CAT酶活性测定11838.pdf

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1、 植物组织中过氧化氢酶的活性测定紫外吸收法【原理】H2O2在 240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。【仪器与用具】紫外分光光度计；冷冻离心机；研钵；容量瓶；刻度吸管；恒温水浴；分析天平【试剂】1.0.05mol/L pH7.0 磷酸缓冲液 2.0.2mol/L H2O2溶液：30%H2O2 11.36ml 溶于磷酸缓冲液中，定量至 250ml。3.0.05 mol/LTris-Hcl 缓冲液（pH7.0）【材料】正常生长或经逆境处理的新鲜植物组织【方法步骤】1.酶液提取：称取剪碎混匀

2、的植物样品（如叶片等）1.00g 置与预冷的研钵中，加入适量预冷的 pH7.0 磷酸缓冲液和少量石英砂冰浴研磨成匀浆后，转入 10ml 容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到 10ml。取提取液 5ml 于离心管中，在 4、15000g下离心 15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。4下保存备用。2.CAT 活性测定（1）取 10ml 具塞试管，加 2ml 酶提取液于沸水浴中加热煮死，冷却备用。（2）取 10ml 具塞试管，3 支为测定管（3 个重复），1 支为对照，按下表加入试剂：表 40-2 紫外吸收法测定 H2O2样品液配置表 管 号 S1 S2 S3 S4 Tris-H

3、cl 1.0 1.0 1.0 1.0 粗酶液(ml)0.1 0.1 0.1 0.1(煮死酶液)蒸馏水(ml)1.7(4)1.7(4)1.7(4)1.7(4)将上述 4 支试管于 25水浴中预热 3min 后,逐管加入 0.2ml 0.2mol/L 的 H2O2溶液，每加完一管立即在紫外分光光度计上测定 A240（蒸馏水调零），每隔 30s 读数一次，共测 3min,记录 4 支试管的测定值。（需用石英比色杯）3.结果计算：以 1min 内 A240降低 0.1（三支测定管的平均值）的酶量为 1 个酶活单位（u），先求出 3支测定管各自 1min 内 A240降低值，按下式计算 CAT 活性。过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=FWtV.VAT124010 式中 A240=AS0 AS0加入煮死酶液的对照管吸光值；AS1,AS2,As3样品测定管吸光值；(+As3)A A S S 1 2 3 Vt酶提取液总体积（ml）；V1测定时用酶液体积（ml）；FW样品鲜重（g）；0.1A240每下降 0.1 为 1 个酶活单位（u）；t加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。【注意事项】凡在 240nm 下有强吸收的物质对本实验有干扰。【思考题】1.影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些?2.过氧化氢酶与哪些生化过程有关?