过滤法：原理：真菌和放线菌等丝状菌的野生型孢子在基本培养基中能萌发长成菌丝，生产菌种斜面

7、 制备单孢子悬浮液 分离出单菌落 斜 面 种 子（初筛）高产菌落 沙土管菌株 斜面种子 摇瓶复筛 生产试验 进一步选育或保藏 13 诱变育种步骤：出发菌株的选择；处理菌悬液的制备；诱变处理；中间培养；分离和筛选 A 出发菌种的选择：选择纯种（平均发酵单位要高，且发酵单位的波动幅度要小，摇瓶间所测得结果的最高值和最低值之差要小）;有良好的代谢特性;选择对诱变剂敏感的菌;株选用多个出发菌株进行诱变收效较快；选择单倍体细胞；选择单核或细胞核尽量少的细胞(真菌中多采用分生孢子或孢子囊孢子进行诱变，避免分离型表型延迟)B 单细胞悬液的制备：通常采用生理盐水。如果用化学诱变剂处理时，应采用相应的缓冲液配制

8、，以防处理过程中 pH 变化而影响诱变效果。高产纯菌株 而营养缺陷型的孢子则不能萌发。步骤：诱变处理后的孢子基本培养液（培养 10 h 左右）用灭菌的脱脂棉除去菌丝继续培养每隔 3-4 h 过滤一次，重复 3-4 次稀释涂皿分离。15.营养缺陷型菌株的检出方法：逐个检出法、夹层培养法、限量补充培养法和影印接种法 逐个检出法：诱变后的孢子或菌体富集培养涂布分离在完全培养基平板上培养待菌落孢子成熟后，用灭菌的牙签把孢子或菌体分别接到基本培养基和完全培养基平板上的相应位置同时培养然后观察对比菌落生长情况。如果基本培养基上不生长而完全培养基相应位置上生长的菌落为营养缺陷型。挑取孢子或菌体分别移接到基本

9、培养基和完全培养基斜面上，进一步复证 夹层法：先在培养皿底部倒入一层基本培养基倒入含有菌体细胞的基本培养基加第三层基本培养基培养平板上首先出现的菌落，为野生型菌落（在平皿底部做好颜色标记）加上第四层完全培养基经培养如果在基本培养基上不长而在完全培养基上生长的小型菌落，可能是营养缺陷型。限量补充培养法：如果试验的目的仅是检出营养缺陷型菌株，则其方法是将富集培养后的细胞接种到含有蛋白胨的基本培养基上，培养后，野生型细胞迅速地长成大菌落，在平皿底部作好颜色标记，而生长缓慢的小菌落可能是缺陷型，此称为限量培养;如果试验目的是要定向筛选某种特定的缺陷型，则可在基本培养基中加入某种单一的氨基酸、维生素或碱

10、基等物质，称为补充培养。补充这些物质的数量可根据已有缺陷型进行测定后加以确定。16 抗性突变株的分离:主要包括：抗药性突变株、抗噬菌体突变株、抗结构类似物突变株 为了简化初筛步骤，常用的方法：根据形态突变淘汰低产菌株。变色圈法：对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。生长圈法：通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。抑菌圈法:常用于抗生素产生菌的分离筛选 17 氨基酸生产菌的定向育种思路：切断或减弱支路代谢；解除自身的反馈抑制；增加前体物的合成；利用特殊调节机制；去除终产物 A 切断或减弱支路代谢实现方式：营养缺陷突变株的应用

11、、渗漏缺陷突变株 B 选育抗反馈调节突变株 优点：不受培养基成分的影响，生产较稳定;选育结构类似物抗性突变株，简单易得；易于保存而不易发生回复突变 方法一：选育结构类似物抗性突变株 机理：作为假反馈抑制剂，作为假反馈阻遏剂 影响突变率的因素：菌种遗传特性，菌种细胞壁结构，培养条件和环境条件 方法二：利用酶底物专一性宽的育种策略：则可利用该酶对其它底物的活性，选育代谢调节突变株。例：在添加了乙酰赖氨酸和过量精氨酸的戴维斯发酵培养基中，接种赖氨酸缺陷型（Lys-)菌株，经培养，从出现的生长菌落中能够获得精氨酸合成酶系的解阻遏突变株 C 增加前体物的积累 通过选育某些营养缺陷型或结构类似物杭性突变株

12、，增加目的产物的前体物的合成，有利于目的产物的大量积累。D 利用特殊调节机制育种：平衡合成、代谢互锁 平衡合成：一个产物阻遏酶，一个产物激活酶 代谢互锁：分支途径上游的某个酶受到另一条分支途径的终产物，甚至于本分支途径几乎不相关的代谢中间物的抑制或激活，使酶的活力受到调节，即为代谢互锁。这种作用只在高浓度下才发生，且此调节作用是部分的，不完全的 E 除去终产物：改变细胞膜通透性 18.原生质体具有的特性：对诱变剂敏感，对噬菌体不敏感，不受感受态影响 包括原生质体再生育种，原生质体诱变育种，原生质体转化育种，原生质体融合育种及其他原生质体育种 A 微生物原生质体再生育种：微生物制备原生质体后直接

13、再生，从再生菌落中分离筛选变异菌株，最终得到优良性状提高的正突变株。对数期细胞，不需要遗传标记 原生质体再生育种程序：出发菌株的选择，菌种活化和预培养，原生质体制备，原生质体再生，高产菌株分离，复筛，遗传稳定性检测，菌种特性及发酵特性研究 B 微生物原生质体融合育种：利用物理、化学或生物学方法，诱导遗传特性不同的两个亲本原生质体融合，经染色体交换、重组而达到杂交的目的，经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子。原生质体融合育种的特点：杂交率高、受接合型或致育型的限制小、遗传物质传递更为完整、存在着两株以上亲株同时参与融合形成融合子的可能、有可能采用产量性状较高的菌株作融合亲株、提高菌株产量的

14、潜力较大、有助于建立工业微生物转化体系 原生质体融合步骤：遗传标记亲株筛选，原生质体制备，原生质体融合，融合子再生，重组体检出与鉴定，重组体的形态、生理生化和遗传分析 原生质体的检出与分离：利用营养缺陷性标记选择融合体，抗药性，荧光染色，双亲对碳源利用不同，形态差异 19.培养基：微生物生长繁殖和生物合成代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。20.培养基成分 A 碳源：用于构成微生物细胞和代谢产物中碳元素的营养物质。作用：构成微生物细胞，合成代谢产物，提供能量 碳源种类：糖类：单糖：葡萄糖;双糖：蔗糖、乳糖、麦芽糖;多糖：淀粉、糊精。脂肪：豆油、玉米油、葵花籽油（耗氧大）。有机

15、酸、醇：乙醇（谷氨酸发酵），山梨醇（VC），甘油，碳氢化合物：正十六烷（谷氨酸发酵）。速效碳源（葡萄糖）：利用快，促进菌丝生长 迟效碳源（多糖、油脂）：粘度大，影响 DO，利用缓慢，利于产物合成 B 氮源：构成微生物细胞和代谢产物中氮元素的营养物质。作用：构成微生物细胞、合成代谢产物。氮源种类：无机氮源：(NH4)2SO4、NaNO3、NH4NO3、NH4Cl、氨水。有机氮源：黄豆饼粉、玉米浆、麸质粉、酵母粉、蛋白胨、牛肉膏、棉籽粉等。生理酸性物质：代谢后能产生酸性物质的营养成分。如：(NH4)2SO4、NH4Cl。生理碱性物质：代谢后能产生碱性物质的营养成分。如：（NaNO3、CH3COON

16、a）。C 无机盐及微量元素：硫、磷、铁、镁、钙、钴、钾、钠、锰 作用与浓度有关，低刺激，高抑制 磷：菌体核酸、核蛋白等细胞的组成成分，是许多辅酶和高能磷酸键的成分，氧化磷酸化反应的必需元素，（常用磷酸盐：KH2PO4、K2HPO4）调节作用，改变方向：初级代谢 次级代谢 铁：构成氧化酶元素，浓度影响明显 镁：激活酶，提高产生菌耐受性 钠：维持细胞渗透压 钾：影响细胞膜透性 钙：调节细胞通透性 锌、钴：某些酶的辅酶或激活剂 硫：组成菌体、产物。PKS 途径硫脂酶。D 前体;在产物的生物合成过程中，被菌体直接用于产物合成而自身结构无显著改变的物质。作用：明显提高产量，控制组分含量 E 水、消泡剂（

17、玉米油、泡敌、油脂乳化剂）、生长因子、促进剂、抑制剂 21 培养基种类：按组成：合成 M：研究用 复合 M：工业用 按用途;孢子培养基：制备孢子用。要求：有机氮源一般要低，无机盐浓度适量。如：琼脂斜面，大米培养基，麸皮培养基 种子培养基：孢子发芽，菌体生长用。要求：比较丰富，氮源偏高些，总浓度略稀，组成接近发酵培养基 发酵培养基：菌丝生长，产物合成用。要求：营养丰富，浓度粘度比适当，碳氮比适当 22.培养基配置原则：明确目的、营养元素的比例协调及浓度配比、物理化学条件适宜、经济节约 23 实验室中，牛肉膏蛋白胨培养基-培养细菌；高氏 1 号合成培养基-培养放线菌；麦芽汁培养基-培养酵母菌；查氏

18、合成培养基-培养霉菌。在工业生产中，尽量利用廉价且易于获得的原料 24、M 设计原则：M 成分的选择依据：必须满足菌体细胞生长、合成产物的元素需求；提供维持生长代谢的能量。a、菌体细胞的元素组成：C、H、O、N、S、P b、合成目的产物的元素组成：C、H、O、N、S 等。c、维持代谢：C、H、O。d、同时考虑工艺条件、生产设备的要求（菌浓和供氧）。M 设计与优化 a、提出基础配方，确定基本组成。b、确定各组分的最适配比：考查指标：菌浓、菌丝质量、产物量（效价）。优化方法：单因子试验法（单因素多水平）、正交设计（多因素多水平）、均匀设计 碳氮比：C/N 比偏小：（C 少 N 多）生长旺盛，C 不

19、足，易衰老，pH 偏高。C/N 比偏大：（C 多 N 少）生长缓慢，pH 偏低。C、N 均偏高：初级旺盛，影响次级。25、影响 M 质量因素：原材料质量、水质、灭菌 26、噬菌体污染的异常现象：pH 高、残糖高、OD 低、温度低、产量低 27、防治噬菌体对谷氨酸发酵的污染方法：使用抗性菌株；利用药物和净化环境等;其中采用菌株管理和环境净化为中心的综合措施是根本的防治办法 合理使用抗性菌株：对以前出现过的噬菌体都具有抗性、不是溶原性菌株具有与原菌株相当或更高的产量、不易发生回复突变 采用净化环境：定期检查噬菌体、严禁活菌体任意排放、杀灭环境中的噬菌体、28、谷氨酸发酵污染噬菌体后的挽救：并罐法、

20、菌种轮换或使用抗性菌株、放罐重消法、罐内灭噬菌体法 29 杂菌的污染与防治：发酵生产染菌的原因：空气质量差、设备出现渗漏、灭菌操作失误、接种操作失误、移种操作失误 30、染菌预防措施：A 空气净化：减少滤前空气的尘粒，减少滤前空气的油水含量，保证压缩空气的温度，妥善装填过滤介质，保持一定的气流速度，过滤介质使用高效滤材 B 培养基和设备的灭菌：合理调配培养基，保证灭菌温度和时间，保证设备无积污和渗漏，保证流动蒸汽质量，尽量减少泡沫，正确进行空气保压 31、常用灭菌方法：化学试剂灭菌、辐射灭菌、干热灭菌、介质过滤除菌、湿热 A 化学试剂灭菌：机理：蛋白质变性、酶失活、破坏细胞膜通透性。试剂;75

21、%酒精（擦手）、新洁尔灭（无菌室）、甲醛（环境、染菌罐）、高锰酸钾 B 辐射灭菌：主要有：UV、x 射线、射线。机理：高能量辐射杀灭。C 干热灭菌：机理：胞内跟温度有关的氧化反应速度快速增加 D 介质过滤除菌:微小孔径拦截 用于无菌空气过滤、纯净水 E 蒸汽灭菌：原理：蛋白质不可逆变性 32、培养基的灭菌方法：实验室：使用高压蒸汽灭菌锅、灭菌柜。工业：分批灭菌（实消）、连续灭菌（连消）A 实消：培养基在发酵罐内直接用蒸汽加热灭菌。普遍采用的实消条件：120 度，30min。特点：操作简便，时间长，营养成分有破坏，设备利用率低 操作过程：空罐准备：清洗，检修，打料；升温：把培养基加热到灭菌所需的

22、温度。保温维持：在灭菌温度下保持灭菌所需时间。冷却保压：把培养基的温度降低到接种的温度 B 连消：培养基经过一套灭菌设备连续加热灭菌，冷却后接入已灭菌的发酵罐内的工艺过程。过程：培养基 2030s 被加热到 130140，保温 5-8min，快速冷却(20s)，进入已灭菌的发酵罐。工业常用：连消塔、维持罐、喷淋冷却器组成的连消系统。特点：高温快速，营养成分破坏少，适合自动控制，罐利用率高，不适合粘度大固形物多的培养基，增加染菌几率，对蒸汽要求高。33、空气除菌方法：加热灭菌、静电灭菌、介质过滤除菌 34、无菌检查：依据：无菌试验、镜检、生化指标 无菌试验：肉汤一支+斜面两支，37 度培养。染菌

23、判断：连续 3 个时间的肉汤或连续 3 个时间的斜面菌型一样，则确定为染菌。染菌率=染菌批数/总进罐批数100%。例：某月放罐 16 批，染 1 批，重消 4 批，其中 1 批是染菌重消，计算当月染菌率。解：染菌率=染菌批数/总进罐批数100%=（1+1）/（16+4）100%35、染菌处理：A 种子罐染菌：停止培养，及时蒸汽灭菌，放下水道 B 发酵罐染菌：前期染：蒸汽灭菌，放下水道。中后期染：降温培养，控制补料量。若染后效价不增长，立即放过滤提取 C 设备处理：煮罐，甲醛空消 D 染噬菌体处理：蒸汽灭菌后放掉，筛选抗噬菌体菌种 例题：某发酵罐于 8h 染球菌，下一批进罐前应做哪些工作（包括原

24、因分析及措施）一、染菌原因分析：时间：8h，属于发酵前期，可能为：种子带菌、空气系统、培养基灭菌不彻底，设备泄漏。菌型：球菌，多为空气系统出问题。“培养基灭菌不彻底”应染芽孢杆菌，可排除；设备泄漏菌型杂乱，可能性小。检查种子移出时的无菌情况，判断是否为“种子带菌”。可能原因：发酵/种子的空气系统可能存在问题。二、措施：检查发酵、种子的空气系统，重点为精滤芯，重消，发酵罐空消，检查罐体密闭性，检查一阀，清理罐内死角。36、发酵生产工艺流程;：菌种，斜面培养，摇瓶种子制备，种子罐培养，发酵罐培养，发酵液 37、种子制备：孢子制备（斜面培养，固 M），种子制备(摇瓶种子培养，液 M)孢子质量影响因素

25、：培养基、培养温度及湿度、培养时间和接种量。生产/保藏用孢子 M：比较单一氮源。选种、分离：复杂有机氮源 丝状菌斜面生长五阶段：基质菌丝生长、气生菌丝生长、孢子形成、孢子成熟、衰老自溶 38 菌种冷冻保藏：选择量多的孢子成熟阶段。过于年轻的孢子：经不起冷藏；过老：白色斑点（发芽/第二代菌丝）、发黑（自溶）冷藏时间：宜短不宜长 39 菌种保藏的目的：保持生产性能稳定，不污染杂菌，不死亡 方法：A 定期移植法（斜面）：4冰箱，保存期 3-6 个月，适用于细菌或酵母 B 液体石蜡法：适于霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等，对霉菌和酵母菌的效果较好，可保存 5-7 年。对厌氧性细菌的效果差。C 米孢子

26、法：密封，4冰箱 3-6 个月；真空抽干后密封，保藏 6-12 个月，适用于霉菌的保藏 D 沙土管法：适用于霉菌、放线菌和形成芽孢的细菌的保藏。E 超低温冰箱冻结法（冷冻甘油管）：悬浮于灭菌的 10-20%甘油，超低温冰箱（-80）1-2 年，适用于所有微生物。，F 真空冷冻干燥法（冻干管）：4冰箱，保存3-5 年。适用于一切微生物 G 液氮超低冷冻法：保存5-10 年，（-130以下，微生物代谢活动停止），适用于所有微生物、动物和植物细胞的保存。40、菌种保藏注意事项：保藏前：要用新鲜斜面，孢子处于成熟阶段，生长丰满。保藏用基：防灭菌时过度加热形成有毒物质。减少操作对细胞的损害:要求速冻。4

27、1、氧的作用：细胞组成、产物构成、能量代谢必需 42 微生物对氧的需求可用两个物理量表示：摄氧率（）和呼吸强度（QO2）摄氧率（）：单位体积培养液每小时消耗的氧量。mmol（O2）/Lh 呼吸强度（QO2）：单位重量的干菌体每小时消耗的氧量。mmol（O2）/gh 关系式：=QO2 X （X：g 干菌体/L 培养液）43 CL（溶解氧浓度），mmol/L。C临界（临界氧浓度）。44、影响微生物呼吸临界氧浓度的主要因素：微生物的种类与培养温度、微生物的生长阶段 45.、溶解氧饱和浓度 C*（mmol/L）：若外界条件如温度、压力等不再变化，氧气在液体中的浓度就不再变化，此时的浓度即为该条件下在该

28、溶液中的溶解氧的饱和浓度 46 影响氧饱和浓度的因素：A 温度：随温度升高而下降 B 溶液的性质：溶质含量越高，氧的溶解度越小 C 氧分压：压力越高，氧溶解度越大 47、影响微生物需氧量的因素：A 微生物种类和生长阶段：微生物细胞结构越简单，单位时间内消耗的氧就越多 生长期合成期 （培养液的摄氧率达最高值时，菌浓也最大）B 培养基的组成：M 中 C 源多、中间补糖量大，耗氧多。C 溶解氧浓度：CL高于 C临界，才不影响代谢。D 培养条件：温度越高，营养成分越丰富，耗氧越大 E 二氧化碳浓度的影响：CO2溶解度是 O2的 30 倍，发酵过程中必须及时除去 48、氧传递的过程：空气 O2 溶于水

29、菌体细胞表面 扩散至胞内 参与代谢中的氧化反应 49 氧传递的阻力：气膜阻力（1/K1）；气液界面阻力（1/K2）液膜阻力（1/K3）；液流阻力（1/K4）；菌丝团周围液膜阻力（1/K5）；菌丝丛或菌丝团内的扩散阻力（1/K6）；细胞膜的阻力（1/K7）：细胞呼吸酶与氧反应阻力（1/K8）50 影响阻力的因素：空气 1/K1、1/K2 发酵液浓度成分 1/K3、1/K4、1/K5 微生物种类生理状态 1/K6、1/K7、1/K8。供氧方面的液膜阻力（1/K3）是氧溶于水时的限制因素 51、减少阻力的方法：A 良好的搅拌使气泡和液体充分混合而产生湍流，加速氧的传递 B 在搅拌和合理的工艺条件下，

30、结团减少,可增加融氧 C 代谢产物及时移去 52、氧传递公式-双膜理论：53.影响供氧的因素：Kla 和(C*-CL)A 增加氧传递推动力(C*-CL)就必须设法提高 C*，或降低 CL（不可取）提高 C*的方法：降低发酵的培养温度，增加氧的分压（可以通过提高发酵罐的罐压或向发酵罐中通入纯氧气），改变发酵液性质，降低发酵粘度，降低 CL 不可取的原因：实际发酵生产中，溶解氧已经接近临界值，如果在降低，就会影响菌体的正常呼吸，造成菌体缺氧，给生产造成不利影响 B 影响 Kla 的因素：搅拌功率，空气流速，发酵液理化性质 a 搅拌功率对 Kla 的影响：使发酵罐内的温度和营养物质浓度达到均一使组成

31、发酵液的三相系统冲分混合；把引入发酵液中的空气分散成小气泡，增加了气液之间的传质面积，提高 Kla 值；增加发酵液的湍流程度，降低气泡周围的液膜厚度和流体扩散阻力，从而提高氧的传递速率；减少菌丝结团，降低菌丝丛内扩散阻力和菌丝丛周围的液膜阻力；可延长空气气泡在发酵罐中的停留时间，增加氧的溶解量。（当流体处于湍流状态时，单位体积发酵液所消耗的搅拌功率才能作为衡量搅拌程度的可靠指标）b 空气流速对 Kla 的影响：Kla 随空气的流速增加而增加。但是空气流速过大，会出现“气泛”现象（正常条件下，随空气流速增加，搅拌功率下降，当增加到 某一值时，搅拌功率不再下降，此时出现“气泛”现象）；空气流速/流

32、量过小：CO2 不能及时带走 无圆盘的搅拌器或桨叶搅拌器容易产生气泛现象。要提高发酵罐的供氧能力，采用提高搅拌功率，适当降低空气流速，是一种有效方法 c 发酵液的理化性质对Kla 的影响：Kla与发酵液粘度成反比 54 发酵工艺的控制：目的：产生菌充分表达生产能力-高产高纯。步骤：A 确定能反映过程变化的各种理化参数及及检测方法 B 研究这些参数的变化对发酵生产水平的影响极其机制，获取最适水平或最佳范围 C 建立数学模型定量描述各参数之间随时间变化的关系 D 通过计算机实施在线自动监测和控制，验证各种控制模型的可行性及其适用范围，实现发酵过程最优控制。55 发酵过程的主要控制参数：A 物理参数

33、：温度（影响酶活、DO、生长合成速率）、罐压、搅拌功率、转速 空气流量、粘度、浊度 B 化学参数：PH（产酸碱的综合结果，重要参数之一）、基质浓度（发酵液中糖、KLa:液相体积氧传递系数,代表氧气由气相传递到液相的难易 N：传氧速率，mmol O2/h；C*：饱和溶氧浓度，mmol O2/L；CL：溶氧浓度，mmol O2/L；氮、磷等重要物质的浓度）、DO、氧化还原电位、产物浓度、排气二氧化碳浓度 C 生物参数：菌丝形态（判断种子质量，发酵终点）、菌体浓度（其变化反应为生长曲线，影响 DO，用于动力学研究）菌丝形态检测方法：摄像显微镜、取样镜检 菌体浓度：干重、湿重、浊度、活菌计数、离心沉降

34、 56 引起发酵液 PH 下降的原因：A 碳氮比过高，或中间补糖 过多，溶氧不足，致使有机酸积累 B 消泡剂加的过多，脂肪酸增加 C 生理酸性盐的利用 D 酸性产物形成 引起 PH 上升的原因：A 碳氮比过低 B 生理碱性盐的作用 C 碱性产物形成 D 中间补料中氨水或尿素等碱性物质加入过多。二：啤酒发酵：1 酒定义：凡是含酒精的饮品 分类：蒸馏酒、酿造酒、配制酒 2 啤酒的度数是麦芽汁浓度 3 按成品是否经过杀菌分为鲜啤酒（未经巴氏杀菌）、熟啤酒（杀菌）、纯生啤酒（经过过滤等方法进行无菌过滤，而不经巴氏杀菌）4 如何鉴别啤酒的优劣：一看：酒体色泽：普通浅色啤酒应该是淡黄色或金黄色，黑啤酒为红

35、棕色或淡褐色。透明度：清亮透明，无悬浮物或沉淀物。泡沫：啤酒注入无油腻的玻璃杯中时，泡沫应迅速升起，细腻、洁白，高度占杯子的 1/3，温度 8-15时，5 分钟内不消失。二闻：有明显的酒花香气，新鲜、无老化气味及生酒花气味；黑啤酒还应有麦芽的香气。三尝：入口纯正，无酵母味或其他怪味杂味；口感清爽、协调、柔和，苦味会迅速消失，无明显的涩味；有二氧化碳的刺激，使人感到杀口。5 麦芽制备：制麦：由原料大麦制成麦芽 制麦过程：大体可分为原料清选分级、浸麦、发芽、干燥、除根等过程 麦芽制造目的：A 通过发酵过程使大麦中固有的酶活化，并产生各种类型的酶 B 在发芽过程中，由于酶的作用，使大麦胚乳中储存的物

36、质进行适度分解 C 通过绿麦芽的干燥，除去麦芽中多余的水和生腥味，产生香味。6 麦芽制造的工艺过程：原料大麦-粗选机-分级机-精选大麦-浸麦槽-发芽箱-绿麦芽-干燥炉-除根机-成品 7 大麦清选的操作：A 筛析（除去粗大和细碎夹杂物）B 震析（震散泥块，提高筛选效果）C 风析（除灰尘和轻微杂质）D 磁吸（除去铁质等磁性物质）E 滚打（除麦芒和泥块）F 洞埋（利用筛选机中孔洞，分出圆粒半粒杂质）8 大麦浸渍的目的：A 提供大麦发芽所需的水分B 可充分洗涤、除尘、除菌C 在浸麦水中适当添加石灰乳、甲醛等可杀菌。加速酚类、谷皮酸等有害物质的浸出 9 浸麦的理论及影响因素：A 大麦的休眠和水敏感性B

37、大麦的吸水速度：与麦粒大小有关，麦粒越小，吸水越快；与温度有关，温度高吸水快 C 与大麦品种有关D 通风与吸氧 E 浸麦用水及添加剂，浸麦耗水量为大麦的 3-9 倍 10 浸麦方法：湿浸法、间歇浸麦法（洗麦、加石灰、去浮麦、浸渍）、喷雾浸麦法 11 大麦发芽的目的：使麦粒生成大量的各种酶类，并使麦粒中一部分非活化酶得到活化增长。-淀粉酶作用于直链淀粉，产物为短链糊精、麦芽糖和葡萄糖。-淀粉酶作用于淀粉分子的非还原性末端，依次地水解一分子麦芽糖 12 啤酒厂常用的发芽方式有：地板式、通风箱式和连续式三种。13 影响发芽的因素：温度、水分，通风量 14 浸麦水中加碱作用：碱性水浸麦可以溶出谷皮中部

38、分多酚物质。NaOH 可以吸收 CO2，从而加速浸麦过程呼吸作用。碱性水可抑制微生物，用石灰水还有杀菌功效 15 绿麦芽的干燥过程分为排潮和干燥二个阶段。16 麦芽质量的测定；A 感官特征优质浅色麦芽具淡黄色而具有光泽感，劣质麦芽外观发暗，有霉味及酸味 B 物理检验：切断实验：取麦芽样品 200 粒，检验胚乳状况，玻璃质粒越少越好；叶芽长度：越均匀越好 C 化学检验 17 麦汁制造：是将固态的麦芽、非发芽谷物、酒花用水调制加工成澄清透明的麦芽汁的过程。原麦汁浓度：100g 麦汁中含有的浸出物的克数 麦汁制造过程：原料的粉碎，原料的糊化、糖化，糖化液的过滤，混合麦汁加酒花煮沸，麦汁处理一澄清、冷

39、却、通氧等一系列物理学、化学、生物化学的加工过程。18 麦芽汁生产工艺流程：麦芽磁选粉碎 并醪 酒花 大米磁选粉碎蒸煮糖化过滤煮沸冷却回旋沉淀发酵过滤装瓶杀菌包装入庫 19 麦芽粉碎的方法：干法粉碎、回潮粉碎、湿法粉碎、连续浸渍湿式粉碎 粉碎要求：A 麦芽性质对粉碎度的要求：溶解良好的麦芽，可粉碎得粗一些。溶解不良的麦芽，应适当细一些B 糖化对麦芽粉碎的要求：浸出糖化法：麦芽的粉碎度应大一些；长时间煮出糖化法：粉碎度要不严,可粗些。高温短时糖化法：应小些 C 过滤对麦芽粉碎度的要求：过滤槽法：皮壳完整，以粗、细粒为主，粉和微粉比例适当小些。压滤机过滤：对粉碎的要求低。麦芽粉碎可细些。20 糖化

40、：通过麦芽中各种水解酶类作用，将麦芽和辅料中淀粉、蛋白质等不溶性高分子物质逐渐分解成糖类、糊精、氨基酸、肽等可溶性低分子物质并溶解于水的过程。浸出物：溶解于水的各种干物质 麦芽汁：糖化构成的澄清溶液 无水浸出率：麦芽汁中浸出物含量和原料中干物质之比 21 糖化方法：煮出糖化法（一次、二次、三次煮出）、浸出糖化法、复式糖化法、外加酶制剂糖化法 煮出糖化：麦芽醪利用酶的生化作用和热力的物理作用，使其有效成分分解和溶解，通过部分麦芽醪的热煮沸、并醪，使醪逐步梯级升温至糖化结束。浸出糖化：麦芽醪纯粹利用其酶的生化作用，用不断的加热或冷却调节醪的温度，使得糖化完成。麦芽醪未经煮沸。复式糖化法：采用不发芽

41、的谷物（如大米、玉米、玉米淀粉等），在进行糖化时必须对首先添加的辅料进行预处理糊化，液化（即对辅料醪进行酶分解和煮出）。22 糖化过程中几个主要控制点：酸休止、蛋白质休止、糖化休止、过滤温度 23 麦芽醪的过滤：将水溶性的浸出物麦汁（溶于水的浸出物）和非水溶性物质麦糟（残留的皮壳、高分子蛋白质、纤维素、脂肪等）分离的过程 24 麦芽醪过滤过程：三个过程（1）残留在糖化醪仅剩的耐热性的淀粉酶进一步作用，提高原料浸出物收得率。（2）从麦芽醪中分离出“头号麦汁”。（3）用热水洗涤麦槽，洗涤吸附于麦槽的可溶性浸出物，得“二滤、三滤麦汁”。25 麦汁过滤的方法：过滤槽法、压滤机法 过滤设备：过滤槽、板框

42、式压滤机、袋式麦汁压滤机、膜式压滤机、快速渗出槽 26 麦汁煮沸的目的:A 蒸发水分，浓缩麦汁 B 使酶变性钝化，热杀菌 C 蛋白质变性和絮凝（使高分子蛋白质变性和凝固析出，提高啤酒的非生物稳定性。）D 酒花有效组分的浸出（赋予麦汁独特的苦味和香味，提高麦汁的生物和非生物稳定性）E 排除麦汁中特异的异杂臭气 F 降低 PH 值 G 还原物质的形成，并给啤酒带来香气 27 煮沸方法：A 传统煮沸法：间歇常压法 B 新式煮沸方法：加压煮沸法、体外煮沸法 28 酒花的添加 酒花的作用：酒花能赋于啤酒柔和优美的芳香和爽口的微苦味，增加啤酒的防腐能力，加速麦汁中高分子蛋白质的絮凝，提高啤酒泡沫起泡性和泡

43、持性，增加麦汁和啤酒的生物稳定性。酒花的主要成分：多酚物质、酒花精油、酒花苦味物质:：添加方法：（1）苦型花和香型花并用时，先加苦型花、后加香型花。(2)使用同种酒花，先加陈酒花，后加新酒花。(3)分批加入酒花，本着先少后多的原则 29 麦汁处理过程：酒花分离，热凝固物分离、冷凝固物分离、冷却、充氧 30 热凝固物分离方法：回旋沉槽、离心机或硅藻土过滤法分离 热凝固物的副作用：不利于麦汁的澄清。发酵过程中热凝固物会吸附大量的酵母，使发酵不正常。3、热凝固物在发酵中被分散，影响啤酒的非生物稳定性和口味 31 冷凝固物分离方法：酵母繁殖槽法、冷静置沉降法、硅藻土过滤法、离心分离法、浮选法 冷凝固物

44、的副作用：冷凝固物会吸附在酵细胞壁上，妨碍细胞壁的渗透作用，使发酵不正常；造成啤酒冷混浊 32 发酵度：发酵中麦汁的浸出物浓度下降的百分率 啤酒中风味物质;高级醇、挥发酯、醛类、酸类、双乙酰、含硫化合物 33 高级醇与产品质量的关系 戊醇和苯乙醇结合在一起，对啤酒风味影响大，而与醋酸乙酯、醋酸异戊酯等结合在一起则为酒香的主要成分；异戊醇含量高时，饮后易头痛。正丙醇过高时，有不良风味。苯乙醇高时，产生玫瑰花香味。酪醇、色醇高时，产生后苦味 34 啤酒发酵方法：A 分批式发酵、传统发酵、大罐式发酵：单罐发酵,多罐发酵 B 连续发酵 C 固定菌体式发酵：分批式、连续式 35 发酵工艺技术控制内容：菌

45、株选择；麦汁组分；接种量和接种技术；起酵速度和发酵温度；发酵设备及发酵状态；后酵条件；酵母分离；贮酒条件和时间；发酵压力与二氧化碳浓度。36 传统分批发酵经过添加酵母、前发酵、主发酵、后发酵和贮酒等阶段。主发酵的现象;起泡、高泡期、落泡期、泡改形成期。后发酵的目的：残糖继续发酵、促进啤酒风味成熟、增加 CO2 的溶解量、促进啤酒的澄清 37CO2 含量高与啤酒质量的关系：防杂菌；降低了 pH 促进酒花树脂析出使口味更趋柔和、清爽；增强杀口力；促泡沫形成的均匀与稳定；可防酒的氧化，延长保存期 38、发酵方法分类:：（国内多用单罐发酵）单酿罐发酵：前发酵、主发酵、后发酵、贮酒全在一个罐中 两罐发酵

46、：前发酵、主发酵在发酵罐，后发酵和贮酒在贮酒罐 前、主、后发酵在发酵罐，贮酒在另一罐 39 大麦造啤酒原因：大麦富含淀粉，发芽后可产生大量的水解酶类；大麦种植遍及全球；大麦的成分适合酿造啤酒；其皮渣有利过滤；大麦是非人类食用主粮 40 大麦的质量标准：A 色泽：淡黄 B 气味：新鲜稻草香味 C 谷皮：皮薄，有细密纹道 D 麦粒形态：短胖者为佳 41 辅料：大米、玉米、蔗糖等。使用辅料的作用：A 降低成本 B 降低总氮、多酚、提高啤酒的非生物稳定性，降低啤酒色度 C 增加淀粉、糖、提高发酵度 D 提供糖蛋白，改善泡沫性能。42 酒花的成分及作用：A 苦味物质：赋予啤酒特有的苦味，防腐，改善泡持性

47、，抑制麦芽生长 B 酒花油：赋予香味 C 多酚物质：具有澄清麦汁和赋予啤酒醇厚酒体的作用 43-酸：衡量啤酒花质量优劣的重要指标之一，异-酸-苦味物质主要来源 44 多酚的作用:(1)在麦汁煮沸时和蛋白质形成热凝固物。(2)麦汁冷却时形成冷凝固物。(3)在后酵和贮酒直至灌瓶以后，缓慢和蛋白质结合，形成汽雾浊及永久混浊物。(4)在麦汁和啤酒中形成色泽物质和涩味。(5)氧化形成红棕色化合物，影响啤酒色泽(6)结合铁盐，加深颜色 45 啤酒生产工艺流程：A 制麦：大麦粗选精选浸麦发芽-绿麦芽烘干除根成品麦芽 B 糖化：麦芽及辅料粉碎糊化、糖化过滤煮沸冷却冷麦汁 C 发酵：冷麦汁加水-进行主发酵，加酒花进入后发酵 D 后处理：过滤，罐装