噬菌体载体.ppt

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1、噬菌体载体噬菌体载体现在学习的是第1页，共56页n n基因工程又称重组基因工程又称重组DNA技术技术n n其实施至少要有四个必要的条件其实施至少要有四个必要的条件 1.工具酶工具酶 2.基因基因 3.载体载体 4.受体细胞受体细胞 （基因工程基因工程基因工程基因工程.静国忠，静国忠，静国忠，静国忠，8585页）页）页）页）现在学习的是第2页，共56页现在学习的是第3页，共56页n n噬菌体定义：噬菌体定义：是一类细菌病毒的总称。是一类细菌病毒的总称。n n噬菌体与质粒的区别噬菌体与质粒的区别*质粒：质粒：仅是一种含有复制起点的裸露的仅是一种含有复制起点的裸露的DNA分分子。子。*噬菌体：噬菌体

2、：DNA分子除了复制起点之外，还有编分子除了复制起点之外，还有编码外壳蛋白质的基因。码外壳蛋白质的基因。(240(240页页页页)现在学习的是第4页，共56页噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒噬菌体或病毒DNADNA 噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率、高特异性噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率、高特异性噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率、高特异性噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率、高特异性噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率、高特异性噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率、高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组地侵染宿主细胞，然后或自主

3、复制繁殖，或整合入宿主基因组地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上述特

4、性使得它们的噬菌体或病毒的上述特性使得它们的噬菌体或病毒的上述特性使得它们的噬菌体或病毒的上述特性使得它们的噬菌体或病毒的上述特性使得它们的噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNADNADNA能被开发成为基因工能被开发成为基因工能被开发成为基因工能被开发成为基因工能被开发成为基因工能被开发成为基因工程的有用载体，因为：程的有用载体，因为：程的有用载体，因为：程的有用载体，因为：程的有用载体，因为：程的有用载体，因为：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；自主复

5、制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增。现在学习的是第5页，共56页第一节第一节 噬菌体的一般生物学特性噬菌体的一般生物学特性n n噬菌体依赖寄主细胞进行生长与增殖。噬菌体依赖寄主细胞进行生长与增殖。1.噬菌体的结构及其核酸类型：噬菌体的结构及其核酸类型：*一般分为三种类型：一般分为三种类型：无尾部结构的二十面体型。无尾部结构的二十面体型。具尾部结构的二十面体型。具尾部结构的二十面体型。线状体型。线状体型。*大多数噬菌体都属于第二种类型。大多数噬菌体

6、都属于第二种类型。(240(240页页页页)现在学习的是第6页，共56页(241(241页页页页)现在学习的是第7页，共56页现在学习的是第8页，共56页1.噬菌体的结构及其核酸类型：噬菌体的结构及其核酸类型：n n噬菌体的核酸：噬菌体的核酸：最常见的是：双链线性最常见的是：双链线性DNA。还有双链环形还有双链环形DNA、单链环形单链环形DNA、单链线形单链线形DNA、单链单链RNA。n n有些噬菌体有些噬菌体DNA碱基不是由标准的碱基不是由标准的A、T、C、G四种碱基组成。四种碱基组成。如如T4噬菌体噬菌体DNA中没有中没有C，取代的是，取代的是5-羟甲羟甲基胞嘧啶（基胞嘧啶（HMC）。）。

7、(240(240页页页页)现在学习的是第9页，共56页1.噬菌体的结构及其核酸类型：噬菌体的结构及其核酸类型：n n常用作基因工程的噬菌体：常用作基因工程的噬菌体：双链噬菌体：双链噬菌体：噬菌体。噬菌体。*野生型野生型噬菌体经过改造，已衍生出噬菌体经过改造，已衍生出100多种多种克隆载体。克隆载体。*目前常用的有：目前常用的有：EMBL系列、系列、gt系列、系列、Charon系列。系列。单链噬菌体：单链噬菌体：M13噬菌体。噬菌体。(刘志国，刘志国，刘志国，刘志国，102-105102-105页）页）页）页）现在学习的是第10页，共56页2.噬菌体的感染性噬菌体的感染性n n一个噬菌体颗粒一个

8、噬菌体颗粒一个噬菌体颗粒一个噬菌体颗粒 感染一个细菌细胞感染一个细菌细胞 迅速形成数百个子代噬菌体颗粒迅速形成数百个子代噬菌体颗粒 每一个子代颗粒又各能够感染一个新的细菌细胞每一个子代颗粒又各能够感染一个新的细菌细胞 再产生出数百个子代颗粒。再产生出数百个子代颗粒。n n如此只要重复四次感染周期，一个噬菌体颗粒便如此只要重复四次感染周期，一个噬菌体颗粒便能够使数十亿个的细菌细胞致死。能够使数十亿个的细菌细胞致死。n n噬菌斑：噬菌斑：感染的细菌细胞被噬菌体裂解之后留下感染的细菌细胞被噬菌体裂解之后留下的空斑。的空斑。n n菌苔（菌苔（lawn）：）：覆盖培养基表面的单层细菌。覆盖培养基表面的单

9、层细菌。(英英英英含遗工词含遗工词含遗工词含遗工词)(241(241页页页页)现在学习的是第11页，共56页2.噬菌体的感染性噬菌体的感染性n n将少量的噬菌体颗粒加入到高浓度的细菌培养物中，并在新形将少量的噬菌体颗粒加入到高浓度的细菌培养物中，并在新形将少量的噬菌体颗粒加入到高浓度的细菌培养物中，并在新形将少量的噬菌体颗粒加入到高浓度的细菌培养物中，并在新形成的子代噬菌体导致寄主细胞发生第一次裂解之前，将此培成的子代噬菌体导致寄主细胞发生第一次裂解之前，将此培成的子代噬菌体导致寄主细胞发生第一次裂解之前，将此培成的子代噬菌体导致寄主细胞发生第一次裂解之前，将此培养物涂布在琼脂平板上，养物涂布

10、在琼脂平板上，养物涂布在琼脂平板上，养物涂布在琼脂平板上，20-30分钟之内，头一批感染的细菌细分钟之内，头一批感染的细菌细分钟之内，头一批感染的细菌细分钟之内，头一批感染的细菌细胞便会发生裂解，释放出子代噬菌体颗粒。胞便会发生裂解，释放出子代噬菌体颗粒。胞便会发生裂解，释放出子代噬菌体颗粒。胞便会发生裂解，释放出子代噬菌体颗粒。n n由于在琼脂平板上长有许多细菌，所以释放出来的噬菌体，便可由于在琼脂平板上长有许多细菌，所以释放出来的噬菌体，便可由于在琼脂平板上长有许多细菌，所以释放出来的噬菌体，便可由于在琼脂平板上长有许多细菌，所以释放出来的噬菌体，便可迅速地吸附到邻近的细菌细胞上，重复发生

11、感染周期。迅速地吸附到邻近的细菌细胞上，重复发生感染周期。迅速地吸附到邻近的细菌细胞上，重复发生感染周期。迅速地吸附到邻近的细菌细胞上，重复发生感染周期。n n此种细菌的裂解反应是以最初被感染的细胞所在的位置为此种细菌的裂解反应是以最初被感染的细胞所在的位置为中心，慢慢地向四周扩展，最后在琼脂平板上形成大量的中心，慢慢地向四周扩展，最后在琼脂平板上形成大量的噬菌斑噬菌斑。(241(241页页页页)现在学习的是第12页，共56页2.噬菌体的感染性噬菌体的感染性噬菌体对寄主细胞的感染作用：噬菌体对寄主细胞的感染作用：噬菌体对寄主细胞的感染作用：噬菌体对寄主细胞的感染作用：n n烈性噬菌体的生命周期

12、：烈性噬菌体的生命周期：烈性噬菌体的生命周期：烈性噬菌体的生命周期：噬菌体同敏感细胞接触，尾部粘到细胞壁上噬菌体同敏感细胞接触，尾部粘到细胞壁上噬菌体同敏感细胞接触，尾部粘到细胞壁上噬菌体同敏感细胞接触，尾部粘到细胞壁上 DNADNA注入到被感染的细菌细胞注入到被感染的细菌细胞注入到被感染的细菌细胞注入到被感染的细菌细胞 噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNA复制复制复制复制 合成出新的头部及尾部蛋白质合成出新的头部及尾部蛋白质合成出新的头部及尾部蛋白质合成出新的头部及尾部蛋白质 组装成子代噬菌体颗粒组装成子代噬菌体颗粒组装成子代噬菌体颗粒组装成子代噬菌体颗粒 寄主细胞壁被破坏并发生溶菌寄主细胞

13、壁被破坏并发生溶菌寄主细胞壁被破坏并发生溶菌寄主细胞壁被破坏并发生溶菌 释放出子代噬菌体颗粒释放出子代噬菌体颗粒释放出子代噬菌体颗粒释放出子代噬菌体颗粒(241(241页页页页)现在学习的是第13页，共56页234234页页页页n n噬菌体：噬菌体：细菌病毒。细菌病毒。n n烈性噬菌体：烈性噬菌体：烈性噬菌体：烈性噬菌体：感染寄主细胞后能进行复制、增殖，最后引起感染寄主细胞后能进行复制、增殖，最后引起细胞裂解的噬菌体。细胞裂解的噬菌体。只有溶菌生长周期的噬菌体。只有溶菌生长周期的噬菌体。只有溶菌生长周期的噬菌体。只有溶菌生长周期的噬菌体。n n温和性噬菌体（溶原性噬菌体）：温和性噬菌体（溶原性

14、噬菌体）：温和性噬菌体（溶原性噬菌体）：温和性噬菌体（溶原性噬菌体）：感染细菌后能使细菌产生感染细菌后能使细菌产生溶原性的噬菌体。溶原性的噬菌体。既能进入溶菌生命周期又能进入溶原生命既能进入溶菌生命周期又能进入溶原生命既能进入溶菌生命周期又能进入溶原生命既能进入溶菌生命周期又能进入溶原生命周期的噬菌体。周期的噬菌体。周期的噬菌体。周期的噬菌体。n n溶原性：溶原性：溶原性：溶原性：温和噬菌体感染细胞形成原噬菌体的过程。温和噬菌体感染细胞形成原噬菌体的过程。n n原噬菌体：原噬菌体：在溶原性细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体在溶原性细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体在溶原性细菌内存在的整合的或非

15、整合的噬菌体在溶原性细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体DNADNA。n n溶原性细菌：溶原性细菌：溶原性细菌：溶原性细菌：细胞中含有以原噬菌体状态存在着的温和噬菌体细胞中含有以原噬菌体状态存在着的温和噬菌体细胞中含有以原噬菌体状态存在着的温和噬菌体细胞中含有以原噬菌体状态存在着的温和噬菌体的细菌。的细菌。的细菌。的细菌。n n噬菌斑：噬菌斑：噬菌斑：噬菌斑：在含细菌的固体培养基上，噬菌体使细菌细胞裂在含细菌的固体培养基上，噬菌体使细菌细胞裂解而形成的空斑。解而形成的空斑。现在学习的是第14页，共56页3.噬菌体的溶菌生命周期噬菌体的溶菌生命周期噬菌体的生命周期分为：噬菌体的生命周期分为：n n

16、溶菌周期。溶菌周期。n n溶源周期。溶源周期。两种类型的噬菌体：两种类型的噬菌体：n n烈性噬菌体：只有溶菌周期。烈性噬菌体：只有溶菌周期。n n温和噬菌体：具有溶源周期的噬菌体。温和噬菌体：具有溶源周期的噬菌体。(242(242页页页页)现在学习的是第15页，共56页3.噬菌体的溶菌生命周期噬菌体的溶菌生命周期基本过程为：基本过程为：（1）吸附：）吸附：噬菌体颗粒吸附到细胞表面的特殊接受器上。噬菌体颗粒吸附到细胞表面的特殊接受器上。（2）注入：）注入：）注入：）注入：噬菌体噬菌体DNADNA穿过细胞壁注入寄主细胞。穿过细胞壁注入寄主细胞。（3 3）转变：）转变：）转变：）转变：被感染的细菌成

17、为制造噬菌体颗粒的场所。被感染的细菌成为制造噬菌体颗粒的场所。（4 4）合成：）合成：）合成：）合成：功能发生了转变的寄主细胞合成噬菌体的核酸和蛋白功能发生了转变的寄主细胞合成噬菌体的核酸和蛋白功能发生了转变的寄主细胞合成噬菌体的核酸和蛋白功能发生了转变的寄主细胞合成噬菌体的核酸和蛋白质。质。质。质。（5）组装：）组装：包装了包装了包装了包装了DNA的头部和尾部组装成噬菌体颗粒。的头部和尾部组装成噬菌体颗粒。（6）释放：）释放：新合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来。新合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来。新合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来。新合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释

18、放出来。(242(242页页页页)现在学习的是第16页，共56页(242(242页页页页)现在学习的是第17页，共56页4.噬菌体的溶源生命周期噬菌体的溶源生命周期n n温和噬菌体温和噬菌体感染寄主细胞之后出现的溶源周期中，感染寄主细胞之后出现的溶源周期中，不会产生出子代噬菌体颗粒，寄主的细菌细胞仍不会产生出子代噬菌体颗粒，寄主的细菌细胞仍然存活着并继续进行细胞分裂。然存活着并继续进行细胞分裂。n n经过了许多世代经过了许多世代之后，如果环境条件正常的话，之后，如果环境条件正常的话，溶源周期便会终止，重新开始溶菌生命周期。溶源周期便会终止，重新开始溶菌生命周期。n n寄主细菌会因裂解而致死，寄

19、主细菌会因裂解而致死，释放出许多子代噬菌释放出许多子代噬菌体颗粒。体颗粒。(243(243页页页页)现在学习的是第18页，共56页234234页页页页n n噬菌体：噬菌体：细菌病毒。细菌病毒。n n烈性噬菌体：烈性噬菌体：感染寄主细胞后能进行复制、增殖，最后引起感染寄主细胞后能进行复制、增殖，最后引起感染寄主细胞后能进行复制、增殖，最后引起感染寄主细胞后能进行复制、增殖，最后引起细胞裂解的噬菌体。细胞裂解的噬菌体。细胞裂解的噬菌体。细胞裂解的噬菌体。只有溶菌生长周期的噬菌体。只有溶菌生长周期的噬菌体。只有溶菌生长周期的噬菌体。只有溶菌生长周期的噬菌体。n n温和性噬菌体（溶原性噬菌体）：温和性

20、噬菌体（溶原性噬菌体）：温和性噬菌体（溶原性噬菌体）：温和性噬菌体（溶原性噬菌体）：感染细菌后能使细菌产生感染细菌后能使细菌产生溶原性的噬菌体。溶原性的噬菌体。既能进入溶菌生命周期又能进入溶原生既能进入溶菌生命周期又能进入溶原生命周期的噬菌体。命周期的噬菌体。n n溶原性：溶原性：溶原性：溶原性：温和噬菌体感染细胞形成原噬菌体的过程。温和噬菌体感染细胞形成原噬菌体的过程。n n原噬菌体：原噬菌体：原噬菌体：原噬菌体：在溶原性细菌内存在的整合的或非整合的噬菌在溶原性细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体体DNA。n n溶原性细菌：溶原性细菌：溶原性细菌：溶原性细菌：细胞中含有以原噬菌体状态存在着的温

21、和噬菌体细胞中含有以原噬菌体状态存在着的温和噬菌体细胞中含有以原噬菌体状态存在着的温和噬菌体细胞中含有以原噬菌体状态存在着的温和噬菌体的细菌。的细菌。的细菌。的细菌。n n噬菌斑：噬菌斑：噬菌斑：噬菌斑：在含细菌的固体培养基上，噬菌体使细菌细胞裂在含细菌的固体培养基上，噬菌体使细菌细胞裂解而形成的空斑。解而形成的空斑。、若干基本概念、若干基本概念现在学习的是第19页，共56页4.噬菌体的溶源生命周期噬菌体的溶源生命周期、溶源周期的主要特征溶源周期的主要特征（以（以（以（以 噬菌体为原型）：噬菌体为原型）：噬菌体为原型）：噬菌体为原型）：（1）噬菌体的噬菌体的DNA分子注入细菌细胞。分子注入细菌

22、细胞。（2）经过短暂的转录。经过短暂的转录。（3）噬菌体的噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组分子插入到细菌染色体基因组DNA上，变成原噬菌体。上，变成原噬菌体。（4）细菌继续生长、增殖，噬菌体的基因作为细细菌继续生长、增殖，噬菌体的基因作为细菌染色体的一部分进行复制。菌染色体的一部分进行复制。(243(243页页页页)现在学习的是第20页，共56页(244(244页页页页)现在学习的是第21页，共56页4.噬菌体的溶源生命周期噬菌体的溶源生命周期n n另一种类型的溶源周期另一种类型的溶源周期是以噬菌体是以噬菌体T1为原为原型。比较少见。型。比较少见。n n基本特征是：基本特征是：不存在噬

23、菌体不存在噬菌体DNA分子的整分子的整合作用体系，而是变成了一种进行独立复制合作用体系，而是变成了一种进行独立复制的环形的质粒的环形的质粒DNA分子。分子。(244(244页页页页)现在学习的是第22页，共56页4.噬菌体的溶源生命周期噬菌体的溶源生命周期、超感染免疫性：、超感染免疫性：n n溶源性细菌有两个重要特点：溶源性细菌有两个重要特点：（1）超感染免疫性：）超感染免疫性：溶源性细菌不能够被头一次溶源性细菌不能够被头一次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染。溶源性感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染。溶源性这种抗御同种噬菌体再感染的特性，叫做超感染这种抗御同种噬菌体再感染的特性，叫做超感染免

24、疫性。免疫性。（2）溶源性细菌的诱发：）溶源性细菌的诱发：经过许多世代之后，溶经过许多世代之后，溶源性的细菌便能够开始进入溶菌周期。源性的细菌便能够开始进入溶菌周期。(245(245页页页页)现在学习的是第23页，共56页5.重组噬菌体的分离重组噬菌体的分离外源外源外源外源DNADNA片段片段+噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNA分子分子分子分子 重组的噬菌体重组的噬菌体重组的噬菌体重组的噬菌体DNA分子感染寄主细胞分子感染寄主细胞 用用32P P标记的探针做噬菌斑放射自显影杂交标记的探针做噬菌斑放射自显影杂交标记的探针做噬菌斑放射自显影杂交标记的探针做噬菌斑放射自显影杂交 获得阳性克隆获得阳性克隆

25、获得阳性克隆获得阳性克隆 分离大量的重组体噬菌体分离大量的重组体噬菌体分离大量的重组体噬菌体分离大量的重组体噬菌体DNADNA，实现克隆基因的扩增实现克隆基因的扩增(247(247页页页页)现在学习的是第24页，共56页5.重组噬菌体的分离重组噬菌体的分离接种针粘取噬菌体颗粒接种针粘取噬菌体颗粒 新鲜的细菌培养基中新鲜的细菌培养基中新鲜的细菌培养基中新鲜的细菌培养基中 在细胞内大量增殖在细胞内大量增殖在细胞内大量增殖在细胞内大量增殖 氯化铯密度梯度离心氯化铯密度梯度离心氯化铯密度梯度离心氯化铯密度梯度离心（噬菌体介于纯（噬菌体介于纯（噬菌体介于纯（噬菌体介于纯DNADNA与纯蛋白质之间）与纯蛋

26、白质之间）与纯蛋白质之间）与纯蛋白质之间）纯化重组体噬菌体纯化重组体噬菌体纯化重组体噬菌体纯化重组体噬菌体DNADNA(247(247页页页页)现在学习的是第25页，共56页(248(248页页页页)现在学习的是第26页，共56页第二节第二节 噬菌体载体噬菌体载体n n噬菌体：噬菌体：噬菌体：噬菌体：*分子量为分子量为分子量为分子量为31 x 106 dal。*中等大小的温和噬菌体。中等大小的温和噬菌体。*已定位的基因至少有已定位的基因至少有6161个。个。一半左右为必要基因：参与生命周期的活动。一半左右为必要基因：参与生命周期的活动。一半左右为必要基因：参与生命周期的活动。一半左右为必要基因

27、：参与生命周期的活动。另一部分为非必要基因：被外源基因取代后，不影响另一部分为非必要基因：被外源基因取代后，不影响噬菌体的生命功能。噬菌体的生命功能。n n人人们们可可以以根根据据需需要要改改变变l l l l-DNA或或宿宿主主细细胞胞的的性性质质，使使噬噬菌菌体或处于体或处于溶源状态溶源状态溶源状态溶源状态，或处于，或处于，或处于，或处于溶菌状态溶菌状态。（张。（张。（张。（张)n nDNADNA重组技术一般需要重组技术一般需要l l噬菌体进入溶菌状态。噬菌体进入溶菌状态。噬菌体进入溶菌状态。噬菌体进入溶菌状态。(张张张张)(248(248页页页页)现在学习的是第27页，共56页噬菌体：噬

28、菌体：n n作为基因克隆载体的一个重要特性：作为基因克隆载体的一个重要特性：由外源基因取代非必要基因所形成的重组噬由外源基因取代非必要基因所形成的重组噬菌体菌体DNA，可以随着寄主大肠杆菌细胞一，可以随着寄主大肠杆菌细胞一道复制和增殖，而且在其溶源周期中，它们道复制和增殖，而且在其溶源周期中，它们的的DNA是整合在大肠杆菌的染色体是整合在大肠杆菌的染色体DNA上，上，成为后者的一个组成部分。成为后者的一个组成部分。(249(249页页页页)现在学习的是第28页，共56页1.噬菌体的分子生物学概述噬菌体的分子生物学概述（1 1）基因组的结构：）基因组的结构：n n碱基对数：碱基对数：485024

29、8502。n ncoscos位点：位点：位点：位点：线性双链线性双链线性双链线性双链DNADNA分子的两端各有一条由分子的两端各有一条由分子的两端各有一条由分子的两端各有一条由1212个核苷酸组个核苷酸组成的彼此完全互补的成的彼此完全互补的5 5 单链突出序列，即粘性末端。单链突出序列，即粘性末端。单链突出序列，即粘性末端。单链突出序列，即粘性末端。注入到感注入到感染寄主细胞内的染寄主细胞内的 噬菌体的线性噬菌体的线性DNA分子，会迅速地通过分子，会迅速地通过粘性末端之间的互补作用，形成双链粘性末端之间的互补作用，形成双链DNA分子。随后在分子。随后在DNADNA连接酶的作用下，将相邻的连接酶

30、的作用下，将相邻的连接酶的作用下，将相邻的连接酶的作用下，将相邻的5-P5-P和和3-OH3-OH基团封闭起来，基团封闭起来，并进一步超盘旋化。并进一步超盘旋化。由这种粘性末端结合形成的双链区称为由这种粘性末端结合形成的双链区称为由这种粘性末端结合形成的双链区称为由这种粘性末端结合形成的双链区称为coscos位点。位点。n ncoscos位点：位点：位点：位点：噬菌体线性双链噬菌体线性双链噬菌体线性双链噬菌体线性双链DNADNA分子的两端各分子的两端各分子的两端各分子的两端各12个完全互补个完全互补的核苷酸粘性末端结合形成的双链区。的核苷酸粘性末端结合形成的双链区。（在包装进蛋白质外壳之前，（

31、在包装进蛋白质外壳之前，（在包装进蛋白质外壳之前，（在包装进蛋白质外壳之前，DNADNA在在在在coscos位点切开成线性）位点切开成线性）位点切开成线性）位点切开成线性）(249(249页页页页)现在学习的是第29页，共56页(250(250页页页页)现在学习的是第30页，共56页噬菌体基因组的三个区域噬菌体基因组的三个区域n n左侧区：左侧区：包括参与噬菌体头部蛋白质和尾部蛋白包括参与噬菌体头部蛋白质和尾部蛋白质合成所需要的全部基因。质合成所需要的全部基因。n n中间区：中间区：又称为非必要区。包括与重组以及使噬又称为非必要区。包括与重组以及使噬菌体整合到大肠杆菌染色体中去的菌体整合到大肠

32、杆菌染色体中去的int基因，和把基因，和把原噬菌体从寄主染色体上删除下来的原噬菌体从寄主染色体上删除下来的xis基因。基因。n n右侧区：右侧区：包括全部主要的调控成份，噬菌体的复包括全部主要的调控成份，噬菌体的复制基因以及溶菌基因。制基因以及溶菌基因。(249(249页页页页)现在学习的是第31页，共56页(250(250页页页页)现在学习的是第32页，共56页（2）噬菌体噬菌体DNA的复制的复制n n在在噬菌体感染的噬菌体感染的早期早期，环形的，环形的DNA分子按分子按形形式式从双向进行复制。从双向进行复制。n n到了到了晚期晚期，控制，控制滚环复制滚环复制机理的开关被启动了，机理的开关被

33、启动了，合成出由一系列线性排列的合成出由一系列线性排列的基因组基因组DNA组成的组成的长多连体分子长多连体分子。n n多连体分子经过核酸酶的切割作用，从多连体分子经过核酸酶的切割作用，从cos位点位点将它分离成将它分离成单体分子单体分子之后，才能够包装。之后，才能够包装。(251(251页页页页)现在学习的是第33页，共56页在电子显微镜下观察正在复制的在电子显微镜下观察正在复制的DNA，复制的区域如一只眼睛复制的区域如一只眼睛（张玉静，（张玉静，（张玉静，（张玉静，101101）现在学习的是第34页，共56页（张玉静，（张玉静，（张玉静，（张玉静，141141）现在学习的是第35页，共56页

34、（张玉静，（张玉静，（张玉静，（张玉静，141141）现在学习的是第36页，共56页2.噬菌体载体的构建及其主要类型噬菌体载体的构建及其主要类型（1）构建的基本原理：）构建的基本原理：野生型野生型噬菌体噬菌体DNA，一，一种酶的酶切位点多。不适合作基因克隆的载体。种酶的酶切位点多。不适合作基因克隆的载体。基本原理：删除多余限制位点。基本原理：删除多余限制位点。n n构建的构建的噬菌体的派生载体：噬菌体的派生载体：*插入型载体：插入型载体：只具有一个可供外源只具有一个可供外源DNA插入的插入的克隆位点。也有一些具有两个克隆位点，但彼此克隆位点。也有一些具有两个克隆位点，但彼此靠近。靠近。*替换型

35、载体：替换型载体：具有成对的克隆位点，在这两个位具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的点之间的DNA区段可以被外源插入的区段可以被外源插入的DNA片段片段所取代。所取代。(253(253页页页页)现在学习的是第37页，共56页n n插入型载体：插入型载体：只能承受较小分子量只能承受较小分子量(一般在一般在10kb以内以内)的外源的外源DNA片段的插入，广泛用片段的插入，广泛用于于cDNA及小片段及小片段DNA的克隆。的克隆。n n替换型载体：替换型载体：可承受较大分子量的外源可承受较大分子量的外源DNA片段的插入，适用于克隆高等真核生片段的插入，适用于克隆高等真核生物的染色体。物的染色体。(2

36、55(255页页页页)现在学习的是第38页，共56页（2）噬菌体载体的主要类型噬菌体载体的主要类型、插入型载体：、插入型载体：n n插入失活效应：外源的插入失活效应：外源的DNA 克隆到插入型的克隆到插入型的噬噬菌体载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧菌体载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力。失效力。n n免疫功能失活的插入型载体：免疫功能失活的插入型载体：在基因组的免疫区在基因组的免疫区中插入外源中插入外源DNA片段，载体所具有的合成活性片段，载体所具有的合成活性阻遏物的功能遭受破坏，而不能进入溶源周期。阻遏物的功能遭受破坏，而不能进入溶源周期。只能形成清晰的噬菌斑。只能形成清晰的

37、噬菌斑。*有外源有外源DNA插入：插入：清晰的噬菌斑。清晰的噬菌斑。*没有外源没有外源DNA插入：插入：亲本噬菌体可以进入溶源亲本噬菌体可以进入溶源状态，形成状态，形成浑浊的噬菌斑。浑浊的噬菌斑。n n-半乳糖苷酶失活的插入型载体：（半乳糖苷酶失活的插入型载体：（下页）下页）(255(255页页页页)现在学习的是第39页，共56页-半乳糖苷酶失活的插入型载体：半乳糖苷酶失活的插入型载体：n n这类载体的基因组中含有一个大肠杆菌的这类载体的基因组中含有一个大肠杆菌的lac5lac5区段，其中有区段，其中有区段，其中有区段，其中有编码编码编码编码-半乳糖苷酶半乳糖苷酶的基因的基因lacZlacZ。

38、n n这种载体感染的大肠杆菌这种载体感染的大肠杆菌这种载体感染的大肠杆菌这种载体感染的大肠杆菌laclac-指示菌，涂布在加有指示菌，涂布在加有指示菌，涂布在加有指示菌，涂布在加有IPTGIPTG和和Xgal的培养基平板上，会形成的培养基平板上，会形成的培养基平板上，会形成的培养基平板上，会形成蓝色的噬菌斑蓝色的噬菌斑蓝色的噬菌斑蓝色的噬菌斑。n n如果如果外源外源DNA插入到插入到lac5区段上，阻断了区段上，阻断了-半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶半乳糖苷酶基基因因lacZlacZ的编码序列，那么由这种的编码序列，那么由这种 重组体感染的重组体感染的lac-指示菌，指示菌，指示菌，指示菌，由

39、于不能合成由于不能合成由于不能合成由于不能合成-半乳糖苷酶，只能形成半乳糖苷酶，只能形成半乳糖苷酶，只能形成半乳糖苷酶，只能形成无色的噬菌斑。无色的噬菌斑。n n如使用大肠杆菌如使用大肠杆菌如使用大肠杆菌如使用大肠杆菌Lac+指示菌，无论有无外源指示菌，无论有无外源DNADNA插入，都形插入，都形插入，都形插入，都形成成成成蓝色噬菌斑蓝色噬菌斑。n n可以应用可以应用Xgal-IPTG显色技术检测转化子。显色技术检测转化子。(256(256页页页页)现在学习的是第40页，共56页n n具有功能活性的具有功能活性的具有功能活性的具有功能活性的-半乳糖苷酶半乳糖苷酶是四聚体。是四聚体。n nXga

40、l（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside-D-galactoside)：无色化合物。：无色化合物。：无色化合物。：无色化合物。-半乳半乳半乳半乳糖苷酶能将无色的糖苷酶能将无色的糖苷酶能将无色的糖苷酶能将无色的XgalXgal切割成切割成半乳糖半乳糖和和深蓝色深蓝色的底物的底物的底物的底物5-5-溴溴溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝。因此，。因此，。因此，。因此，Xgal可作为检测可作为检测-半乳糖苷酶的一种指示剂。半乳糖苷酶的一种指示剂。半乳糖苷酶的一种指示剂。半乳糖苷酶的一种指示剂。n nIPTG：一种含

41、硫的乳糖类似物。在不存在底物乳糖的条一种含硫的乳糖类似物。在不存在底物乳糖的条件下，它可以诱导细胞合成件下，它可以诱导细胞合成-半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。称称IPTG为为为为-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的安慰安慰诱导物诱导物诱导物诱导物。乳糖诱导物乳糖诱导物IPTGIPTG（372页）页）Xgal-IPTG显色反应显色反应（285285页）页）页）页）现在学习的是第41页，共56页(257(257页页页页)现在学习的是第42页，共56页、替换型载体、替换型载体n n又叫取代型载体。又叫取代型载体。n n在其中央部分有一个可以被外源在其中央部分有一个可以被外源DNA分子所取代分

42、子所取代的的DNA片段的克隆载体。片段的克隆载体。n n安排在中间可取代片段两侧的安排在中间可取代片段两侧的多克隆位点多克隆位点是反向是反向重复排列，当外源重复排列，当外源DNA插入时，一对克隆位点插入时，一对克隆位点之间的之间的DNA片段便会被置换掉，从而有效地提片段便会被置换掉，从而有效地提高了克隆外源高了克隆外源DNA片段的能力。片段的能力。(256(256页页页页)现在学习的是第43页，共56页(257(257页页页页)现在学习的是第44页，共56页、替换型载体、替换型载体n n例子：例子：M.Thomas等人（等人（1974）发展的）发展的gtc，可可处于稳定的溶源状态，产生浑浊型的

43、噬菌斑。处于稳定的溶源状态，产生浑浊型的噬菌斑。可可取代部分被取代之后，不能进入溶源状态，形成取代部分被取代之后，不能进入溶源状态，形成清晰型的噬菌斑。清晰型的噬菌斑。(256(256页页页页)现在学习的是第45页，共56页用替换型载体克隆外源用替换型载体克隆外源DNA片段包括三个步骤片段包括三个步骤n n第一：第一：应用适当的核酸内切限制酶消化应用适当的核酸内切限制酶消化载体，载体，除去基因组中可取代的除去基因组中可取代的DNA区段。区段。n n第二：第二：将所得的将所得的DNA臂同外源臂同外源DNA片段连接。片段连接。n n第三：第三：对重组的对重组的DNA分子进行包装和增殖，以分子进行包

44、装和增殖，以得到有感染性的得到有感染性的重组噬菌体。重组噬菌体。(258(258页页页页)现在学习的是第46页，共56页（3）凯伦噬菌体载体）凯伦噬菌体载体n n有插入型（如凯伦有插入型（如凯伦2）、替换型（如凯伦）、替换型（如凯伦30）。）。基本都含有基本都含有-半乳糖苷酶基因。半乳糖苷酶基因。n n使用凯伦载体的一般程序：使用凯伦载体的一般程序：用限制酶酶切载体用限制酶酶切载体产生左臂、中央区段、右臂，并分离产生左臂、中央区段、右臂，并分离两臂与外源两臂与外源DNA连接连接 包装成具感染能力的噬菌体颗粒包装成具感染能力的噬菌体颗粒涂布在敏感细菌平板上（含有涂布在敏感细菌平板上（含有Xgal

45、）有外源有外源DNA插入的噬菌体，形成无色噬菌斑，插入的噬菌体，形成无色噬菌斑，没有插入的噬菌体，形成蓝色噬菌斑没有插入的噬菌体，形成蓝色噬菌斑现在学习的是第47页，共56页(253(253页页页页)现在学习的是第48页，共56页3.噬菌体的改良噬菌体的改良n nSpiSpi+表型的噬菌体：表型的噬菌体：表型的噬菌体：表型的噬菌体：野生型野生型噬菌体有噬菌体有噬菌体有噬菌体有red和和和和gam基因。不基因。不基因。不基因。不能在能在能在能在P2噬菌体溶源性细菌中生长，其表型为噬菌体溶源性细菌中生长，其表型为噬菌体溶源性细菌中生长，其表型为噬菌体溶源性细菌中生长，其表型为SpiSpi+（sen

46、sitive of P2 inhibition）。即对）。即对）。即对）。即对P2噬菌体的抑制作用噬菌体的抑制作用噬菌体的抑制作用噬菌体的抑制作用呈敏感反应。呈敏感反应。呈敏感反应。呈敏感反应。n nSpi-表型的噬菌体：表型的噬菌体：表型的噬菌体：表型的噬菌体：噬菌体丧失掉了噬菌体丧失掉了噬菌体丧失掉了噬菌体丧失掉了red和和gamgam基因，例如基因，例如被外源被外源DNADNA所取代，这样的噬菌体则获得了所取代，这样的噬菌体则获得了所取代，这样的噬菌体则获得了所取代，这样的噬菌体则获得了Spi-的表型，的表型，能够在噬菌体能够在噬菌体P2溶源性的大肠杆菌细胞中生长并形成溶源性的大肠杆菌细

47、胞中生长并形成噬菌斑。噬菌斑。n n在应用具有在应用具有redred和和gamgam基因的替换型载体作基因克隆实验中，基因的替换型载体作基因克隆实验中，基因的替换型载体作基因克隆实验中，基因的替换型载体作基因克隆实验中，可以按照可以按照SpiSpi特性来选择重组体。特性来选择重组体。n nSp-表型提供了一个正选择记号。表型提供了一个正选择记号。(260(260页页页页)现在学习的是第49页，共56页4.噬菌体的体外包装噬菌体的体外包装（1）重组体重组体重组体重组体DNADNA分子的转染作用分子的转染作用分子的转染作用分子的转染作用n n应用应用DNA重组技术，把带有目的基因的外源重组技术，把

48、带有目的基因的外源DNA插入到插入到载体之后，还要将这些重组载体之后，还要将这些重组DNA分分子导入寄主细胞。子导入寄主细胞。n n应用体外包装技术，把重组应用体外包装技术，把重组DNA分子包装成成熟分子包装成成熟的噬菌体颗粒，从而能够按照正常的噬菌体感染的噬菌体颗粒，从而能够按照正常的噬菌体感染过程导入寄主细胞。结果明显地提高了过程导入寄主细胞。结果明显地提高了重组体重组体DNA的转染效率，可达的转染效率，可达107左右。左右。（每微克（每微克（每微克（每微克 DNADNA转染产转染产转染产转染产生的噬菌斑数目）生的噬菌斑数目）生的噬菌斑数目）生的噬菌斑数目）(266(266页页页页)现在学

49、习的是第50页，共56页（2）DNA的体外包装的体外包装n n在正常的在正常的 噬菌体的生长期间，寄主细胞内要进行特殊的噬菌体的生长期间，寄主细胞内要进行特殊的噬菌体的生长期间，寄主细胞内要进行特殊的噬菌体的生长期间，寄主细胞内要进行特殊的包装包装反应反应。n n作为包装反应的底物，即按照滚环复制机理合成的作为包装反应的底物，即按照滚环复制机理合成的作为包装反应的底物，即按照滚环复制机理合成的作为包装反应的底物，即按照滚环复制机理合成的多连体形式多连体形式的的DNADNA，在具备噬菌体头部前体和，在具备噬菌体头部前体和A A基因产物的条件下，基因产物的条件下，会会从从coscos位点处被切割成

50、位点处被切割成位点处被切割成位点处被切割成 DNADNA单体分子单体分子。n n这种线形的分子适于包装，很快就被装填到头部外壳里边，这种线形的分子适于包装，很快就被装填到头部外壳里边，而且由于它具有而且由于它具有12bp长的粘性末端，所以又会长的粘性末端，所以又会重新环化起重新环化起来。来。n n在基因在基因在基因在基因DD、基因、基因、基因、基因WW和和和和F F产物的存在下，产物的存在下，最终形成成熟的最终形成成熟的 噬噬噬噬菌体颗粒。菌体颗粒。菌体颗粒。菌体颗粒。(267(267页页页页)现在学习的是第51页，共56页(267(267页页页页)现在学习的是第52页，共56页（2）DNA的