动物细胞表达制备药用蛋白讲稿.ppt

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1、关于动物细胞表达制备药用蛋白第一页，讲稿共二十五页哦思考要制备出我们想要的蛋白，需要了解些什么，做些什么？第二页，讲稿共二十五页哦 生产用动物细胞的要求和获得生产用动物细胞的要求和获得 常用生产用动物细胞的特性常用生产用动物细胞的特性 基因工程细胞构建和筛选基因工程细胞构建和筛选第三页，讲稿共二十五页哦 生产用动物细胞的要求和获得生产用动物细胞的要求和获得生产用动物细胞的要求和获得生产用动物细胞的要求和获得（1 1 1 1）原代细胞原代细胞原代细胞原代细胞是直接取自动物组织器官是直接取自动物组织器官是直接取自动物组织器官是直接取自动物组织器官,经过消化分离而获得。经过消化分离而获得。经过消化分

2、离而获得。经过消化分离而获得。用量大，浪费时间。用量大，浪费时间。用量大，浪费时间。用量大，浪费时间。常用的有：常用的有：常用的有：常用的有：鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞等。鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞等。鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞等。鸡胚细胞、原代兔肾细胞、鼠肾细胞等。NO.1第四页，讲稿共二十五页哦（2 2 2 2）二倍体细胞系）二倍体细胞系）二倍体细胞系）二倍体细胞系原代细胞经过传代筛选克隆，挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。原代细胞经过传代筛选克隆，挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。原代细胞经过传代筛选克隆，挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。原代细胞经过传代筛

3、选克隆，挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。二倍体细胞有正常细胞的特点：二倍体细胞有正常细胞的特点：二倍体细胞有正常细胞的特点：二倍体细胞有正常细胞的特点：染色体组型是染色体组型是染色体组型是染色体组型是2n2n2n2n核型；核型；核型；核型；贴壁依赖接触抑制；贴壁依赖接触抑制；贴壁依赖接触抑制；贴壁依赖接触抑制；可传代培养可传代培养可传代培养可传代培养50505050代；代；代；代；无致瘤性。无致瘤性。无致瘤性。无致瘤性。第五页，讲稿共二十五页哦（3 3 3 3）转化细胞系）转化细胞系）转化细胞系）转化细胞系 常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获常由于染色体断裂变成异倍体，失

4、去正常细胞特点，而获常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。得无限增殖能力。得无限增殖能力。得无限增殖能力。自发自发自发自发 人工诱变人工诱变人工诱变人工诱变第六页，讲稿共二十五页哦常用生产用动物细胞的特性常用生产用动物细胞的特性 W1-38W1-38：正常胚肺组织人二倍体细胞系。正常胚肺组织人二倍体细胞系。正常胚肺组织人二倍体细胞系。正常胚肺组织人二倍体细胞系。核型为核型为核型为核型为2n=462n=46。成纤维细胞，能产生胶原，培养基用。成纤维细胞，能产生胶原，培养基用。成纤维细胞，能产生胶原，培养基用。成纤维细胞

5、，能产生胶原，培养基用BME BME （Eagle Eagle Basal mediumBasal medium）。）。）。）。10%10%小牛血清，小牛血清，小牛血清，小牛血清，pH7.2,pH7.2,倍增时间为倍增时间为倍增时间为倍增时间为24h24h，有限寿命，有限寿命，有限寿命，有限寿命5050代。代。代。代。安全，用于制备疫苗。安全，用于制备疫苗。安全，用于制备疫苗。安全，用于制备疫苗。NO.2第七页，讲稿共二十五页哦MRC-5MRC-5：从正常男性肺组织中获得的人二倍体细胞系。：从正常男性肺组织中获得的人二倍体细胞系。：从正常男性肺组织中获得的人二倍体细胞系。：从正常男性肺组织中获

6、得的人二倍体细胞系。核型为核型为核型为核型为2n=462n=46。属成纤属成纤属成纤属成纤维细胞。维细胞。维细胞。维细胞。有限寿命有限寿命有限寿命有限寿命42424646代。增殖速度较代。增殖速度较代。增殖速度较代。增殖速度较W1-38W1-38快，对不良环境敏感性较快，对不良环境敏感性较快，对不良环境敏感性较快，对不良环境敏感性较W1-38W1-38低。对低。对低。对低。对人的病毒敏感。用于生产疫苗。人的病毒敏感。用于生产疫苗。人的病毒敏感。用于生产疫苗。人的病毒敏感。用于生产疫苗。第八页，讲稿共二十五页哦BHK-21BHK-21:从从从从5 5只无性别的生长只无性别的生长只无性别的生长只无

7、性别的生长1 1天的地鼠幼鼠肾脏中分离的天的地鼠幼鼠肾脏中分离的天的地鼠幼鼠肾脏中分离的天的地鼠幼鼠肾脏中分离的;成纤维样细胞成纤维样细胞成纤维样细胞成纤维样细胞,核型核型核型核型为为为为2n=44;2n=44;培养基为培养基为培养基为培养基为DMEMDMEM加加加加7%7%胎牛血清。胎牛血清。胎牛血清。胎牛血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，现已用于工程用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，现已用于工程用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，现已用于工程用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，

8、现已用于工程细胞构建。细胞构建。细胞构建。细胞构建。第九页，讲稿共二十五页哦VeroVero：从正常成年非洲绿猴肾脏分离的。为贴壁依赖的成纤维细胞，：从正常成年非洲绿猴肾脏分离的。为贴壁依赖的成纤维细胞，：从正常成年非洲绿猴肾脏分离的。为贴壁依赖的成纤维细胞，：从正常成年非洲绿猴肾脏分离的。为贴壁依赖的成纤维细胞，核型核型核型核型2n=602n=60；培养基为；培养基为；培养基为；培养基为199199培养基，加培养基，加培养基，加培养基，加5%5%胎牛血清；胎牛血清；胎牛血清；胎牛血清；用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰质炎、狂犬病毒。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰质炎、狂犬病毒。用于增殖

9、病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰质炎、狂犬病毒。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰质炎、狂犬病毒。第十页，讲稿共二十五页哦基因工程细胞构建和筛选基因工程细胞构建和筛选NO.3真核细胞基因表达载体的构建真核细胞基因表达载体的构建真核细胞基因表达载体的构建真核细胞基因表达载体的构建使用的载体有两类：使用的载体有两类：使用的载体有两类：使用的载体有两类：1 1）病毒载体病毒载体病毒载体病毒载体 牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、牛痘病毒、腺病毒、逆转录病毒、杆状病毒杆状病毒杆状病毒杆状病毒2 2）质粒载体质粒载体质粒载体质粒载体第十一页，讲稿共二十五

10、页哦 1 1）病毒载体病毒载体病毒载体病毒载体 牛痘病毒牛痘病毒牛痘病毒牛痘病毒：用构建多价疫苗：用构建多价疫苗：用构建多价疫苗：用构建多价疫苗 腺病毒、逆转录病毒腺病毒、逆转录病毒腺病毒、逆转录病毒腺病毒、逆转录病毒：用于基因治疗。：用于基因治疗。：用于基因治疗。：用于基因治疗。杆状病毒：杆状病毒：杆状病毒：杆状病毒：用于外源基因表达用于外源基因表达用于外源基因表达用于外源基因表达。第十二页，讲稿共二十五页哦2 2）质粒载体）质粒载体）质粒载体）质粒载体 在细菌和哺乳动物细胞体内都能扩增。都含有如下基本成分：在细菌和哺乳动物细胞体内都能扩增。都含有如下基本成分：在细菌和哺乳动物细胞体内都能扩

11、增。都含有如下基本成分：在细菌和哺乳动物细胞体内都能扩增。都含有如下基本成分：允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。允许载体在细菌体内扩增的质粒序列。含有使基因表达的调控元件。含有使基因表达的调控元件。含有使基因表达的调控元件。含有使基因表达的调控元件。能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。能用以筛选出外源基因已整合的选择标记。有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。有时还带有选择性增加拷贝数的扩增系统。有时还带有选择性

12、增加拷贝数的扩增系统。第十三页，讲稿共二十五页哦基因载体的导入和高效表达基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选工程细胞株的筛选第十四页，讲稿共二十五页哦1）基因载体的导入基因载体的导入基因载体导入动物细胞基因载体导入动物细胞最常用方法是：最常用方法是：最常用方法是：最常用方法是：磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法 电穿孔法电穿孔法电穿孔法电穿孔法 第十五页，讲稿共二十五页哦磷酸钙沉淀法：磷酸钙沉淀法：磷酸钙沉淀法：磷酸钙沉淀法：溶解的溶解的溶解的溶解的DNA DNA 加加加加NaNa2HPOHPO4和和和和CaClCaCl2 形成磷酸钙沉淀，形成磷酸钙沉淀，形成磷酸钙沉淀，形成

13、磷酸钙沉淀，DNADNA被包在磷酸钙沉淀被包在磷酸钙沉淀被包在磷酸钙沉淀被包在磷酸钙沉淀中，形成中，形成中，形成中，形成DNADNA磷酸钙共沉淀物，当和细胞表面接触时，则通过细胞吞噬作用磷酸钙共沉淀物，当和细胞表面接触时，则通过细胞吞噬作用磷酸钙共沉淀物，当和细胞表面接触时，则通过细胞吞噬作用磷酸钙共沉淀物，当和细胞表面接触时，则通过细胞吞噬作用而将而将而将而将DNADNA导入。导入。导入。导入。第十六页，讲稿共二十五页哦电穿孔法：电穿孔法：电穿孔法：电穿孔法：借助电穿孔仪的高压脉冲电场，借助电穿孔仪的高压脉冲电场，借助电穿孔仪的高压脉冲电场，借助电穿孔仪的高压脉冲电场，使细胞膜出现瞬时可逆性

14、小孔，使细胞膜出现瞬时可逆性小孔，使细胞膜出现瞬时可逆性小孔，使细胞膜出现瞬时可逆性小孔，外源外源外源外源DNADNA沿小孔进入细胞。转沿小孔进入细胞。转沿小孔进入细胞。转沿小孔进入细胞。转 化率较高，拷贝数低。化率较高，拷贝数低。化率较高，拷贝数低。化率较高，拷贝数低。第十七页，讲稿共二十五页哦真核生物细胞生产药用蛋白优点：真核生物细胞生产药用蛋白优点：具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构,理化特性最接近于天然理化特性最接近于天然蛋白分子；蛋白分子；具有产物胞外具有产物胞外分泌分泌功能，便于下游产物分离纯化；功能，便

15、于下游产物分离纯化；具有重组基因的高效扩增和表达能力；具有重组基因的高效扩增和表达能力；具有贴壁生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可以进行悬浮培养，表达具有贴壁生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可以进行悬浮培养，表达水水平较高；平较高；CHO（注射用重组人促红素（注射用重组人促红素 ）细胞属于成纤维细胞，很少分泌自身的内源蛋白，利于外源蛋白的分）细胞属于成纤维细胞，很少分泌自身的内源蛋白，利于外源蛋白的分离。离。因此，可以针对性的筛选细胞株因此，可以针对性的筛选细胞株第十八页，讲稿共二十五页哦 由于由于由于由于CHO-dhfr-CHO-dhfr-CHO-dhfr-CHO-d

16、hfr-细胞自身缺失二氢叶酸还原酶（细胞自身缺失二氢叶酸还原酶（细胞自身缺失二氢叶酸还原酶（细胞自身缺失二氢叶酸还原酶（dhfrdhfrdhfrdhfr），无法自），无法自），无法自），无法自身合成四氢叶酸，所以身合成四氢叶酸，所以身合成四氢叶酸，所以身合成四氢叶酸，所以必须在添加了次黄嘌呤（必须在添加了次黄嘌呤（必须在添加了次黄嘌呤（必须在添加了次黄嘌呤（hypoxanthinehypoxanthinehypoxanthinehypoxanthine）、胸腺嘧啶（）、胸腺嘧啶（）、胸腺嘧啶（）、胸腺嘧啶（ThymidineThymidineThymidineThymidine）和甘氨酸的培养

17、液中才能得以存）和甘氨酸的培养液中才能得以存）和甘氨酸的培养液中才能得以存）和甘氨酸的培养液中才能得以存活。活。活。活。二氢叶酸还原酶能够被叶酸类似物氨甲喋呤二氢叶酸还原酶能够被叶酸类似物氨甲喋呤二氢叶酸还原酶能够被叶酸类似物氨甲喋呤二氢叶酸还原酶能够被叶酸类似物氨甲喋呤(methotrexate(methotrexate(methotrexate(methotrexate,MTX),MTX),MTX),MTX)所抑制所抑制所抑制所抑制 ,用含有目的基因及与之相连的用含有目的基因及与之相连的用含有目的基因及与之相连的用含有目的基因及与之相连的DHFRDHFRDHFRDHFR基因的重组质粒基因的

18、重组质粒基因的重组质粒基因的重组质粒转化转化转化转化CHO dhfrCHO dhfrCHO dhfrCHO dhfr细胞细胞细胞细胞 ,利用浓度不断提高的利用浓度不断提高的利用浓度不断提高的利用浓度不断提高的 MTXMTXMTXMTX选择抗选择抗选择抗选择抗MTXMTXMTXMTX的细胞的细胞的细胞的细胞系系系系 ,其中其中其中其中 DHFRDHFRDHFRDHFR基因及与之相连的目的基因一起扩增基因及与之相连的目的基因一起扩增基因及与之相连的目的基因一起扩增基因及与之相连的目的基因一起扩增 ,从而使从而使从而使从而使目的基因高水平表达。目的基因高水平表达。目的基因高水平表达。目的基因高水平表

19、达。主要采用主要采用主要采用主要采用DHFR系统和系统和GS 系统系统 2 2）高效表达工程细胞株的筛选）高效表达工程细胞株的筛选二氢叶酸还原酶系统二氢叶酸还原酶系统二氢叶酸还原酶系统二氢叶酸还原酶系统DHFRDHFR第十九页，讲稿共二十五页哦第二十页，讲稿共二十五页哦DHFRDHFR扩增仅仅发生在二个等位基因中的一个。在稳定系中扩增的基因得以保持，因为它们扩增仅仅发生在二个等位基因中的一个。在稳定系中扩增的基因得以保持，因为它们位于染色体上位于染色体上DHFRDHFR基因座上（均匀染色区），而其等位基仍保持基因座上（均匀染色区），而其等位基仍保持正常的单拷贝正常的单拷贝。而在不稳。而在不稳定

20、系中当选择压力消除时，扩增的基因至少会定系中当选择压力消除时，扩增的基因至少会部分丢失部分丢失，但未丢失的是，但未丢失的是以染色体外的方式（双以染色体外的方式（双微体）存在微体）存在。第二十一页，讲稿共二十五页哦每个双微体带有2-4 DHFR基因，双微体可以复制，但它们没有着丝粒，结果它们不能附着在有丝分裂的纺锤丝上，因此不能均等分离进入子细胞，是染色体外的微小染色体。第二十二页，讲稿共二十五页哦 谷氨酰胺合成酶在谷氨酰胺合成酶在 ATP ATP 水解提供能量时水解提供能量时 ,利用细胞内的氨和谷氨酸合利用细胞内的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺成谷氨酰胺 ,在缺乏细胞外谷氨酰胺的培养条件下在缺乏细胞外

21、谷氨酰胺的培养条件下 ,加入谷氨酰胺加入谷氨酰胺合成酶的抑制物甲硫氨酸亚砜合成酶的抑制物甲硫氨酸亚砜(methionine sulphoximine,MSX),(methionine sulphoximine,MSX),可使可使GSGS基因及与之相连的目的基因扩增基因及与之相连的目的基因扩增 ,达到提高目的基因表达水平的达到提高目的基因表达水平的目的。目的。由于由于只有多拷贝的只有多拷贝的GSGS编码基因才能抗编码基因才能抗MSXMSX，所以在转染过程中不必使用，所以在转染过程中不必使用GSGS缺陷型的受体细胞，而且在正常缺陷型的受体细胞，而且在正常MSXMSX浓度下就能筛选到含有高拷贝外源基浓度下就能筛选到含有高拷贝外源基因的转染细胞，这是因的转染细胞，这是GS-MSXGS-MSX系统比系统比DHFR-MTXDHFR-MTX系统优越之处。主要哺乳系统优越之处。主要哺乳细胞株为细胞株为NS0NS0细胞及细胞及CHOK1CHOK1细胞。细胞。谷氨酰胺合成酶（谷氨酰胺合成酶（GS）系统）系统第二十三页，讲稿共二十五页哦思考：思考：在动物细胞生产药用蛋白中，在动物细胞生产药用蛋白中，哪些类型哪些类型的细胞更有前景？的细胞更有前景？第二十四页，讲稿共二十五页哦感感谢谢大大家家观观看看4/1/2023第二十五页，讲稿共二十五页哦