人胚胎干细胞研究进展讲稿.ppt

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1、关于人胚胎干细胞研究进展第一页，讲稿共四十页哦干细胞的基本概念干细胞的基本概念胚胎干细胞系的建立过程胚胎干细胞系的建立过程胚胎干细胞研究的进展情况胚胎干细胞研究的进展情况胚胎干细胞的研究意义胚胎干细胞的研究意义胚胎干细胞研究的困难及解决办法胚胎干细胞研究的困难及解决办法第二页，讲稿共四十页哦 人体发生过程：人体发生过程：人体发生过程：人体发生过程：受精受精 卵裂卵裂 受精后受精后72h 受精后受精后5-7天天精子精子+卵子卵子 合子合子 卵裂球卵裂球 桑椹胚桑椹胚 囊胚囊胚 滋养层滋养层胎盘及胎儿附属结构胎盘及胎儿附属结构囊胚囊胚 内胚层内胚层消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰。消化道、呼吸

2、道上皮和腺体；肝；胆；胰。内细胞群内细胞群 中胚层中胚层结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统 外胚层外胚层体表结构；神经系统体表结构；神经系统第三页，讲稿共四十页哦第四页，讲稿共四十页哦第五页，讲稿共四十页哦第六页，讲稿共四十页哦干细胞的基本概念干细胞的基本概念1、定义定义：具有自我复制的能力，在一定条件下能够分化成各种功能细胞。：具有自我复制的能力，在一定条件下能够分化成各种功能细胞。2、分类分类：（1）全能干细胞全能干细胞，包括：胚胎干细胞（，包括：胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES细胞）细胞）生殖干细胞（生殖干细胞（em

3、bryonic germ cells,EG细胞）细胞）具有全能性，能够分化成全身具有全能性，能够分化成全身200多种细胞类型，多种细胞类型，进一步形成机体的任何组织和器官。进一步形成机体的任何组织和器官。（2）多能干细胞多能干细胞：具有分化成多种细胞和组织的潜能，但却失去了发：具有分化成多种细胞和组织的潜能，但却失去了发 育成完整个体的能力。育成完整个体的能力。（3）专能干细胞专能干细胞：只能向一种或密切相关的两种类型的细胞分化。：只能向一种或密切相关的两种类型的细胞分化。第七页，讲稿共四十页哦第八页，讲稿共四十页哦横向分化：横向分化：部分干细胞在特定条件下可以转化为其它细部分干细胞在特定条件

4、下可以转化为其它细胞，如肌肉干细胞在特定条件下可以分化为各种血胞，如肌肉干细胞在特定条件下可以分化为各种血细胞系。细胞系。第九页，讲稿共四十页哦1.衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞；衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞；2.永生化永生化(immortal)；3.能维持稳定的正常的二倍体染色体结构；能维持稳定的正常的二倍体染色体结构；4.有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化；有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化；5.能参与胎儿所有组织的发育过程；能参与胎儿所有组织的发育过程；胚胎干细胞的性质胚胎干细胞的性质第十页，讲稿共四十页哦胚胎干细胞系的建立过程胚胎干细胞系的建立过程第十一页，讲稿共

5、四十页哦第十二页，讲稿共四十页哦1、干细胞来源：、干细胞来源：(1)发育良好的囊胚，从中分离内细胞群细胞发育良好的囊胚，从中分离内细胞群细胞ES细胞细胞(2)从从5-9周的胚胎生殖腺中分离出人的周的胚胎生殖腺中分离出人的EG细胞（细胞（embryonic germinate cells）(3)恶性胚胎肿瘤或畸胎瘤细胞恶性胚胎肿瘤或畸胎瘤细胞 （embryonal carcinoma,EC)(4)生殖克隆（治疗性克隆）：体细胞核转移（生殖克隆（治疗性克隆）：体细胞核转移（SCNT）去核卵细胞去核卵细胞+体细胞核体细胞核 克隆克隆 囊胚囊胚 分离内细胞群分离内细胞群 ES细胞细胞第十三页，讲稿共四

6、十页哦第十四页，讲稿共四十页哦第十五页，讲稿共四十页哦2、胚胎干细胞的分离、胚胎干细胞的分离酶消化后培养酶消化后培养免疫方法去处滋养层细胞免疫方法去处滋养层细胞流式细胞仪分离法流式细胞仪分离法第十六页，讲稿共四十页哦3、培养条件：、培养条件：(1)特殊的培养液：用特殊的培养液：用DMEM培养液，其中胎牛血培养液，其中胎牛血清的浓度和质量很重要，还要加非必须氨基酸；清的浓度和质量很重要，还要加非必须氨基酸；-巯基乙醇。巯基乙醇。(2)以人或胚鼠的成纤维细胞为饲养细胞。以人或胚鼠的成纤维细胞为饲养细胞。(3)必须加入必须加入LIF，抑制细胞分化。，抑制细胞分化。第十七页，讲稿共四十页哦4、胚胎干细

7、胞的鉴别、胚胎干细胞的鉴别胚胎干细胞具有以下特点：胚胎干细胞具有以下特点：(1)细胞内碱性磷酸酶活性高细胞内碱性磷酸酶活性高(2)端粒酶活性高端粒酶活性高(3)不被不被Hoechst33342 和和Rhodamine123染色染色(4)细胞膜表面有特殊的标记：细胞膜表面有特殊的标记：SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81(5)能分化成三个胚层的细胞，将胚胎干细胞植能分化成三个胚层的细胞，将胚胎干细胞植 入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤(6)可诱导分化为各种成体干细胞可诱导分化为各种成体干细胞第十八页，讲稿共四十页哦第十九页，讲稿共四十页哦第二

8、十页，讲稿共四十页哦第二十一页，讲稿共四十页哦第二十二页，讲稿共四十页哦干细胞特性干细胞特性干细胞特性干细胞特性第二十三页，讲稿共四十页哦第二十四页，讲稿共四十页哦干细胞诱导分化的常用方法干细胞诱导分化的常用方法（1）加入诱导细胞分化的因子或化学物质，）加入诱导细胞分化的因子或化学物质，如如VGEF、bFGF、DMSO和和RA等等（2）将）将ES细胞与特定的细胞共培养细胞与特定的细胞共培养（3）将某种分化诱导因子的基因转入）将某种分化诱导因子的基因转入ES细细 胞内胞内 第二十五页，讲稿共四十页哦鉴定干细胞的常用方法：鉴定干细胞的常用方法：（1）细胞形态与结构细胞形态与结构（2）细胞功能）细胞

9、功能（3）细胞表面的特殊标志）细胞表面的特殊标志（4）细胞内特异基因的表达）细胞内特异基因的表达第二十六页，讲稿共四十页哦造血干细胞的鉴定：造血干细胞的鉴定：（1）细胞形态细胞形态：集落呈非贴壁生长，细胞形态较小：集落呈非贴壁生长，细胞形态较小（2）细胞表面标志细胞表面标志：flk-1（Fetal Liver Kinase 1);L/TAL-1；CD34；GATA-1；（3）基因表达基因表达：TAL-1；GATA-2；H1；主要珠蛋白主要珠蛋白 第二十七页，讲稿共四十页哦 内皮细胞内皮细胞:（1）细胞形态细胞形态：扁平贴壁状态：扁平贴壁状态；Weibel-Palade小体；广泛胞内小体；广泛胞

10、内连接；大量吞饮泡连接；大量吞饮泡（2）细胞标志：细胞标志：血小板内皮细胞粘附分子血小板内皮细胞粘附分子PECAM-1或或CD31；细胞；细胞粘附分子整合素粘附分子整合素v3；CD34；JAM(Junctional Adhesion Membrane)；MECA-32以及以及MEC-14，7抗原抗原（3）特异基因表达特异基因表达：flk-1；flt-1；tie-2 第二十八页，讲稿共四十页哦心肌干细胞：心肌干细胞：（1）细胞结构细胞结构：细胞内含糖原颗粒，大量线粒体以及广泛的未：细胞内含糖原颗粒，大量线粒体以及广泛的未形成成熟肌原纤维的粗丝和细丝形成成熟肌原纤维的粗丝和细丝（2）细胞功能细胞功

11、能：节律性收缩：节律性收缩；心肌特异离子流。利用膜片钳技术可；心肌特异离子流。利用膜片钳技术可检测检测L型型Ica，Ina，Ito，Ik，Ik1，Ik，ACH和和If（3）基因表达基因表达：及及心肌球蛋白重链心肌球蛋白重链 第二十九页，讲稿共四十页哦 神经干细胞神经干细胞:（1）细胞形态细胞形态：胞体很小，从胞体伸出许多长的神经突：胞体很小，从胞体伸出许多长的神经突（2）细胞功能细胞功能：电压控制性：电压控制性Na+，K+，Ca2+通道；神经递质的受通道；神经递质的受体体（3）细胞标志细胞标志：TH（酪氨酸羟化酶），微管相关蛋白（酪氨酸羟化酶），微管相关蛋白tau，MAP2，微管蛋白微管蛋白3

12、（TuJ-1），），GFAP（胶质原纤维酸性蛋白），巢蛋白，（胶质原纤维酸性蛋白），巢蛋白，突触泡蛋白以及突触泡蛋白以及NF-L（68KDa的神经丝蛋白），的神经丝蛋白），NF-H（200KDa的神经丝蛋白），的神经丝蛋白），NF-M（160KDa的神经丝蛋白）；的神经丝蛋白）；Nurr1和和Ptx3（中脑多巴胺能神经元的标志）（中脑多巴胺能神经元的标志）（4）特异基因表达特异基因表达：5天的天的EBs中有中有NF-L，NF-M和突触泡蛋白的和突触泡蛋白的表达，表达，2天后表达编码神经聚糖（脑特异蛋白多糖）的基因，天后表达编码神经聚糖（脑特异蛋白多糖）的基因，6天后天后表达编码微管相关蛋白表达

13、编码微管相关蛋白tau的基因。也有检测发现分化细胞中有的基因。也有检测发现分化细胞中有Brain-3，谷氨酰胺受体亚单位，谷氨酰胺受体亚单位GluR-4和和GluR-6，递质合成酶，递质合成酶TH和和GAD67，GAD65，GFAP和和NF-L的表达的表达 第三十页，讲稿共四十页哦 胰岛细胞胰岛细胞:细胞标志细胞标志：GATA-4（胚胎和胚外内胚层的标志），（胚胎和胚外内胚层的标志），HNF3（胚（胚胎内胚层的标志）；胰岛素淀粉样多肽胎内胚层的标志）；胰岛素淀粉样多肽IAPP；葡萄糖转运蛋白；葡萄糖转运蛋白-2（Glut-2）；胰岛胰岛细胞的特征及特定标记物细胞的特征及特定标记物：胰岛：胰岛G

14、K和和GLUT2（葡萄糖转运（葡萄糖转运子）；转录因子子）；转录因子IPF1/PDX1和和NgN3（Neurogenin3）第三十一页，讲稿共四十页哦第三十二页，讲稿共四十页哦 2002年3月，美国麻省理工学院的科学家宣布，他们首次利用人体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎干细胞技术在治疗心血管疾病等领域的应用潜力。目前已有报导ES细胞能在适当条件下分化为心肌细胞，胰岛细胞，血管内皮细胞，肝细胞等。第三十三页，讲稿共四十页哦第三十四页，讲稿共四十页哦 1999年年12月，美国月，美国科学科学杂志公布了当年世界科杂志公布了当年世界科学进展的评定结果，干细胞的研究成果列在举世瞩目学进展的评定结果，干细胞的研究成果列在举世瞩目耗资巨大的人类基因组工程之前，名列十大科学进展耗资巨大的人类基因组工程之前，名列十大科学进展首位。首位。第三十五页，讲稿共四十页哦第三十六页，讲稿共四十页哦第三十七页，讲稿共四十页哦解决胚胎来源有限的途径：解决胚胎来源有限的途径：未成熟卵的体外成熟第三十八页，讲稿共四十页哦避免免疫排斥的方法避免免疫排斥的方法（1）Knock-out 胚胎干细胞的组织相 容性抗原（2）Knock-in 受者的组织相容性抗原（3）与同一来源的造血干细胞一同移植（4）受者的体细胞核移植第三十九页，讲稿共四十页哦感感谢谢大大家家观观看看第四十页，讲稿共四十页哦