人类基因组提取讲稿.ppt

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1、关关于人于人类类基因基因组组提取提取第一页，讲稿共四十五页哦人类基因组人类基因组DNADNA的提取的提取第二页，讲稿共四十五页哦提取方法提取方法:1从全血中提取2从口腔上皮脱落细胞，发根细胞中提取第三页，讲稿共四十五页哦(全血）原理：全血）原理：vv细胞裂解液细胞裂解液 ：裂解细胞膜，收集细胞核裂解细胞膜，收集细胞核vSDS：破裂核膜：破裂核膜v蛋白酶K：使核蛋白降解成小片段并从：使核蛋白降解成小片段并从DNADNA上解离 下来vv苯酚苯酚氯仿氯仿：抽提去除蛋白质：抽提去除蛋白质v无水乙醇：沉淀：沉淀DNAvv75%75%乙醇乙醇：洗涤：洗涤DNADNA沉淀真空干燥后，溶解于TETE中即得到高

2、分量的DNADNA第四页，讲稿共四十五页哦（全血）操作方法：（全血）操作方法：细胞裂解与细胞裂解与细胞裂解与细胞裂解与RNase/RNase/RNase/RNase/蛋白酶蛋白酶蛋白酶蛋白酶K K K K 消化消化消化消化1.1.取100 100 ll抗抗凝凝全全血血置置于于1.5ml 1.5ml EppendorfEppendorf离离心心管管中中，再再加加入入100 100 ll裂裂解解液液和和20 20 l l RNaseA/RNaseA/蛋蛋白白酶酶K液，用移液器来回吹打混匀，室于5555温温浴浴3535分分钟钟，其间来回颠倒离心管几次，直至溶液呈水溶状。其间来回颠倒离心管几次，直至溶

3、液呈水溶状。2.2.加加入入10l 3M的NaAc(pH NaAc(pH 4.8)4.8)，随后加入1250 1250 ll结合缓冲液，充分振荡混匀，1212，000 000 rpmrpm离离心心3030秒。秒。第五页，讲稿共四十五页哦DNADNADNADNA与吸附柱结合与吸附柱结合3用用移移液液器器TipTip转移上清并加入到离心吸附柱（套好收集管）中，放置1 1分钟，1212，000 rpm离心30秒秒，倒掉收集管中的废液。倒掉收集管中的废液。注注意意：待转移上清约1300l1300l，离心吸附柱容量约650 650 ll，故故需需每每次次转转移移上上清清650 650 ll到到离离心心吸

4、吸附附柱柱中中，离心，倒掉收集管中的废液，重复实验操作步骤离心，倒掉收集管中的废液，重复实验操作步骤3 3。第六页，讲稿共四十五页哦DNADNADNADNA的纯化的纯化的纯化的纯化:4.4.再再加加入入600 600 ll洗洗涤涤缓缓冲冲液液（washing washing bufferbuffer）到到离心吸附柱（套好收集管）中，离心吸附柱（套好收集管）中，1212，000 rpm 000 rpm 离心离心30秒。秒。5 5重重复复步步骤骤4一一次次，1212，000 rpm 离离心心3 3分分钟钟以以充充分分除去洗涤缓冲液。除去洗涤缓冲液。6 6小小心心取取出出离离心心吸吸附附柱柱，弃弃收

5、收集集管管，将将离离心心吸吸附附柱柱套套入入一一个个干干净净的的1.5ml Eppendorf 离心管，并加入50 l洗洗脱脱缓缓冲冲液液(elution(elution buffer)buffer)到到离离心心吸吸附附柱柱中中(洗洗脱脱缓缓冲冲液液一一定定要要加加在在离离心心吸吸附附柱柱的的正正中中)，放放置置1 1分钟，于分钟，于12，000 rpm 000 rpm 离心离心30秒。7 7取取出出Eppendorf Eppendorf 离离心心管管，其其中中便便是是所所提提取取基基因因组组NANA。第七页，讲稿共四十五页哦（口腔上皮脱落细胞）原理（口腔上皮脱落细胞）原理 哺乳动物的一切有核

6、细胞都可以用来制备DNA,除特殊要求外，白细胞，肝或脾组织是最常用的的材料。原始材料较少或较难获得时（如羊水细胞），还必须经过细胞培养来获得足够量的细胞，有时为了简易，还可以无创伤的采集材料，如用口腔上皮脱落细胞，发根细胞。产前诊断所用的材料则为胎儿的羊水细胞或绒毛膜细胞；第八页，讲稿共四十五页哦（口腔上皮脱落细胞）操作方法：（口腔上皮脱落细胞）操作方法：1 1、用用舌舌头头舔舔颊颊粘粘膜膜上上颚颚、用用牙牙刮刮颊颊部部，嘬嘬咀咀，用用分分泌泌出出的的唾唾液液反反复复漱漱口口；将将唾唾液液吐吐到到杯杯中中。用用生生理理盐盐水水洗洗涤，涤，2000rpm2000rpm离心离心1010分钟，倒掉上

7、清液；重复1次。次。2、沉沉淀淀中中加加1ml 1细细胞胞核核裂裂解解液液(STE)，打打散散细细胞胞团团、混混匀匀，再再加加酶酶解解混混合合液液（含含350l 350l STESTE、150l 10%SDS和和10l 10l 20mg/ml20mg/ml蛋蛋白白酶酶K），摇匀，至出现粘稠透明状。3737温箱过夜或温箱过夜或50503434小时。小时。第九页，讲稿共四十五页哦3 3、加等体积饱和酚（或1/31/3体体积积的的饱饱和和NaClNaCl），轻轻摇摇混混匀匀1010分分钟钟，室室温温2000rpm2000rpm离离心心1010分分钟钟，去去除除蛋蛋白白和和SDSSDS的沉淀。4、小心

8、移上清至另一离心管（尽量避免吸取中间层），加等体积氯仿混匀5 5分钟，室温分钟，室温2000rpm2000rpm离心离心5 5分钟。分钟。5、重复步骤、重复步骤4 4一次。第十页，讲稿共四十五页哦6、将上清移入另一离心管中，沿离心管壁向DNA溶溶液液中中加加入入2.52.5倍倍体体积积的的无无水水乙乙醇醇，轻轻轻轻摇摇动动离离心心管管混混和和至至体体系系完完全全均均一一，见见白白色色絮絮状状DNADNA。用用移移液液器器吸吸头头挑挑出出DNADNA沉沉淀淀，在在新新配配制制的的70%70%乙乙醇醇洗洗二二次次，室室温温干干燥燥5 5分分钟钟，再再将将DNA溶于溶于20-100l TE20-10

9、0l TE中。中。7、TETE溶溶解解的的DNA，在在4下下可可保保存存一一年年，如如要要求求长长期期保保存存，则需加则需加2 2倍体积无水乙醇置-70-70保存。保存。第十一页，讲稿共四十五页哦 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶第十二页，讲稿共四十五页哦一、一、概概念念核酸酶内切酶外切酶限制性核酸内切酶：限制性核酸内切酶：能识别双链能识别双链DNA分子内部的特分子内部的特异位点并裂解异位点并裂解磷酸二酯键磷酸二酯键第十三页，讲稿共四十五页哦二、分二、分类类vv分分类类依据：酶的基因、蛋白依据：酶的基因、蛋白质结构质结构、依、依赖赖的的辅辅助因子及助因子及与与DNADNA结结合和裂解的特合和裂

10、解的特异异性性特性特性I I类类II II类类IIIIII类类内内内内切酶的蛋白切酶的蛋白切酶的蛋白切酶的蛋白结构结构结构结构单单单单一多功能的酶一多功能的酶一多功能的酶一多功能的酶内内切酶和甲基化酶切酶和甲基化酶分分开开共同共同共同共同亚亚亚亚基的基的基的基的双双双双功能功能功能功能酶酶酶酶限制和修限制和修限制和修限制和修饰饰饰饰活性活性活性活性3 3种种种种不同的不同的不同的不同的亚亚亚亚基基基基单单一成分一成分2 2种种种种不同的不同的不同的不同的亚亚亚亚基基基基所需所需所需所需辅辅辅辅助因子助因子助因子助因子ATM,Mg2+,SAMATM,Mg2+,SAMMg2+Mg2+ATM,Mg2

11、+,SAMATM,Mg2+,SAM寄主特寄主特寄主特寄主特异异异异性位点性位点性位点性位点识识识识别别别别序列序列序列序列EcoB:TGA(N)8TGCTEcoB:TGA(N)8TGCTEcoK:AAC(N)6GTGCEcoK:AAC(N)6GTGC回文序列回文序列（IIsIIs型除外）型除外）EcoP1:AGACCEcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAGEcoP15:CAGCAG第十四页，讲稿共四十五页哦 切割位点切割位点在距离在距离识别识别位点至位点至少少1000pb1000pb处随处随机切机切开开一一条单链条单链位于寄主特位于寄主特异异性位性位点或其附近点或其附近距寄主特距寄主特

12、异异性位点性位点33端端24-26pb24-26pb处处酶催酶催酶催酶催转换转换转换转换不能不能不能不能能能能能能能DNADNA易位作用易位作用易位作用易位作用能能能能不能不能不能不能不能不能甲基化作用的位点甲基化作用的位点甲基化作用的位点甲基化作用的位点寄主特寄主特寄主特寄主特异异异异性位点性位点性位点性位点寄主特寄主特异异性位点性位点寄主特寄主特寄主特寄主特异异异异性位点性位点性位点性位点识别为识别为识别为识别为甲基化的序甲基化的序甲基化的序甲基化的序列列列列进进进进行切割行切割行切割行切割能能能能能能能能能能序列特序列特序列特序列特异异异异的切割的切割的切割的切割不是不是不是不是是是是是

13、是是基因工程中的用途基因工程中的用途基因工程中的用途基因工程中的用途无用无用无用无用十分有用十分有用作用不大作用不大作用不大作用不大第十五页，讲稿共四十五页哦三、作用机制三、作用机制 以环状或线性的双链DNA为底物，在合适的反应条件下，识别特定的核苷酸序列，使两条核苷酸糖链上特定位置的磷酸二酯键断裂，两裂口之间的碱基对的氢键也随之断开，产生具有3-羟基和5-磷酸基的DNA片段。第十六页，讲稿共四十五页哦四、切割方法四、切割方法识别和切割位点 4-64-6个碱基对且具有个碱基对且具有回文序列的的DNADNA片段片段 大多数酶是错位切割产生5或者或者33黏性末端例如：例如：EcoR I EcoR

14、I 切割后产生切割后产生5 5黏性末端5-G5-GAATTC-3 5-G AATTC-33 3-CTTAAG-5 3-CTTAA G-CTTAAG-5 3-CTTAA G-55第十七页，讲稿共四十五页哦黏性末端黏性末端第十八页，讲稿共四十五页哦平末端平末端有一些酶沿对称轴切断DNA，产生的末端称为平端或钝端例如:SmaI第十九页，讲稿共四十五页哦同工异源酶同工异源酶同工异源酶同工异源酶 来源不同的酶，但能识别和切割同一位点 如如BamH I BamH I 和和Bst I(GBst I(GGATCC)GATCC)同尾酶同尾酶同尾酶同尾酶 有些限制性内切酶识别序列不同，但是产生相 同的黏性末端。如

15、如BamH IBamH I（GGATCCGGATCC）和）和 Sau3A I(NGATCN)Sau3A I(NGATCN)琼脂糖凝胶电泳结果分析第二十页，讲稿共四十五页哦琼脂糖凝胶电泳结果分析琼脂糖凝胶电泳结果分析第二十一页，讲稿共四十五页哦琼脂糖凝胶电泳结果分析琼脂糖凝胶电泳结果分析 琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶:天然琼脂是一种多聚糖，主要由琼脂糖及琼脂胶组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些集团带有点荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象。第二十二页，讲稿共四十五页哦 什么是琼脂糖凝胶电泳？琼脂糖凝胶电泳主要是应用琼脂糖凝胶作为支持

16、物的电泳法，借助琼脂凝胶分子筛作用，核算片段因其分子量或者分子形状不同，电泳速度有差异而分离。这种技术是基因操作的一种方法。第二十三页，讲稿共四十五页哦琼琼脂糖凝脂糖凝胶电胶电泳原理泳原理v琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力,同时也由此造成了经过一定时间的泳动后按大小形成的一条“条带”。其中线状的DNA可以通过。第二十四页，讲稿共四十五页哦琼琼脂糖凝脂糖凝胶电胶电泳原理泳原理:核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中，其碱基不解离

17、，而磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。第二十五页，讲稿共四十五页哦 琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳对对核核酸酸的的分分离离结结果果与与核核酸酸的分子量、分子构型和凝胶浓度的分子量、分子构型和凝胶浓度密切相关。密切相关。实验证明，DNADNA片段迁移距离与其分子量的对数成反比。通过比较标准物与未知片段的移动距离便可测出未知片段的大小。但当DNADNA分分子子超超过过20kb20kb时时，

18、普普通通琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶就就很很难难讲讲它它们们分开。分开。第二十六页，讲稿共四十五页哦1 1)核酸的分子量核酸的分子量质粒质粒DNADNA有三种形式有三种形式vv1 1、共价闭环共价闭环DNA:常以超螺旋形式存在vv 2 2、开环DNADNA:质粒质粒DNADNA两条链中有一条发生一处或多处断两条链中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张力裂，因此可以自由旋转从而消除张力,形成松弛的环状形成松弛的环状分子分子 v 3、线性线性DNADNA:因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成的两条链在同一处断裂而造成.第二十七页，讲稿共四十五页哦2 2）核酸构型）核酸构型 不不同同构构型

19、型的的DNADNA在在琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶中中的的电电泳泳速速度度差差别别较较大大。在在分分子子量量相相当当的的情情况况下下，不不同同构构型型的的质质粒粒DNADNA的的移移动动速速度度次次序序为为：共价闭环DNADNA直线DNADNA开开环环的的双双链链环环状状DNADNA。这这三三种种构构型型的的相相对对迁迁移移速速率率主主要要取取决决于于凝凝胶胶浓浓度，同时也受到度，同时也受到电流强度、缓冲液离子强度等电流强度、缓冲液离子强度等的影响。的影响。第二十八页，讲稿共四十五页哦超螺旋超螺旋DNADNA：尽管质粒通常以开环的形式进行描述，然而在细菌尽管质粒通常以开环的形式进行描述，然而在细菌细胞

20、内细胞内DNA链即是盘绕在组蛋白周围形成一种致密的结链即是盘绕在组蛋白周围形成一种致密的结构。这就是所谓超螺旋结构，由于其结构致密，它在凝构。这就是所谓超螺旋结构，由于其结构致密，它在凝胶中的泳动胶中的泳动速度最快。线性线性DNA：当当DNA损伤在损伤在DNA双链相对应的两条链上同时产生切双链相对应的两条链上同时产生切口时，就会出现线性质粒口时，就会出现线性质粒DNADNA，这种DNADNA的泳动速率的泳动速率介介于于超螺旋与切口质粒超螺旋与切口质粒DNA之间。第二十九页，讲稿共四十五页哦开环开环DNADNA：在质粒在质粒DNADNA复制过程中，拓扑异构酶I会在会在DNADNA双螺双螺旋中的一

21、条链中引入一个切口，解开质粒的超螺旋。在旋中的一条链中引入一个切口，解开质粒的超螺旋。在质粒分离过程中由于物理剪切和酶的切割作用同样也会质粒分离过程中由于物理剪切和酶的切割作用同样也会在超螺旋质粒中引入切口从而产生松散的开环结构。这在超螺旋质粒中引入切口从而产生松散的开环结构。这种形式的质粒迁移种形式的质粒迁移速率最慢，其，其“松散松散”的分子形式阻的分子形式阻碍了它在琼脂糖凝胶中的运动。碍了它在琼脂糖凝胶中的运动。第三十页，讲稿共四十五页哦 一一定定大大小小的的DNADNA片片段段在在不不同同浓浓度度的的琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶中中的的电电泳泳迁迁移移率率不不同同。要要有有效效地地分分离离大大小

22、小不不同同的的DNA片片段段，需选用适当的琼脂糖凝胶浓度。需选用适当的琼脂糖凝胶浓度。3 3）琼脂糖的浓度）琼脂糖的浓度第三十一页，讲稿共四十五页哦琼脂糖凝胶电泳的应用。琼脂糖凝胶电泳的应用。第三十二页，讲稿共四十五页哦v蛋白质和核酸，由于pH的不同带有不同电荷，且在电场中受力大小不同，导导致致发发生生泳泳动动的的速速度度不不同同，最最终可将其分离开来。终可将其分离开来。vv电电泳泳缓缓冲冲液液的的pHpH在6969之之间间，离离子子强强度度0.020.050.020.05为为最最适适。常常用用1%1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp100bp的DNA片片段段，其其分分

23、辨辨率率虽虽比比聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶低低，但但它它制制备备容容易易，分分离离范范围围广广。普普通通琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶分分离离DNADNA的范围为0.2-20kb0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达107bp的的DNADNA片段。片段。第三十三页，讲稿共四十五页哦vv电泳的缓冲液中充满了离子，因此可以导电。电泳的缓冲液中充满了离子，因此可以导电。DNADNA分子分子在高于等电点的在高于等电点的pHpH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNADNA几乎具有等量的净电荷几乎具有等量的净电荷，

24、因此它们能以同样的，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。速率向正极方向移动。第三十四页，讲稿共四十五页哦琼琼脂糖凝脂糖凝胶电胶电泳注意点泳注意点选择合适的电泳方法选择合适的电泳方法vv琼脂糖凝胶电泳：一般的核酸检测琼脂糖凝胶电泳：一般的核酸检测vv聚丙烯酰胺凝胶电泳：高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳：高分辨率v脉冲凝胶电泳：DNADNA链巨大凝胶浓度 浓度通常在浓度通常在0.52%2%之间，低浓度的用于大片段核酸的电之间，低浓度的用于大片段核酸的电泳，高浓度的用于小片段分析。低浓度胶易碎，小心操泳，高浓度的用于小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意：作和使用质量好的

25、琼脂糖是解决办法。注意：高浓度的高浓度的胶可能使分子大小相近的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。第三十五页，讲稿共四十五页哦 缓冲液缓冲液:常常用用的的缓缓冲冲液液有有TAETAE和和TBE，而而TBETBE比比TAETAE有有着着更更好好的的缓缓冲能力。使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。冲能力。使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意：电电泳泳缓缓冲冲液液多多次次使使用用后后，离离子子强强度度降降低低，pHpH值上升，缓冲性能下降，可可能能使使DNADNA电电泳泳产产生生条条带带模模糊糊和和不规则不规则的DNADNA带迁移的现象。带迁移的现象。第三十六页，讲稿共

26、四十五页哦 电压电压和和温温度度:电电泳泳时时电电压压不不应应该该超超过过20V/cm20V/cm，电电泳泳温温度度应应该该低低于于3030，对于巨大的巨大的DNADNA电泳，温度应该低于1515。注注意意：如如果果电电泳泳时时电电压压和和温温度度过过高高，可可能能导导致致出出现现条条带带模模糊糊和和不不规规则则的的DNADNA带带迁迁移移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象第三十七页，讲稿共四十五页哦 DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计比较

27、准确。需要注意的是Marker的电泳同样要符合DNA电泳的操作标准。第三十八页，讲稿共四十五页哦核酸染色核酸染色剂剂 实验室常用的核酸染色剂是实验室常用的核酸染色剂是溴化乙锭（溴化乙锭（EBEB）溴化乙锭（EB）：是是一一种种吖吖啶啶类类染染料料，它它在在紫紫外外灯灯照照射射下下能能发发射射荧荧光光，当当DNADNA样样品品在在琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶中中电电泳泳时时，琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶中中的的EBEB就就插插入入DNADNA分子中形成荧光络合物，使DNADNA发发射射的的荧荧光光增增强强几几十十倍倍，电电泳泳后后就就可可直直接接紫紫外外灯照射检测琼脂糖中的灯照射检测琼脂糖中的DNADNAvv优

28、点：染色效果好，操作方便优点：染色效果好，操作方便v缺点：稳定性差，具有毒性。vv注注意意：观观察察凝凝胶胶时时应应根根据据染染料料不不同同使使用用合合适适的的光光源源和和激激发发波波长长，如如果果激激发发波波长长不不对对，条条带带则则不不易易观观察察，会会出出现现条带模糊的现象。条带模糊的现象。第三十九页，讲稿共四十五页哦DNA样样品的品的纯纯度和度和状态状态v样品中含盐量太高和含含杂杂质质蛋蛋白白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。vv变变性性的的DNADNA样品可可能能导导致致条条带带模模糊糊和和缺缺

29、失失，也也可可能能出出现不规则的现不规则的DNADNA条带迁移。条带迁移。用20mM NaCl20mM NaCl缓冲液稀释可以防止缓冲液稀释可以防止DNADNA变性变性第四十页，讲稿共四十五页哦DNADNA的上样的上样 正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。第四十一页，讲稿共四十五页哦琼脂糖凝胶电泳操作步骤琼脂糖凝胶电泳操作步骤v1 制备琼脂糖凝胶v2.胶板制备v3.加样v4.电泳v5.漂洗v6.观察照相第四十二页，讲稿共四十五页哦琼脂糖凝胶电泳的应用琼脂糖凝胶电泳的应用v检测提取的DNAv设计完成引物，扩增好基因序列，做完PCR后，检测是否成功。v观察限制性内切酶的切割结果v通过切胶回收纯化某个片段第四十三页，讲稿共四十五页哦实验结果观察及记录实验结果观察及记录v在波长为254nm的长波长紫外灯下，观察染色的或已加有EB的电泳胶板v记录下结果，找出实验中的问题及不足。第四十四页，讲稿共四十五页哦感感谢谢大大家家观观看看第四十五页，讲稿共四十五页哦