单核增生李斯特氏菌检测概述优秀.ppt
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1、单核增生李斯特氏菌检测概述现在学习的是第1页,共46页单核增生李斯特氏菌检测概述张惠媛2005年6月现在学习的是第2页,共46页内容简介李斯特氏菌属单核增生李斯特氏菌生物学特性流行病学致病性实验室危害及其预防检测程序快速检测方法现在学习的是第3页,共46页李斯特氏菌属 李斯特氏菌属(李斯特氏菌属(ListeriaListeria )普遍存在于环境中,最新的分)普遍存在于环境中,最新的分类学研究表明,其分为六个种:类学研究表明,其分为六个种:单核增生李斯特氏菌(单核增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenesListeria monocytogenes)伊氏李斯特氏菌(伊氏李斯特
2、氏菌(Listeria ivanoviiListeria ivanovii)无害李斯特氏菌(无害李斯特氏菌(Listeria innocuaListeria innocua)斯氏李斯特氏菌(斯氏李斯特氏菌(Listeria seeligeriListeria seeligeri)威氏李斯特氏菌(威氏李斯特氏菌(Listeria welshimeriListeria welshimeri)格氏李斯特氏菌(格氏李斯特氏菌(Listeria grayiListeria grayi)在李斯特氏菌属的六个种中,只有两种致病菌:在李斯特氏菌属的六个种中,只有两种致病菌:单核增生单核增生李斯特氏菌李斯特氏菌
3、和和伊氏李斯特氏菌伊氏李斯特氏菌可以引起老鼠和其他动物发病。但是,可以引起老鼠和其他动物发病。但是,其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类的李斯特氏菌症其中通常只有单核增生李斯特氏菌和人类的李斯特氏菌症(listeriosislisteriosis)相关。因此,李斯特氏菌中最有检测意义的是单核增)相关。因此,李斯特氏菌中最有检测意义的是单核增生李斯特氏菌。生李斯特氏菌。现在学习的是第4页,共46页生物学特性-菌体形态及染色特征革兰氏革兰氏阳性阳性;小的、类似球形杆菌,0.40.40.50.52 mm,在有些培在有些培养基中稍弯,两端钝圆,单个、成短链、细胞彼此连养基中稍弯,两端钝圆,单个、成短链
4、、细胞彼此连成成V V形,或成群的细胞沿长轴方向平行排列,在较老的或形,或成群的细胞沿长轴方向平行排列,在较老的或生长不良的培养物中,可能形成丝状;生长不良的培养物中,可能形成丝状;20-25以以4 4根周生根周生鞭毛鞭毛运动,在运动,在3737只有较少的鞭毛只有较少的鞭毛或或1 1根鞭毛;根鞭毛;无芽孢、无荚膜。现在学习的是第5页,共46页现在学习的是第6页,共46页生物学特性-培养特性兼性厌氧;在20-25培养有动力,穿刺培养2-5天可见倒立伞状生长,肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。生长温度范围为2-42(也有报道在0能缓慢生长),最适培养温度为35-37。pH范围pH4.4-pH9.
5、6。现在学习的是第7页,共46页生物学特性-培养特性在固体培养基上,菌落初始很小,透明,边缘整齐,呈露滴状,但随着菌落的增大,变得不透明。在5-7%的血平板上,菌落通常也不大,灰白色,刺种血平板培养后可产生窄小的-溶血环。在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂(TSAYE)琼脂上,用45角入射光照射菌落,通过解剖镜垂直观察,菌落呈兰色、灰色或兰灰色。现在学习的是第8页,共46页生物学特性-生化反应触酶触酶阳性,阳性,氧化酶阴性。能发酵多种糖类,产酸不产气,如发酵葡萄糖、乳糖、水能发酵多种糖类,产酸不产气,如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、杨素、麦芽糖、鼠李糖鼠李糖、七叶苷、蔗糖(迟发酵)、山、蔗糖(
6、迟发酵)、山梨醇、海藻糖、果糖,不发酵梨醇、海藻糖、果糖,不发酵木糖木糖、甘露醇、肌醇、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖。阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖。不利用枸橼酸盐,不利用枸橼酸盐,40%胆汁不溶解,吲哚、硫化氢、胆汁不溶解,吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性,性,VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性。现在学习的是第9页,共46页生物学特性-血清型根据菌体(O)抗原和鞭毛(H)抗原,将单增李氏菌分成13个血清型,分别是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、
7、4ab、4c、4d、4e 和“7”。致病菌株的血清型一般为1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b,后两型尤多。现在学习的是第10页,共46页生物学特性-抵抗力该菌对理化因素抵抗力较强,在土壤、粪便、青储饲该菌对理化因素抵抗力较强,在土壤、粪便、青储饲料和食品中能长期存活;料和食品中能长期存活;对碱和盐抵抗力强,对碱和盐抵抗力强,60-70经经5-20min5-20min可杀死,可杀死,70%酒精5min5min、2.5%石炭酸、石炭酸、2.5%氢氧化钠、氢氧化钠、2.5%2.5%福尔马林20min 可杀死此菌;可杀死此菌;湿热灭菌(湿热灭菌(121121,至少,至少15mi
8、n)和干热灭菌(160-160-170170,至少,至少1hr1hr)可杀灭该菌,对紫外线和)可杀灭该菌,对紫外线和 射射线线敏感敏感;该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素(已产生抗性)、氨该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素(已产生抗性)、氨基糖苷类、氯霉素均敏感。基糖苷类、氯霉素均敏感。现在学习的是第11页,共46页流行病学分布:广泛存在于自然界中,土壤、地表水、污水、废水、青储饲料、动植物及其食品中均有该菌存在,所以动物很容易食入该菌,并通过口腔-粪便的途径进行传播寄主范围:哺乳动物、鸟类、鱼类、甲壳类和昆虫现在学习的是第12页,共46页流行病学据报道,有1-10%的人类肠道中存在单核增生李斯特
9、氏菌,4-8%的水产品、5-10%的奶及其产品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被该菌污染。相关食品:鲜奶、巴氏消毒奶、奶酪(尤其是软奶酪)、冰激凌、生的蔬菜、发酵过的生肉制作的香肠、生的和加工过的禽肉、各种生的肉类、生的和烟熏的鱼肉。约有85-90%的病例是由被污染的食品引起的。现在学习的是第13页,共46页19961996年至年至19991999年,因单核增生李斯特氏菌回收的食品种年,因单核增生李斯特氏菌回收的食品种类(来源:类(来源:USDAUSDA及FDAFDA报告)报告)现在学习的是第14页,共46页致病性及其治疗该病的临床表现,健康成人个体出现轻微类似流感症状,该病的临床表现
10、,健康成人个体出现轻微类似流感症状,新生儿、孕妇、免疫缺陷患者表现为呼吸急促、呕吐、新生儿、孕妇、免疫缺陷患者表现为呼吸急促、呕吐、出血性皮疹、化脓性结膜炎、发热、抽搐、昏迷、出血性皮疹、化脓性结膜炎、发热、抽搐、昏迷、自然自然流产或死婴流产或死婴、脑膜炎、败血症直至死亡。、脑膜炎、败血症直至死亡。由该菌造成的脑膜炎的致死率可高达70%70%,败血症,败血症的死亡率达的死亡率达50%50%,围产期或新生儿感染的死亡率超过,围产期或新生儿感染的死亡率超过80%80%,怀孕期妇女的感染,母亲通常能存活下来。,怀孕期妇女的感染,母亲通常能存活下来。抗生素治疗,用青霉素或氨苄青霉素注射给药,或与氨基糖
11、苷类抗生素一起用药。现在学习的是第15页,共46页感染人群感染剂量未知,但与该菌的毒力和易感人群的年龄、免疫状态有关。易感者:易感者:孕妇孕妇/胎儿胎儿围产期和新生儿的感染;围产期和新生儿的感染;接受皮质激素、抗癌剂治疗、器官移植接受皮质激素、抗癌剂治疗、器官移植 治疗、艾滋病患治疗、艾滋病患者等免疫缺损者;者等免疫缺损者;癌症病人癌症病人 尤其是白血病的患者;尤其是白血病的患者;不太常见的报道不太常见的报道糖尿病、肝硬化、哮喘和溃疡性结糖尿病、肝硬化、哮喘和溃疡性结肠炎的患者;肠炎的患者;年纪较大的人;年纪较大的人;没有免疫缺陷的健康的人,食用污染该菌尤其是大量没有免疫缺陷的健康的人,食用污
12、染该菌尤其是大量污染该菌的食品后,也有患病的危险。污染该菌的食品后,也有患病的危险。现在学习的是第16页,共46页致病机理单增李氏菌的抗原结构与毒力无关,它的致病性与毒力机理如下:1 1、寄生物介导的细胞内增生,使它附着及进入肠细胞、寄生物介导的细胞内增生,使它附着及进入肠细胞与巨噬细胞;与巨噬细胞;2 2、抗活化的巨噬细胞,单增李氏菌有细菌性过氧化物歧化酶,使它能抗活化巨噬细胞内的过氧物(为杀菌的毒性游离基团)分解;3 3、溶血素溶血素,即李氏杆菌素,即李氏杆菌素O O,可以从培养物上清液中获,可以从培养物上清液中获得,有得,有 和 两种,为毒力因子。两种,为毒力因子。现在学习的是第17页,
13、共46页实验室危害不是一种普遍的与实验室相关的传染病,目前只有少数有报道的案例发生;直接摄取是最普遍的一种感染方式,除此之外,暴露在该菌高浓度的气溶胶中,也可通过眼睛和破损的皮肤、粘膜进入体内造成感染。现在学习的是第18页,共46页注意事项生物安全2级,操作时应有相应的防污染设施,在进行可能产生气溶胶的操作时,应在生物安全柜内完成;在直接接触有感染性的材料时,必须穿着实验服,戴手套和护目镜;怀孕的妇女应避免接触传染物。现在学习的是第19页,共46页操作要求溅洒:使气溶胶沉降,穿着防护服装,用纸巾轻轻覆盖溅洒处,加入1%次氯酸钠溶液,由周边向中心加,在清理之前要留充足的接触时间(30min);废
14、弃:在废弃前应先采取净化措施,高压蒸汽灭菌、化学消毒、焚烧等;储存:在有适当标记的密封容器内储存。现在学习的是第20页,共46页检测程序-增菌 目前常用的单核增生李斯特氏菌检测增菌肉汤主要有半量Fraser肉汤、Fraser肉汤(FB)、UVM(Modified University of Vermont broth,也叫UVM1)、LEB(Listeria enrichment broth)和BLEB(buffered Listeria enrichment broth)现在学习的是第21页,共46页半量Fraser肉汤和Fraser肉汤具有选择性和和区别性区别性。加入加入柠檬酸铁铵柠檬酸铁
15、铵和和七叶灵,起到区别的作用。李斯特氏菌可,起到区别的作用。李斯特氏菌可以水解七叶灵,与培养基中的铁离子反应,使培养基变黑,以水解七叶灵,与培养基中的铁离子反应,使培养基变黑,可直观的从培养液的颜色就可以判断是否有单核李斯特氏菌可直观的从培养液的颜色就可以判断是否有单核李斯特氏菌的生长。的生长。氯化锂氯化锂、吖啶黄和萘啶酮酸作为选择性因子。作为选择性因子。半量半量FraserFraser肉汤与肉汤与FraserFraser肉汤所用的添加剂一样肉汤所用的添加剂一样 半量半量FraserFraser肉汤:萘啶酮酸10mg/L,吖啶黄,吖啶黄12.5mg/L12.5mg/L Fraser肉汤:萘啶酮
16、酸肉汤:萘啶酮酸20mg/L20mg/L,吖啶黄的,吖啶黄的25mg/L 25mg/L 现在学习的是第22页,共46页UVMUVM只有选择性没有区别性加入萘啶酮酸和盐酸吖啶黄,作为选择性因子。虽然其中含有七叶灵,但是没有添加柠檬酸铁铵,不能发生黑色的颜色反应。现在学习的是第23页,共46页LEB和BLEB只有选择性没有区别性LEB是在TSB-YE的基础上加入盐酸吖啶黄、萘啶酮酸和放线菌酮等选择性因子;加入的丙酮酸钠,有助于受损细胞的恢复;不含七叶灵和柠檬酸铁铵,无颜色反应BLEB是在LEB基础上加入缓冲体系:磷酸二氢钾和磷酸氢二钠现在学习的是第24页,共46页检测程序-分离分离培养基有:分离培
17、养基有:OXAOXA、PALCOM、LPM、MOXMOX等,但首选仍然是OXAOXA。分离原理主要是基于李斯特氏菌具有。分离原理主要是基于李斯特氏菌具有 D葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶的活性,能水解培养基中的七叶灵,的活性,能水解培养基中的七叶灵,产生七叶苷,与铁离子产生颜色反应而,使菌落为棕褐色,产生七叶苷,与铁离子产生颜色反应而,使菌落为棕褐色,并带有褐色晕圈,而致病性和非致病性李斯特氏菌病都能并带有褐色晕圈,而致病性和非致病性李斯特氏菌病都能发生这种反应发生这种反应还有一些选择性显色培养基,如还有一些选择性显色培养基,如BCMBCM、ALOAALOA、CHROMagar listeriaCHRO
18、Magar listeria、RapidRapid L.monoL.mono等,其原理主要是等,其原理主要是检测由毒力基因编码的检测由毒力基因编码的溶血素,而此种溶血素只存在,而此种溶血素只存在于单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌中,因而可于单核增生李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌中,因而可以很好的将此两种菌同李斯特属的其他种分开。以很好的将此两种菌同李斯特属的其他种分开。现在学习的是第25页,共46页 OXA平板单核增生李斯特氏菌 ATCC 1911748h,35培养现在学习的是第26页,共46页 OXA平板无害李斯特氏菌ATCC 3309048h,35培养现在学习的是第27页,共46页检测程序-
19、鉴定蓝色菌落检验(Henry illumination)典型运动:相差显微镜,轻微旋转或翻跟头 动力试验:动力试验:7 7天,伞形生长天,伞形生长过氧化氢酶试验:阳性试验:阳性革兰氏染色革兰氏染色:阳性短杆菌:阳性短杆菌溶血试验溶血试验:穿刺接种血平板:穿刺接种血平板硝酸盐还原试验:5 5天,阴性天,阴性糖发酵试验糖发酵试验:葡萄糖、麦芽糖和七叶灵,李斯特菌属反:葡萄糖、麦芽糖和七叶灵,李斯特菌属反应均为阳性,除格氏李斯特甘露醇阴性,李斯特其他种应均为阳性,除格氏李斯特甘露醇阴性,李斯特其他种甘露醇阴性,甘露醇阴性,木糖和和鼠李糖鼠李糖最有检测意义最有检测意义现在学习的是第28页,共46页动力
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