高效液相色谱技术在食品营养中的应用.ppt

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1、高效液相色谱技术在食品营养中的应用现在学习的是第1页，共32页 高效液相色谱技术是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱。又因分析速度快而称为高速液相色谱。高效液相色谱法定义：现在学习的是第2页，共32页 溶于流动相溶于流动相(mobile phase)(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由中的各组分经过固定相时，由于与固定相于与固定相(stationary phase)(stationary phase)发生作用（吸附、分配

2、、离子发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，色谱柱，在柱内各成

3、分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法 检等学科领域中重要的分离分析技术。检等学科领域中重要的分离分析技术。原理及应用领域：原理及应用领域：现在学习的是第3页，共32页高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多倍。高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng,进样量在L数量级。应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析

4、，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。高效液相色谱法特点高效液相色谱法特点 “三高一广一快三高一广一快”分析速度快、载液流速快：较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在1530分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。现在学习的是第4页，共32页高效液相色谱法主要类型：液固吸附色谱液液分配色谱液液分配色谱凝胶色谱凝胶色谱键合相色谱键合相色谱现在学习的是第5页，共32页一一.液固吸附色谱液固吸附色谱 1.11.1分离原理分离原理 液固色谱是基于各组分吸附能力的差异进行液固色谱是基于各组分吸附能力的差异进行混合物分离的，其固定相是固体吸附剂。混合

5、物分离的，其固定相是固体吸附剂。1.21.2固定相吸附色谱固定相可以分为极性和非极性两固定相吸附色谱固定相可以分为极性和非极性两大类。大类。1 1.3.3流动相流动相 流动相要求：流动相要求：选用的溶剂应当与固定相互不相溶，并能保持色谱柱选用的溶剂应当与固定相互不相溶，并能保持色谱柱的稳定性的稳定性 选用的溶剂应有高纯度，以防所含微量杂质在柱选用的溶剂应有高纯度，以防所含微量杂质在柱中积累，引起柱性能的改变。中积累，引起柱性能的改变。选用的溶剂性能应与所使用的检测器相匹配，如果使选用的溶剂性能应与所使用的检测器相匹配，如果使用紫外吸收检测器，就不能选用在检测波长下有紫外吸收的溶用紫外吸收检测器

6、，就不能选用在检测波长下有紫外吸收的溶剂；若使用示差折光检测器，就不能用梯度洗脱。剂；若使用示差折光检测器，就不能用梯度洗脱。目 录现在学习的是第6页，共32页市场价格：市场价格：11000RMB/11000RMB/吨吨纯度纯度99%99%以上，以上，含氮量高达含氮量高达66%66%纯牛奶的蛋白质含量约为纯牛奶的蛋白质含量约为2.9%2.9%左右，而一左右，而一般蛋白质含氮量般蛋白质含氮量16%16%。在检出三聚氰胺的产品中，石家庄三鹿牌婴幼儿在检出三聚氰胺的产品中，石家庄三鹿牌婴幼儿配方奶粉三聚氰胺含量很高，其中最高的达配方奶粉三聚氰胺含量很高，其中最高的达2563mg/kg2563mg/k

7、g，其他在，其他在0.09-619mg/kg0.09-619mg/kg之间。之间。现在学习的是第7页，共32页现在学习的是第8页，共32页二、保健食品中主要功效成分的检测方保健食品中主要功效成分的检测方法及原理法及原理现在学习的是第9页，共32页现在学习的是第10页，共32页传统测蛋白质的方法传统测蛋白质的方法凯氏定氮法凯氏定氮法是根据测定样品中的含氮量来计是根据测定样品中的含氮量来计算其中的蛋白质的含量：算其中的蛋白质的含量：含氮量含氮量6.256.256.256.25为蛋白质的含氮系数为蛋白质的含氮系数三聚氰胺事件发生的原因：三聚氰胺事件发生的原因：(1)检测方法的局限性！检测方法的局限性

8、！(2)利益的趋势！利益的趋势！(3)科学普及的不足性！科学普及的不足性！现在学习的是第11页，共32页HPLCHPLC法检测功效成分的原理和方法法检测功效成分的原理和方法现在学习的是第12页，共32页高效液相色谱法的特点:热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。高压高压高效高效高速高速高沸点高沸点现在学习的是第13页，共32页流程及主要部件1.1.流程流程现在学习的是第14页，共32页2.主要部件主要部件 主要部件之一，压力：主要部件之一，压力：150350105 Pa。l为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（

9、10m），液体的），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。效液相色谱的特点之一。l应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性(1)(1)高压输液泵高压输液泵现在学习的是第15页，共32页(2)(2)梯度淋洗装置梯度淋洗装置l外梯度外梯度:l利用两台高压输液泵，将两利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。后进入色谱柱。l内梯度内梯度:l一台高压泵一台

10、高压泵,通过比例调通过比例调节阀节阀,将两种或多种不同极将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。入高压泵中混合。现在学习的是第16页，共32页(3)进样进样装置装置 流路中为高压力工作状态，流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：其结构如图所示：现在学习的是第17页，共32页(4)(4)液相色谱检测器液相色谱检测器l a.a.紫外检测器紫外检测器l 应用最广，对大部分有机化合物有响应。应用最广，对大部分有机化合物有响应。l 特点：特点：l 灵敏度高；灵敏度高；l 线形范围高；线形范围高；l 流

11、通池可做的很小流通池可做的很小（1mm 10mm，容积，容积 8L）；l 对流动相的流速和温度变化不敏感；对流动相的流速和温度变化不敏感；l 波长可选，易于操作；波长可选，易于操作；l 可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。现在学习的是第18页，共32页b.光电二极管阵列检测器 紫外检测器的重要进展；紫外检测器的重要进展；光光电电二二极极管管阵阵列列检检测测器器：1024个个二二极极管管阵阵列列，各各检检测测特特定定波波长长，计计算算机机快快速速处处理理，三维立体谱图，如图所示。三维立体谱图，如图所示。现在学习的是第19页，共32页光电二极管阵列检测器现在学习的是第20页，共32页c.示差折光检测器

12、 除除紫紫外外检检测测器器之之外外应应用用最最多多的的检检测测器器；可可连连续续检检测测参参比比池池和和样样品品池池中中流流动动相相之之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比间的折光指数差值。差值与浓度呈正比 通通用用型型检检测测器器（每每种种物物质质具具有有不不同同的的折折光指数）；光指数）；灵灵敏敏度度低低、对对温温度度敏敏感感、不不能能用用于于梯度洗脱；梯度洗脱；偏转式、反射式和干涉型三种；偏转式、反射式和干涉型三种；现在学习的是第21页，共32页d.荧光检测器 对对多多环环芳芳烃烃，维维生生素素B B、黄黄曲曲霉霉素素、卟卟啉啉类类化化合合物物、农农药药、药药物物、氨基酸、甾类化合物等有响

13、应；氨基酸、甾类化合物等有响应；高灵敏度！高选择性！高灵敏度！高选择性！现在学习的是第22页，共32页 高效液相色谱法高效液相色谱法(HPLC)(HPLC)检检测测青蒿素含量青蒿素含量一实验原理一实验原理 HPLCHPLC原理原理：利用：利用样品分子在固定相（填料柱）和流动相之间样品分子在固定相（填料柱）和流动相之间 相互作用力大小不同而实现分离。相互作用力大小不同而实现分离。高压可提高溶质组分移动速度。高压可提高溶质组分移动速度。按溶质组分与固定相之间的作用机理分类：按溶质组分与固定相之间的作用机理分类：吸附分配作用：反相、正相和疏水性色谱；吸附分配作用：反相、正相和疏水性色谱；电荷作用：不

14、同类型的离子交换色谱；电荷作用：不同类型的离子交换色谱；空间排阻作用：凝胶过滤和凝胶渗透色谱；空间排阻作用：凝胶过滤和凝胶渗透色谱；生物特异性作用：亲和色谱。生物特异性作用：亲和色谱。现在学习的是第23页，共32页流动相流动相 极性溶剂极性溶剂 酸性、低离子强度水溶液，加入一定比例的能与水互溶酸性、低离子强度水溶液，加入一定比例的能与水互溶 的有机改性剂，如乙腈、甲醇、异丙醇等有机溶剂的有机改性剂，如乙腈、甲醇、异丙醇等有机溶剂；固定相固定相 非极性填料非极性填料 孔径孔径3030纳米以上的烷基键合硅胶填料：纳米以上的烷基键合硅胶填料：短链烷基（如短链烷基（如C4C4、C8C8和苯基）；长链烷

15、基（如和苯基）；长链烷基（如C18C18、C22C22）烷基的链越长，固定相的疏水性越强，流动相中加入与水烷基的链越长，固定相的疏水性越强，流动相中加入与水 互溶的有机溶剂互溶的有机溶剂，以提高洗脱速度。以提高洗脱速度。反相高效液相色谱反相高效液相色谱（RP-HPLCRP-HPLC）机理：）机理：利用溶质组分与固定相间疏水作用力不同而分离。利用溶质组分与固定相间疏水作用力不同而分离。现在学习的是第24页，共32页流动相流动相 极性溶剂；固定相极性溶剂；固定相 非极性填料非极性填料组分性质组分性质作用力作用力固定相固定相 流动相流动相移动速度移动速度 保留时间保留时间A A组分组分B B组分组分

16、非极性强非极性强非极性弱非极性弱大大 小小小小 大大 慢慢 长长 快快 短短 青蒿素青蒿素 碱性溶液碱性溶液 定量生成定量生成 不饱和酮酸盐不饱和酮酸盐 酸化酸化 稳定的化合物，在稳定的化合物，在260nm260nm处有吸收峰，处有吸收峰，可用高效液相色谱紫外法检测。可用高效液相色谱紫外法检测。现在学习的是第25页，共32页二二.操作方法操作方法溶液配制：溶液配制：1 10.2%NaOH0.2%NaOH溶液溶液 500ml 500ml：称取称取1.00g NaOH 1.00g NaOH 去离子水去离子水 溶解溶解 500ml500ml；2 20.08 mol/L0.08 mol/L醋酸溶液：醋

17、酸溶液：吸取冰醋酸吸取冰醋酸2.30ml 2.30ml 去离子水去离子水 500ml500ml 3 30.01mol/L Na0.01mol/L Na2 2HPOHPO4 4-NaH-NaH2 2POPO4 4 pH7.0 pH7.0缓冲液（流动相）：缓冲液（流动相）：称取称取NaNa2 2HPOHPO4 412H12H2 2O O固体固体1.79g 1.79g 蒸馏水蒸馏水 500ml 500ml 称取称取NaHNaH2 2POPO4 412H12H2 2O O固体固体0.68g 0.68g 蒸馏水蒸馏水 500ml 500ml 混合，调混合，调pH7.0pH7.04.4.1.00mg/ml

18、 1.00mg/ml 青蒿素标准液：青蒿素标准液：精确称取精确称取50.0mg50.0mg青蒿素标准品青蒿素标准品 无水乙醇无水乙醇 50ml50ml（容量瓶）（容量瓶）5.5.样品液：样品液：分别分别精确精确称取青蒿素粗品称取青蒿素粗品5050、100100、150mg150mg于于10ml10ml具塞试管中具塞试管中 无水乙醇无水乙醇5ml5ml 超声波振荡促溶超声波振荡促溶 转移至转移至10ml10ml容量瓶中容量瓶中 无水乙醇无水乙醇 10ml10ml现在学习的是第26页，共32页流动相处理流动相处理:微滤器（膜孔微滤器（膜孔0.22m0.22m）pH7.0pH7.0磷酸缓冲液磷酸缓冲

19、液超声波振荡器脱超声波振荡器脱气气15 min15 minHPLC进样器进样器现在学习的是第27页，共32页10ml具塞试管具塞试管进样液制备：进样液制备：样品液样品液(标准液标准液)1.00ml1.00ml 0.2%NaOH0.2%NaOH溶液溶液4.00ml4.00ml 4545水浴水浴 反应反应30min30min冷水浴冷却至室温冷水浴冷却至室温0.08 mol/L 0.08 mol/L 醋酸醋酸5.00ml5.00ml 针头微滤器针头微滤器(0.20.2m m)注射器注射器吸进样液吸进样液1ml1ml现在学习的是第28页，共32页恒流泵恒流泵A A恒流泵恒流泵B B紫外检紫外检测仪测仪

20、A A液液水相水相B B液液有机相有机相LC-100 LC-100 液相色谱仪液相色谱仪 进样器进样器色谱柱色谱柱现在学习的是第29页，共32页液相色谱仪的启动顺序液相色谱仪的启动顺序：打开排空阀，抽出流打开排空阀，抽出流动相，排除空气动相，排除空气打开高压泵和检测器的打开高压泵和检测器的电源开关，检测器自动电源开关，检测器自动开始自检开始自检启动电脑；插入启动电脑；插入U U盘，盘，软件自动初始化；设软件自动初始化；设置波长。置波长。设置总流量、设置总流量、A A和和B B两两液的比例、泵压、液的比例、泵压、启动泵。启动泵。设置自动停止时间、设置自动停止时间、各项屏显参数、文各项屏显参数、文

21、件名及保存路径。件名及保存路径。先通入流动相冲洗管路先通入流动相冲洗管路系统，基线走直后，进系统，基线走直后，进样样20l20l现在学习的是第30页，共32页HPLC的图形结果l色谱图色谱图(Chromatogram):l 色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图,其纵坐标其纵坐标为信号强度为信号强度,横坐标为时间横坐标为时间色谱峰色谱峰时间时间(分分)基线基线峰高峰高峰宽峰宽响应值响应值现在学习的是第31页，共32页液相色谱图名词术语(1)色谱图名词术语色谱图名词术语:色谱峰色谱峰(Peak):(Peak):色谱柱流出组分通

22、过检测器时产生色谱柱流出组分通过检测器时产生 的响应信号的响应信号峰底峰底(Peak Base):(Peak Base):峰的起点与终点之间连接的直线峰的起点与终点之间连接的直线峰高峰高(Peak Height):(Peak Height):峰最大值到峰底的距离峰最大值到峰底的距离切线峰宽切线峰宽(Peak Width):(Peak Width):在峰两侧拐点处所作切线与在峰两侧拐点处所作切线与 峰底相交两点之间的距离峰底相交两点之间的距离半峰宽半峰宽(Peak Width at Half Height):(Peak Width at Half Height):通过峰高的通过峰高的 中点作平行于峰底的直线中点作平行于峰底的直线,其与峰两其与峰两 侧相交两点之间的距离侧相交两点之间的距离液相色谱图名词术语()现在学习的是第32页，共32页