肝组织中核酸的分离和核酸组分的鉴定19480.pdf

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1、肝组织中核酸的分离和核酸组分的鉴定 原理 动物肝组织中的核蛋白可用水提取，用酚破坏核酸与蛋白质之间的结合键，再用乙醚抽提除去蛋白质及其杂质，最后用乙醇沉淀核酸。核酸（DNA 和 RNA）可被酸水解成磷酸、有机碱（嘌呤碱和嘧啶碱）以及戊糖（核糖和脱氧核糖）。它们分别可用下列方法鉴定：1 磷酸的鉴定：磷酸能与钼酸试剂作用生成磷钼酸，后者在还原剂氨基萘酚磺酸钠的作用下还原成蓝色的钼蓝。H3PO4+12H2MoO4 H3PO412MoO312H2O 磷酸 钼酸 磷钼酸 6H+H3PO412MoO312H2O H3PO46MoO33MoO512H2O+3H2O 磷钼酸 钼蓝 2嘌呤碱的鉴定：嘌呤碱能与苦

2、味酸作用形成针状结晶。3核糖的鉴定：核糖与强酸共热生成糠醛，后者与苔黑酚（3,5,-二羟甲苯，orcinol）反应，缩合成绿色化合物。4 脱氧核糖的鉴定 脱氧核糖在强酸中加热可生成-羟基-酮基戊醛，后者与二苯胺作用生成蓝色化合物。还原剂 OH CH3 HO H O O C OH H3C O CH3 O C 糠醛 3,5-二羟甲苯 绿色化合物+OH OH H H HOC COH HCH CC H 核糖 O 浓硫酸 H O O C+3H2O 糠醛 H 试剂（一）90%苯酚溶液。（二）乙醚。（三）95%乙醇。（四）5%硫酸（五）钼酸试剂 钼酸铵 5g 溶于 100ml 蒸馏水中，再加入浓硫酸 15m

3、l，冷却后加蒸馏水至 1000ml。冷处保存（一个月内稳定）。（六）氨基萘酚磺酸钠溶液 1,2,4-氨基萘酚磺酸钠 0.5g 溶于 195ml 15%亚硫酸氢钠与5ml 20%亚硫酸钠溶液中，加塞振摇助溶。贮存于棕色瓶中，冰箱保存（可用 4 周）用时取上清液。（七）饱和苦味酸溶液 苦味酸约 1.3g 溶于 100ml 蒸馏水中，静置过夜。临用前取上清液。（八）Bial 试剂 苔黑酚 1.5g 加入浓盐酸 500ml 中，再加 10%氯化高铁 2030 滴。临用前配制，冰箱保存。（九）二苯胺试剂 取二苯胺 1g 溶于 100ml 冰醋酸中，加入浓硫酸 2.75ml，临用前配制，贮于棕色瓶中。主要

4、器材（一）离心机 CH2 CHO CH2 C=O CH2OH N H-羟基-酮基戊醛 二苯胺 蓝色化合物+CH2 CHO CHOH CHOH CH2OH CH2 CHO CH2 C=O CH2OH+H2O 强酸 脱氧核糖 -羟基-酮基戊醛 （二）沸水浴（三）研钵 操作步骤（一）肝组织中核酸的提取：按以下流程操作：肝脏（约 1g，置研钵中）加少量净沙研磨至糊状 加蒸馏水 3ml，研磨 3min 加 90%苯酚 5ml，研磨 10 min（移入玻璃小试管）离心 5min（3000r/min，）上层液（移至塑料小试管）下层液 加乙醚 2ml，试管口覆盖聚乙烯膜、用拇指将管口 按住，用力振摇 1-2

5、min（或用玻棒搅拌）离心 5min（3000r/min）上清液 中层液 下层液（全部移至塑料小试管）加 95%乙醇 2ml（用玻棒搅拌约 2 min）离心 3min（3000r/min）上清液 沉淀 加 5%H2SO44ml（二）核酸水解：（移至玻璃大试管）置沸水浴 15min 核酸水解液（三）核酸组分的鉴定 核酸水解液用流水冷却后进行定性鉴定。1 磷酸的鉴定：试管 2 支、标号，按表 5 操作：表 5 试 剂（滴）测定管 对照管 核酸水解液 10 5%硫酸 10 钼酸试剂 5 5 氨基萘酚磺酸钠溶液 4 4 摇匀，置沸水浴中 23 分钟，观察两管颜色变化。2嘌呤碱的鉴定：试管 1 支，加入

6、饱和苦味酸约 2ml，再加入核酸水解液 46 滴，摇匀，静止室温中，观察有无针状结晶出现。3核糖的鉴定：试管 2 支、标号，按表 6 操作：表 6 试 剂（滴）测定管 对照管 核酸水解液 6 5%硫酸 6 Bial 试剂 9 9 摇匀，置沸水浴中 5 分钟后观察两管颜色变化。4脱氧核糖的鉴定：试管 2 支、标号，按表 7 操作：表 7 试 剂（滴）测定管 对照管 核酸水解液 20 5%硫酸 20 二苯胺试剂 40 40 摇匀，置沸水浴中 15 分钟后观察两管颜色变化。结果 记录上述各管实验结果，并加以解释。注意事项 1用新鲜肝组织（可取自小鼠、兔和猪等）制备肝匀浆时，必须充分研磨肝组织。2苯酚有腐蚀性，切勿与皮肤接触，注意安全。3该实验为定性实验，需记录实验结果并加以解释。4正确使用离心机（掌握离心过程中离心管的对称和平衡）。5为充分利用时间，可先做脱氧核糖鉴定的实验，若延长沸水浴中的反应时间，其结果更明显。