16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程4984.pdf

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1、 16SrDNA 鉴定菌株的标准操作规程 1.适用范围 本标准规定了通过特定引物对细菌的 16SrDNA 片段进行 PCR 扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。2.方法和原理 16SrDNA 鉴定是指用利用细菌 16SrDNA 序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA 提取、16SrDNA 特异引物 PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。细菌 rRNA（核糖体 RNA）按沉降系数分为 3 种，分别为 5S、16S 和 23S

2、rRNA。16S rDNA 是细菌染色体上编码 16S rRNA 相对应的 DNA 序列。16S rDNA 由于大小适中，约 1.5Kb 左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。在 16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将 16S rDNA 片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前 500bp 序列即可鉴别出细菌的菌属

3、。针对科学论文发表或是前 500bp 无法鉴别的情况，需要进行 16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的 16SrDNA 的序列信息。由于测序仪一次反应最多只能测出 700bp 的有效序列，为了结果的可靠性，通常将 16SrDNA 全长序列分成 3 部分进行测序。16SrDNA 27F 519R 357F1/9 926F 3 对引物正反向测通后，拼接成 1500bp 1115R 1492R 16SrDNA 序列。左右的 设备和材料 3.器材 1.1；Eppendorf MixMate100L、10L）；涡旋振荡器；L 移液器（1000L、200、Veriti 96 Well Therm

4、al 仪：离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCRAB3130、凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪：AB3500Cycler；试剂 1.2 Taq Taq 试剂：酶，10DNA 快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖；PCR2+，ExoSAP-IT；测序试剂：BigDye Terminator，ddHO 等；Buffer(MgdNTPs)，2；BigDye XTerminator Purification Kit5Sequencing Buffer；耗材 1.3TM Optical L；Micro Amp200200、L、10L；离心管：1.5mL、移液

5、器吸头：1000LTM Optical Adhesive Film；Micro Amp96-Well Reaction Plate；1.4 引物 扩增长度 序列 16SrDNA 名称 5-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3 正向引物 27F 左右 500 bp 部分第 1 5-GWA TTA CCG CGG CKG CTG-3 反向引物 519R 5-CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3 正向引物 357F 左右 部分第 2750bp5-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3 反向引物 1115R 2/9 5-AAA CTY AAA KGA A

6、TT GAC GG-3 正向引物 926F 560 bp 第 3 部分左右 5-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3 反向引物 1492R ,S=G:C.W=A:T;all 1:1 M=C:A,Y=C:T.K=G:T,R=A:G 其中 操作流程 4.核酸提取 产物纯化基因扩增 序列比对测序反应 5.实验方法 核酸提取：1.5 涡旋震荡混匀 LPrepMan Ultra 的离心管中，挑取单菌落，然后置于装有 10010min 后，以离心机最大转速离心 3min，取 10L10030s 左右，然后水浴上清液与 490L ddHO（即稀释 50 倍），混匀作为下步 PCR

7、的模板 DNA。提取2的 DNA 于-20保存。1.6 基因扩增 1.6.1 PCR 反应体系 板使用量。进行反应，这种冷启动法可增强 试剂 使用量（25L 体系）模板 DNA 2L（10ng100ng）)LTaq 酶(5U/0.2L 2+Taq Buffer(Mg10)2.5L 2.5mM)各 dNTPs(2L M)引物 F(1 5L M)引物 R(1 5L O ddH2 8.3L 备注：DNA 模板量通常在 100 ng 以下，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的 DNA 模 PCR 反应体系应在冰中配置，然后置于冰箱中冷却 35min，最后放于 PCR 仪上 PCR 扩增的特异性。3/9 1

8、.6.2 PCR 反应条件 94：10min 94：30s 58：30s 30Cyc 45s：72 5min 72：4：1.6.3 电泳加热融化，待温度降至 60 称取1g 琼脂糖置于 100mL TAE 电泳缓冲液中，100VPCR 反应结束后，加样，以左右时，均匀铺板，制成 1%的琼脂糖凝胶。电压进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后，染色，用凝胶成像仪观察，拍照，记录 实验结果。产物纯化 1.7 试剂，混匀。5LPCR 产物加入 2L ExoSAP-IT 每 1.7.1 15min15min,80温育。1.7.2 放入 PCR 仪中，37温育 纯化后的 PCR 产物做为下一步测序反应的模板。1.

9、7.3 测序反应 1.8 测序反应体系 1.8.1 试剂 10 使用量（L 体系）DNA 模板 1L M)(1 引物 1.6L BigDye Terminator 1L Sequencing Buffer 5 1L 4/9 ddHO 2 L5.4 测序反应条件 1.8.22min9630s：9615s 55：30Cyc 60：4min 4：(BigDye XTerminator Purification Kit)测序反应纯化 1.8.3 BigDye XTerminator Solution。和 6L5.4.3.1 每管加入 27L SAM Solution。2000rpm 震荡 30min

10、放在 5.4.3.2Eppendorf MixMate 上。g离心 2min5.4.3.3 在离心机上以 1000 孔板中，放入测序仪中测序。上清液于965.4.3.4 每管吸取 10L 序列比对 1.9 微生物鉴定系统中进行比对，得 MicroSEQ 基因测序仪得到的测序结果，在 到菌种的种属信息。关键说明 6.时，对于细胞壁比较薄的革兰氏阴性细菌，可挑提取细菌基因组 DNA1.1 后，10minO L ddH 中，混匀，沸水热变性取一菌环菌株，置于 1002确认 PCR模板。必要时做梯度 503min 分离，稀释倍后做为 PCR 离心 最佳的模板量。及测序反应时，为了保证酶的活性，整个体系

11、应在冰中配置；然后 PCR1.2 这种冷启仪上进行反应，最后放于 35min，PCR 置于低温冰箱中冷却 扩增的特异性。动法可增强 PCR 包含有丰富的细菌种属的特异序列变化较大，500bp1.3 16SrDNA 序列的前 500bp 性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前无法鉴序列即可鉴别出细菌的菌属。针对科学论文发表或是前500bp的全序列扩增和测序，得到较为全面的别的情况，需要进行16SrDNA5/9 16SrDNA 的序列信息。具体参照附录。或出现非特异性条带的原因：一是引物与靶序列不完全互补、PCR 离子浓度过高、退火温度过低，及引物聚合形成二聚体。二是 Mg2+往往

12、一些来源的酶易出循环次数过多有关。其次是酶的质和量，PCR 则不出现，酶量过多有时也会出现非现非特异条带而另一来源的酶 物。减低酶量或调换另特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 数。适当一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 左右退火与延伸)。提高退火温度或采用二温度点法(93变性，65 其原因往往由于酶量扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。PCR 浓度过高，退火温度过浓度过高，Mg2+差，过多或酶的质量 dNTP或调换另一来源的酶。其对策有：减少酶量，低，循环次数过多引起。度。增加模板量，减少循环 Mg2+浓的浓度。适当降低减少 dNTP 次数。污染。RT 阴性对照检测是否被

13、基因组 DNA 用模板浓度过高 10ul 体系 100ngDNA6/9 附录（资料性附录）结果电泳图三部分的 PCR1.细菌 16SrDNA 2000b 1000b 750b 500b 250b 100bp M：DL2000；1：引物 27F 和 519R 的 PCR 产物（第 1 部分 500bp）2：引物 357F 和 1115R 的 PCR 产物（第 2 部分 750bp）3：引物 926F 和 1492R 的 PCR 产物（第 3 部分 560bp）7/9 2.细菌 16SrDNA 鉴定结果 1.1 即可反映细菌的种属信息：500bp16SrDNA 前菌株 TL140924 的鉴定结果 8/9 .1.2 16SrDNA 前 500bp 不足以反映细菌的种属信息：菌株 70528 的鉴定结果 1.3 16SrDNA 的全序列信息：菌株 70528 的鉴定结果 如附录 2.2、2.3 所示，当待测菌株的 16SrDNA 前 500bp 序列不足以将待测菌株与库中菌株区分时，则需要测其 16SrDNA 全长序列以将其区分。9/9