实验十二土壤中微生物的分离纯化.ppt

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1、关于实验十二土壤中微生物的分离纯化现在学习的是第1页，共16页一、目的要求一、目的要求 1、掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作、掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；技术；2、初步观察来自土壤中的三大类群微生物的菌落形态特征；、初步观察来自土壤中的三大类群微生物的菌落形态特征；3、学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技、学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能。能。现在学习的是第2页，共16页二、基本原理二、基本原理（一）土壤是微生物生存的大本营，所含微生物无论是数量还是（一）土壤是微生物生存的大本营，所含微生物无论是数量还是种类都是极

2、其丰富的，原因是什么？种类都是极其丰富的，原因是什么？由于土壤具备了各种微生物生长发育所需要的营养、水分、空气、酸碱度、由于土壤具备了各种微生物生长发育所需要的营养、水分、空气、酸碱度、渗透压和温度等条件，所以成了微生物生活的良好环境。可以说，土壤是微生渗透压和温度等条件，所以成了微生物生活的良好环境。可以说，土壤是微生物的物的“天然培养基天然培养基”，也是它们的，也是它们的“大本营大本营”因此，土壤是微生物多样性的重因此，土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，人们可与从中分离、纯化获得许多有要场所，是发掘微生物资源的重要基地，人们可与从中分离、纯化获得许多有价值的菌株。价

3、值的菌株。现在学习的是第3页，共16页（二）如何分离？（二）如何分离？在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，为了获

4、得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法稀释涂布平板法或或平板划线分离法平板划线分离法等分离、纯化该等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。微生物，直至得到纯菌株。从微生物群体中经分离、生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯从微生物群体中经分离、生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培

5、养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征等综合考虑。有些培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征等综合考虑。有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征（产酸产气情况、染色情况、微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征（产酸产气情况、染色情况、营养要求、氧气需求、酸碱度、渗透压和温度等）鉴定方能得到。营养要求、氧气需求、酸碱度、渗透压和温度等）鉴定方能得到。从混杂的微生物群体从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。现在学习的是第4页

6、，共16页（三）平板菌落计数法的原理（三）平板菌落计数法的原理 将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上，经过培养后在平板上形成肉眼将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上，经过培养后在平板上形成肉眼可见的菌落。统计菌落数，根据稀释倍数和取样量计算出样品中细胞密度可见的菌落。统计菌落数，根据稀释倍数和取样量计算出样品中细胞密度（一般选择每个平板上长有（一般选择每个平板上长有50-200个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适）。适）。由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，平板上形成的每个菌落不一定由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，平板上形成的每个菌落不一定是单

7、个细胞生长繁殖而成，有的可能来自两个或多个细胞。因此，平板菌落记数是单个细胞生长繁殖而成，有的可能来自两个或多个细胞。因此，平板菌落记数的结果往往比样品中实际细胞数低，这就是现在使用的结果往往比样品中实际细胞数低，这就是现在使用菌落形成单位菌落形成单位取代以前用绝取代以前用绝对菌落数来表示样品活菌含量的原因。对菌落数来表示样品活菌含量的原因。该法虽然操作较繁琐，结果需要培养一段时间才能获得，而且测定结果易受多种因素该法虽然操作较繁琐，结果需要培养一段时间才能获得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该方法能直接反映样品中活细胞数量，所以被广泛用于生物制品（如活的影响，但是，由于该方法能直

8、接反映样品中活细胞数量，所以被广泛用于生物制品（如活菌制剂）、食品、饮料、水（包括水源水）以及多类产品等质量检测与控制的标准方法。快菌制剂）、食品、饮料、水（包括水源水）以及多类产品等质量检测与控制的标准方法。快速细菌自动稀释仪和自动菌落计数仪则提供快速准确的结果。速细菌自动稀释仪和自动菌落计数仪则提供快速准确的结果。现在学习的是第5页，共16页培养基培养基的类型的类型？现在学习的是第6页，共16页三、实验器材三、实验器材1、土壤样品（自带）、土壤样品（自带）2、培养基：淀粉琼脂培养基（高氏、培养基：淀粉琼脂培养基（高氏号培养基），牛肉膏蛋白号培养基），牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基

9、。胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基。3、溶液和试剂：、溶液和试剂：10酚，链霉素，盛酚，链霉素，盛9ml无菌水的试管，盛无菌水的试管，盛99ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶。无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶。4、仪器和其他用品：无菌玻璃涂棒，无菌吸管，无菌培养皿、仪器和其他用品：无菌玻璃涂棒，无菌吸管，无菌培养皿等。等。现在学习的是第7页，共16页四、操作步骤四、操作步骤 1、倒平板、倒平板 标记，最好写在皿底边上，以防盖子盖错；标记，最好写在皿底边上，以防盖子盖错；加热熔化三种培养基，冷至加热熔化三种培养基，冷至5560时，在高氏时，在高氏号培养基中加入号培养基中加入10酚数酚数滴，马丁氏琼脂培养

10、基中加入链霉素溶液（终质量浓度为滴，马丁氏琼脂培养基中加入链霉素溶液（终质量浓度为30ul/mg），混匀后看），混匀后看清标记分别倒平板，在火焰附近，每皿倒清标记分别倒平板，在火焰附近，每皿倒1520ml，静置凝固后备用；，静置凝固后备用；(若皿若皿盖上冷凝水过多，最好用灭菌棉花或灭菌纸擦后再涂布盖上冷凝水过多，最好用灭菌棉花或灭菌纸擦后再涂布)现在学习的是第8页，共16页2、稀释土样、稀释土样 制备土壤稀释液称取土样制备土壤稀释液称取土样10g，放入盛，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约中，振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将菌分散。用一支分钟

11、，使土样与水充分混合，将菌分散。用一支1ml无菌吸管无菌吸管从中吸取从中吸取1ml土壤悬液注入盛有土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。然后无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取无菌吸管从此试管中吸取1ml注入另一盛有注入另一盛有9ml无菌水的试管中，无菌水的试管中，以此类推制成以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6各种稀释度的土壤溶液。各种稀释度的土壤溶液。减小误差应注意的方面：减小误差应注意的方面：称量准确；称量准确；土样与水混合，一定要摇匀；土样与水混合，一定要摇匀；每次稀释取液应换一支

12、新的吸管；每次稀释取液应换一支新的吸管；每次取液时应先混匀试管中的溶液；每次取液时应先混匀试管中的溶液；现在学习的是第9页，共16页各培养基涂布菌液时对稀释度的选择：牛肉膏蛋白胨培养基10-4、10-5、10-6；高氏一号培养基：10-3、10-4、10-5；马铃薯培养基：10-2、10-3、10-4；平板菌落计数法，所选择倒平板的平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的。一般以三个连续稀释度是很重要的。一般以三个连续稀释度中的第二个稀释度倒平板培养稀释度中的第二个稀释度倒平板培养后所出现的平均菌落数在后所出现的平均菌落数在50个左右为个左右为好，否则要适当增加或减少稀释度加好，否则要适

13、当增加或减少稀释度加以调整。以调整。现在学习的是第10页，共16页平板分离平板分离现在学习的是第11页，共16页3、涂布：、涂布：标记：选择标记：选择3个稀释度写在平板底部；个稀释度写在平板底部；取样：每皿准确取悬液取样：每皿准确取悬液0.2ml，放于平板中央；（注意每次取液时应先混，放于平板中央；（注意每次取液时应先混匀试管中的溶液）匀试管中的溶液）涂布：在培养基表面轻轻地涂布均匀，其方法是将菌液先沿一条直线轻轻涂布：在培养基表面轻轻地涂布均匀，其方法是将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布均匀，然后改变方向地来回推动，使之分布均匀，然后改变方向90沿另一垂直线来回推动，平板沿另一垂直线

14、来回推动，平板内缘处可改变方向用涂棒再涂布几次，室温下静置内缘处可改变方向用涂棒再涂布几次，室温下静置510分钟；分钟；注意涂棒的正确使用。注意涂棒的正确使用。现在学习的是第12页，共16页4、培养：、培养：将含高氏将含高氏号培养基和马丁氏琼脂培养基的平板倒置于号培养基和马丁氏琼脂培养基的平板倒置于28温室中培养温室中培养35天，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板倒置于天，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板倒置于37温室中培养温室中培养12天。天。5、记数：、记数：培养培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算

15、，并按下列公式进行计算，每毫升中菌落形成单位每毫升中菌落形成单位(cfu)=同一稀释度三次重复的平均菌落数同一稀释度三次重复的平均菌落数稀释倍数稀释倍数56、镜检纯培养：挑菌落将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到上述三种培养基的、镜检纯培养：挑菌落将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到上述三种培养基的斜面上，分别置斜面上，分别置28和和37温室中培养，待菌苔长出后，检查菌苔是否单纯，也可用显温室中培养，待菌苔长出后，检查菌苔是否单纯，也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂，就要再一次进行分离、纯微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂，就要再一次进行分离、纯化，

16、直到获得纯培养。化，直到获得纯培养。现在学习的是第13页，共16页五、实验报告五、实验报告、将培养后菌落计数结果填入表格（实验教材、将培养后菌落计数结果填入表格（实验教材P34表表II-5）、你所做的涂布平板法是否较好地得到了单菌落？如果不是，请分析、你所做的涂布平板法是否较好地得到了单菌落？如果不是，请分析其原因。其原因。、在种不同的平板上你分离得到那些类群的微生物？简述它们的菌、在种不同的平板上你分离得到那些类群的微生物？简述它们的菌落形态特征。落形态特征。现在学习的是第14页，共16页六、思考题六、思考题1 1、如何确定平板上单个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。、如何确定平板上单

17、个菌落是否为纯培养？请写出实验的主要步骤。2 2、如果要分离得到极端嗜盐细菌，在什么地方取样，分离培养基有何特、如果要分离得到极端嗜盐细菌，在什么地方取样，分离培养基有何特点？说明理由。点？说明理由。3 3、怎样判断稀释涂布平板计数数据是否可靠？需要掌握哪几个关键？、怎样判断稀释涂布平板计数数据是否可靠？需要掌握哪几个关键？4 4、为什么高氏、为什么高氏号培养基和马丁氏琼脂培养基中要分别加入酚和链霉素？如果号培养基和马丁氏琼脂培养基中要分别加入酚和链霉素？如果用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基分离一种对青霉素具有抗性的细菌，你认为应如何做用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基分离一种对青霉素具有抗性的细菌，你认为应如何做？5 5、某单位希望检测一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计、某单位希望检测一种干酵母粉中的活菌存活率，请设计1-21-2种可行的检测种可行的检测方法。方法。现在学习的是第15页，共16页感感谢谢大大家家观观看看现在学习的是第16页，共16页