实验八亲和层析分离纯化蛋白质.ppt
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1、关于实验八亲和层析分离纯化蛋白质现在学习的是第1页,共34页 实验目的实验目的掌握掌握GST亲和层析分离纯化目标蛋白的亲和层析分离纯化目标蛋白的原理和实验方法(第一部分)原理和实验方法(第一部分)掌握掌握SDS-PAGE检测目标蛋白原理和检测目标蛋白原理和方法(第二部分)方法(第二部分)现在学习的是第2页,共34页第一部分第一部分 GST亲和层析分离纯化目标蛋白亲和层析分离纯化目标蛋白现在学习的是第3页,共34页 一、实验原理一、实验原理现在学习的是第4页,共34页亲和层析亲和层析 生物大分子与配体特异非共价可逆结合。生物大分子与配体特异非共价可逆结合。酶酶-底物或底物类似物底物或底物类似物抗
2、体抗体-抗原抗原激素激素-受体受体外源凝集素外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞表面受体多糖、糖蛋白、细胞表面受体核酸核酸-互补核苷酸序列(互补核苷酸序列(Oligo-dT)现在学习的是第5页,共34页亲亲和和层层析析原原理理现在学习的是第6页,共34页GST亲合层析亲合层析 谷胱甘肽硫转移酶(谷胱甘肽硫转移酶(GST,26kd,与谷胱甘,与谷胱甘肽肽GSH特异结合)特异结合)GSH作为配体,共价结合在葡聚糖上,作为配体,共价结合在葡聚糖上,(Sepharose 4B)GST融合目标蛋白融合目标蛋白葡聚糖上的葡聚糖上的GSH与与GST融合蛋白结合融合蛋白结合用还原型用还原型GSH洗脱洗脱GST融合蛋
3、白融合蛋白现在学习的是第7页,共34页GSH-Sepharose 4B现在学习的是第8页,共34页GSH-Sepharose 4B现在学习的是第9页,共34页现在学习的是第10页,共34页现在学习的是第11页,共34页外源蛋白的表达和纯化外源蛋白的表达和纯化现在学习的是第12页,共34页 二、实验步骤二、实验步骤现在学习的是第13页,共34页现在学习的是第14页,共34页 (一)目标蛋白诱导表达和菌体收集(一)目标蛋白诱导表达和菌体收集 10.5 mmol/L IPTG诱导大肠杆菌中的蛋白表诱导大肠杆菌中的蛋白表达,达,28,200 rpm培养培养3-6 h。25000 rpm离心离心5 mi
4、n,倒掉上清。,倒掉上清。3沉淀加沉淀加40 ml水,水,5000 rpm离心离心5 min。现在学习的是第15页,共34页(二)细胞破碎(二)细胞破碎1倒掉上清,加倒掉上清,加30 ml PBS缓冲液悬浮菌体。缓冲液悬浮菌体。2破碎菌体,超声波破碎菌体,超声波2 min,停止,停止1 min。(菌液始终保持在冰浴中)(菌液始终保持在冰浴中)3重复重复8-10遍,直至菌液清澈。遍,直至菌液清澈。现在学习的是第16页,共34页(三)离心(三)离心1每个小组分取每个小组分取1-2 ml细胞破碎液,细胞破碎液,12000 rpm,离心,离心5 min。2分取分取50 uL上清液,上清液,4保存。保存
5、。3其余的上清液准备过其余的上清液准备过GST柱子。柱子。现在学习的是第17页,共34页(四)装(四)装GST柱子柱子1清洗和装好层析柱,封闭出口。清洗和装好层析柱,封闭出口。2加入加入2 mL PBS。3用滴管取用滴管取0.5-1 ml GST填料,加入柱子中。填料,加入柱子中。4打开柱子出口,使打开柱子出口,使PBS缓慢流出。缓慢流出。注意:始终保持柱内的液面高于注意:始终保持柱内的液面高于GST树脂。树脂。现在学习的是第18页,共34页(五)纯化目的蛋白(五)纯化目的蛋白1用用5 ml PBS缓冲液洗柱床,重复缓冲液洗柱床,重复3遍。遍。2将混合蛋白质溶液加到柱子中。将混合蛋白质溶液加到
6、柱子中。3用用5 ml PBS缓冲液洗柱子,重复缓冲液洗柱子,重复3遍。遍。4加入加入1ml 洗脱液。洗脱液。现在学习的是第19页,共34页5用离心管收集洗脱液,每管收集用离心管收集洗脱液,每管收集0.2ml。6PBS 缓冲液洗柱子缓冲液洗柱子3遍,关闭出口。遍,关闭出口。7用分光光度计测定每一管的吸光度值,用分光光度计测定每一管的吸光度值,记录读数,绘制洗脱曲线。记录读数,绘制洗脱曲线。8将读数最大的一管用于将读数最大的一管用于SDS-PAGE分析。分析。现在学习的是第20页,共34页第二部分第二部分SDS-PAGE检测目标蛋白检测目标蛋白现在学习的是第21页,共34页 一、实验原理一、实验
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- 实验 亲和 层析 分离 纯化 蛋白质
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