蛋白质和氨基酸的测定课件.ppt
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1、蛋白质和氨基酸的测定第1页,此课件共48页哦8-1概述概述8-2蛋白质的定性测定(自学)蛋白质的定性测定(自学)8-3蛋白质的定量测定蛋白质的定量测定*(8-4蛋白质的末端测定)蛋白质的末端测定)8-5氨基酸的定性测定(自学)氨基酸的定性测定(自学)8-6氨基酸的定量测定氨基酸的定量测定*8-7氨基酸的分离及测定氨基酸的分离及测定第八章第八章蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定第2页,此课件共48页哦本章重点本章重点1.凯氏定氮法的原理及注意事项。凯氏定氮法的原理及注意事项。2.蛋白质快速测定法有哪些?蛋白质快速测定法有哪些?3.氨基酸总量的测定方法(甲醛滴定法)。氨基酸总量的测定方法(甲
2、醛滴定法)。第3页,此课件共48页哦第一节第一节概述概述l蛋白质是复杂的含氮有机化合物。蛋白质是复杂的含氮有机化合物。l蛋白质换算系数蛋白质换算系数F 玉米、鸡蛋、肉玉米、鸡蛋、肉 6.25 6.25 花生花生 5.465.46 乳制品乳制品 6.38 6.38 大米大米 5.955.95 面粉面粉 5.70 5.70 大豆及制品大豆及制品 5.715.71l蛋白质平均含蛋白质平均含N量(量(15-17.6)为)为16%。第4页,此课件共48页哦l不同的食品中蛋白质含量不一样,一般动物性食不同的食品中蛋白质含量不一样,一般动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。品的蛋白质含量高于植物性食品。鸡肉
3、鸡肉鸭鸭兔肉兔肉牛肉牛肉猪肉猪肉带鱼带鱼21.516.521.220.19.518.1大豆大豆稻米稻米菠菜菠菜苹果苹果黄瓜黄瓜牛乳牛乳36.38.52.40.40.83.5第5页,此课件共48页哦l测定意义:测定意义:评价食品的营养价值。评价食品的营养价值。为合理开发利用食物资源,提高产品质量,优化食为合理开发利用食物资源,提高产品质量,优化食品配方及生产过程控制提供依据。品配方及生产过程控制提供依据。第6页,此课件共48页哦其中:其中:凯氏定氮法凯氏定氮法最常用的,国内外应用普遍。最常用的,国内外应用普遍。双双缩缩脲脲反反应应、染染料料结结合合反反应应、酚酚试试剂剂法法等等多多用用于于生生产
4、产单单位位质量控制分析。质量控制分析。国外:红外分析仪国外:红外分析仪在一般的常规检验中多进行氨基酸总量的测定,通常采用酸碱滴定在一般的常规检验中多进行氨基酸总量的测定,通常采用酸碱滴定法来完成。法来完成。各种氨基酸的分离与定量各种氨基酸的分离与定量色谱技术。色谱技术。有多种氨基酸分析仪。有多种氨基酸分析仪。l蛋白质的测定方法:蛋白质的测定方法:分两大类分两大类一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量;测定蛋白质含量;另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基(酸性和碱性基另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基(酸性和碱性基团、芳香基团等)测定
5、蛋白质含量。团、芳香基团等)测定蛋白质含量。第7页,此课件共48页哦第二节第二节蛋白质的定性测定蛋白质的定性测定(自学)(自学)一、蛋白质的一般显色反应一、蛋白质的一般显色反应电电泳泳或或纸纸层层析析之之后后用用一一些些染染料料与与蛋蛋白白质质结结合合并并变色。书中列举了变色。书中列举了5种染料。种染料。二、复合蛋白质的显色反应二、复合蛋白质的显色反应(一)糖蛋白的显色(一)糖蛋白的显色(3种方法)种方法)(二)脂蛋白的显色(二)脂蛋白的显色(2种方法)种方法)第8页,此课件共48页哦测定总氮量测定总氮量 N%F=粗蛋白质含量粗蛋白质含量%因为:样品中除蛋白氮外,可能还包括有非蛋白质因为:样品
6、中除蛋白氮外,可能还包括有非蛋白质含氮化合物,如核酸、含氮碳水化合物、生物碱、含氮化合物,如核酸、含氮碳水化合物、生物碱、含氮类脂、卟啉和含氮色素等。含氮类脂、卟啉和含氮色素等。第三节第三节蛋白质的定量测定蛋白质的定量测定!第9页,此课件共48页哦一、一、凯氏定氮法凯氏定氮法 由由Kieldhl于于1833年提出,现发展为常量、微量、年提出,现发展为常量、微量、自动定氮仪法,半微量法及改良凯氏法。自动定氮仪法,半微量法及改良凯氏法。改良改良:氮的完全氨化氮的完全氨化,缩短时间缩短时间,简化操作简化操作。主要改良催化剂主要改良催化剂及消化及消化蒸馏蒸馏装置。装置。第10页,此课件共48页哦(一)
7、常量凯氏定氮法(一)常量凯氏定氮法原理原理样样品品与与浓浓硫硫酸酸和和催催化化剂剂一一同同加加热热消消化化,使使蛋蛋白白质质分分解解,其其中中碳碳和和氢氢被被氧氧化化为为二二氧氧化化碳碳和和水水逸逸出出,而而样样品品中中的的有有机机氮氮转转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏,使氨蒸出。化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏,使氨蒸出。用用H3BO3吸吸收收后后再再以以标标准准HCl滴滴定定或或H2SO4溶溶液液滴滴定定。根根据据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。也也可可以以用用过过量量的的标标准准H2SO4或或标标准准HCl溶溶液液吸吸收收后后再再以以
8、标标准准NaOH滴定过量的酸。滴定过量的酸。为什么?第11页,此课件共48页哦催化剂催化剂煮沸煮沸1、消化:、消化:NCOC+浓浓H2SO4(NH4)2SO4+CO2+SO2+H2O2、蒸馏与吸收:、蒸馏与吸收:2NaOH+(NH4)2SO42NH3+Na2SO4+2H2O 2NH 2NH3 3+4H+4H3 3BOBO3 3 (NHNH4 4)2 2B B4 4O O7 7+5H+5H2 2O O 3 3、滴定:(、滴定:(NHNH4 4)2 2B B4 4O O7 7+5H+5H2 2O+2HCl 2NHO+2HCl 2NH4 4Cl+4HCl+4H3 3BOBO3 3 (注注:NCOC,
9、Nitrogen containing organic compounds):NCOC,Nitrogen containing organic compounds)凯氏定氮法原理(方程式)凯氏定氮法原理(方程式)整个过程分三步:消化、蒸馏与吸收、滴定整个过程分三步:消化、蒸馏与吸收、滴定第12页,此课件共48页哦1.消化消化加硫酸钾加硫酸钾作为增温剂,提高溶液沸点,作为增温剂,提高溶液沸点,纯硫酸沸点纯硫酸沸点340,加入硫酸钾之后可以提高,加入硫酸钾之后可以提高至至400以上。也可加入硫酸钠,氯化钾等提以上。也可加入硫酸钠,氯化钾等提高沸点,但效果不如硫酸钾。高沸点,但效果不如硫酸钾。要防止
10、暴沸要防止暴沸第13页,此课件共48页哦加硫酸铜加硫酸铜作为催化剂。还可以作消化终点指示剂、作为催化剂。还可以作消化终点指示剂、蒸馏时碱性指示剂。还可以加氧化汞、汞(均有毒,蒸馏时碱性指示剂。还可以加氧化汞、汞(均有毒,价格贵)、硒粉、二氧化钛。价格贵)、硒粉、二氧化钛。加氧化剂加氧化剂如双氧水、次氯酸钾等加速有机如双氧水、次氯酸钾等加速有机物氧化速度。物氧化速度。第14页,此课件共48页哦凯氏定氮法注意事项凯氏定氮法注意事项图:常量凯氏定氮消化及蒸馏装置图:常量凯氏定氮消化及蒸馏装置 a a消化装置消化装置 b b蒸馏吸收装置蒸馏吸收装置1 1、硫酸钾、硫酸钾 及及硫硫酸铜的作用酸铜的作用2
11、 2、火候控制、火候控制3 3、装置的气、装置的气密性密性4 4、何时加碱、何时加碱5 5、难消化的、难消化的 对策对策6 6、停止蒸馏、停止蒸馏第15页,此课件共48页哦自动回流消化蒸馏仪自动回流消化蒸馏仪第16页,此课件共48页哦2.蒸馏与吸收蒸馏与吸收消化液消化液+40%氢氧化钠氢氧化钠加热蒸馏,放出氨气。加热蒸馏,放出氨气。“以奈氏试剂以奈氏试剂”检查。检查。同时用同时用4%硼酸吸收硼酸吸收Nessler试剂,试剂,K2(HgI4)检验检验NH4+离子,析出黄色或红棕离子,析出黄色或红棕色沉淀。色沉淀。第17页,此课件共48页哦3.滴定滴定用用HCl滴定滴定用混合指示剂(甲基红用混合指
12、示剂(甲基红+溴甲酚绿或亚甲基兰溴甲酚绿或亚甲基兰+甲基红)甲基红)终点:蓝色终点:蓝色微红色微红色计算:计算:F要根据样品来源定要根据样品来源定 3学时第18页,此课件共48页哦说明及注意:说明及注意:本本法法可可应应用用于于各各类类食食品品中中蛋蛋白白质质含含量量测测定定(粗粗蛋蛋白白质)质)。结果准确,但费时。结果准确,但费时。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。同时作一空白试验,从消化开始到滴定同时作一空白试验,从消化开始到滴定。消消化化时时不不要要用用强强火火,应应保保持持和和缓缓沸沸腾腾,以以免免粘粘贴贴在在凯凯氏氏瓶瓶内内壁壁上上的的含含氮氮化化合合物
13、物在在无无硫硫酸酸存存在在的的情情况况下下消消化化不不完完全而造成氮损失。全而造成氮损失。第19页,此课件共48页哦消化时应注意不时转动凯氏烧瓶,以便利用冷凝消化时应注意不时转动凯氏烧瓶,以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下,并促进其消化完酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下,并促进其消化完全。全。样品中若含脂肪或糖较多时,消化过程中易产样品中若含脂肪或糖较多时,消化过程中易产生大量泡沫,为防止泡沫溢出瓶外,在开始消化生大量泡沫,为防止泡沫溢出瓶外,在开始消化时应用小火加热,并时时摇动;或者加入少量辛时应用小火加热,并时时摇动;或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂,并同时注意控制热醇或液体石
14、蜡或硅油消泡剂,并同时注意控制热源强度。源强度。当样品消化液不易澄清透明时,可将凯氏烧瓶冷却,当样品消化液不易澄清透明时,可将凯氏烧瓶冷却,加入加入30过氧化氢过氧化氢23m1后再继续加热消化后再继续加热消化。第20页,此课件共48页哦般消化至呈透明后,继续消化般消化至呈透明后,继续消化30分钟即可,但对于含有特别分钟即可,但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品,如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨难以氨化的氮化合物的样品,如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸等时,需适当延长消化时间(如大豆粉)。有机物如分解完全,酸等时,需适当延长消化时间(如大豆粉)。有机物如分解完全,消化液呈蓝色或浅绿色,但含铁
15、量多时,呈较深绿色。消化液呈蓝色或浅绿色,但含铁量多时,呈较深绿色。蒸馏装置不能漏气。蒸馏时,加热火力要稳定,否则将发生倒吸蒸馏装置不能漏气。蒸馏时,加热火力要稳定,否则将发生倒吸现象。现象。(NH4)2SO4 检验第21页,此课件共48页哦蒸馏前加蒸馏前加NaOH要足量,溶液应变为深蓝色或黑要足量,溶液应变为深蓝色或黑褐色褐色(Cu(OH)2、CuO、铜氨离子),如颜色、铜氨离子),如颜色不变可能碱不够不变可能碱不够。蒸馏完毕后,应先将冷凝管下端提离液面清洗管口,蒸馏完毕后,应先将冷凝管下端提离液面清洗管口,再蒸再蒸1分钟后关掉热源否则可能造成吸收液倒吸。分钟后关掉热源否则可能造成吸收液倒吸
16、。H3BO3吸收液的温度不应超过吸收液的温度不应超过40,否则对,否则对NH3的吸收作用减弱而造成损失。的吸收作用减弱而造成损失。第22页,此课件共48页哦(二)微量凯氏定氮法(二)微量凯氏定氮法1、原理、步骤及适用范围同前、原理、步骤及适用范围同前2、与常量法不同点:、与常量法不同点:样品量、试剂用量样品量、试剂用量减少减少加入硼酸量加入硼酸量由由50ml10ml,滴定用盐酸浓度由滴定用盐酸浓度由0.1mol/L0.01mol/L,可用微量滴定管。可用微量滴定管。3、蒸馏装置见下图、蒸馏装置见下图。第23页,此课件共48页哦保持酸保持酸性性第24页,此课件共48页哦第25页,此课件共48页哦
17、改良式微量凯氏改良式微量凯氏定氮装置定氮装置 第26页,此课件共48页哦(三)自动凯氏定氮法(三)自动凯氏定氮法1 1、原理及适用范围同前原理及适用范围同前 2 2、特点:特点:(1)消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶,红外线加热)消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶,红外线加热的消化炉。的消化炉。(2)快速:一次可同时消化)快速:一次可同时消化8个样品,个样品,30分钟可消化完分钟可消化完毕。毕。(3)自动:自动加碱蒸馏,自动吸收和滴定,自动数字)自动:自动加碱蒸馏,自动吸收和滴定,自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录,显示装置。可计算总氮百分含量并记录,12分钟完成分钟完成1个个样。样
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