血液细胞组织化学幻灯片课件.ppt

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1、关于血液细胞组织化学幻灯片现在学习的是第1页，共65页概述 l l细胞化学染色是在组织化学的基础上发展起来细胞化学染色是在组织化学的基础上发展起来的一个学科分支，是细胞学与化学相结合而形的一个学科分支，是细胞学与化学相结合而形成的一门科学，研究细胞的化学成分，在保存成的一门科学，研究细胞的化学成分，在保存血液细胞形态的基础上，在细胞原位显示化学血液细胞形态的基础上，在细胞原位显示化学反应的结果，根据化学反应的原理，研究细胞反应的结果，根据化学反应的原理，研究细胞成分的化学性质。成分的化学性质。现在学习的是第2页，共65页研究目的及临床应用 l l研究正常血液细胞的活动与生理功能l l提高血液病

2、的诊断和鉴别诊断水平确定急性白血病的类型有助于某些血液病的鉴别诊断观察疗效和估计预后l l探索某些血液病的发病原理及治疗机制 现在学习的是第3页，共65页标本的选择l lBM片、血片、淋巴结印片、脾印片等均可作组化染色。l l用于酶染色的标本应尽可能新鲜。l l用于非酶染色的标本可在室温下放置1个月，如PAS标本。现在学习的是第4页，共65页固定的目的及方法l l目的保持细胞生前的结构与化学成分，并使血膜在染色、冲洗过程中不易脱落损坏。l l常用化学固定方法常用化学固定方法甲醛蒸汽固定：将将滤滤纸纸平平铺铺于于染染色色缸缸底底部部，加加入入少少许许40%40%甲醛溶液。将涂片标本放入缸内，加盖

3、使甲醛蒸汽固定血膜5-10分钟，水洗后晾干。液体固定：常用的固定液为乙醇、丙酮、甲醇、甲醛等，也可用两种或两种以上成分组成混合固定液。现在学习的是第5页，共65页显示方法l l 纯化学方法金属沉淀法偶氮偶联法联苯胺色素法Schiff反应普鲁士蓝反应l l 类化学方法类化学方法l l物理学方法现在学习的是第6页，共65页复染方法 l l复染是细胞内化学成分显色后，为了便于观察而进行的对比染色方法。细胞核复染法：常 用 染 料 为 苏 木 精、甲 基 绿、核固红、沙黄等。细胞浆复染法：常用染料为伊红、光绿等现在学习的是第7页，共65页过氧化物酶染色（Peroxidase stain,POX）现在学

4、习的是第8页，共65页目的 l l急性白血病的鉴别诊断 AML：阳性 ALL：阴性 现在学习的是第9页，共65页分布特点-1l l原粒细胞：阴性，白血病副原粒细胞可呈阳性反应。原粒细胞：阴性，白血病副原粒细胞可呈阳性反应。原粒细胞：阴性，白血病副原粒细胞可呈阳性反应。原粒细胞：阴性，白血病副原粒细胞可呈阳性反应。l l中性粒细胞：自早幼粒细胞起随细胞成熟阳性强度中性粒细胞：自早幼粒细胞起随细胞成熟阳性强度递增。阳性颗粒圆形，规则，直径与嗜苏丹黑颗粒递增。阳性颗粒圆形，规则，直径与嗜苏丹黑颗粒相仿，比瑞氏染色特殊颗粒大。相仿，比瑞氏染色特殊颗粒大。l l 嗜酸粒细胞：阳性反应，颗粒比中性粒细胞的

5、嗜酸粒细胞：阳性反应，颗粒比中性粒细胞的 大，着色深。大，着色深。l l嗜碱粒细胞：阴性反应，在嗜碱粒细胞：阴性反应，在嗜碱粒细胞：阴性反应，在嗜碱粒细胞：阴性反应，在CML时可出现阳性反应。时可出现阳性反应。现在学习的是第10页，共65页分布特点-2l l在粒细胞系统中，过氧化物酶颗粒的出现和增多在粒细胞系统中，过氧化物酶颗粒的出现和增多与特殊颗粒与特殊颗粒 的出现和增多有平行关系。的出现和增多有平行关系。l l单核细胞系：原单呈阴性反应，幼单和单核细胞单核细胞系：原单呈阴性反应，幼单和单核细胞呈弱阳性反应。阳性颗粒少而细小，弥散分布，呈弱阳性反应。阳性颗粒少而细小，弥散分布，有的也可呈阴性

6、反应。有的也可呈阴性反应。l l其他细胞：淋巴细胞、巨核细胞、血小板、幼其他细胞：淋巴细胞、巨核细胞、血小板、幼红细胞、浆细胞和组织细胞均呈阴性反应。有红细胞、浆细胞和组织细胞均呈阴性反应。有的吞噬细胞可呈阳性反应的吞噬细胞可呈阳性反应 现在学习的是第11页，共65页现在学习的是第12页，共65页试剂配制l l0.3%联苯胺酒精溶液：联苯胺0.3g+95%乙醇全溶后，加入亚硝 基铁氰化钠饱和水溶液1ml。可保存1-2年。l l过氧化氢溶液配制：3%过氧化氢1滴+蒸馏水5ml，须每次用时新鲜配制。现在学习的是第13页，共65页染色步骤 l l于新鲜涂片上滴加复方联苯胺染液38滴，使涂片盖满。l

7、l12分钟后加入等量过氧化氢溶液。l l48分钟后用水冲洗，空气中晾干。l l用瑞氏染液复染，凉干后油镜观察。现在学习的是第14页，共65页染色原理 l l粒细胞及部分单核细胞胞浆内的颗粒中含有过氧化物酶，该酶能分解过氧化氢，释放出新生态的氧。从而使无色的联苯胺氧化为蓝色的联苯胺蓝。l l联苯胺蓝是一种不稳定的中间产物，它可进一步氧化变成棕色的化合物 现在学习的是第15页，共65页结果判断 l l阳性反应为蓝色或蓝棕色颗粒，定位于胞浆中。现在学习的是第16页，共65页临床意义 l lALLALL时，原始细胞的时，原始细胞的POX阳性小于3%。l lAMLAML时，原始细胞的阳性3%。l l在多

8、数的在多数的M1M1、绝大部分M2和M3M3中，原始细胞的阳性率中，原始细胞的阳性率大于大于85%85%。M4M4和M5时，原单有时可呈弱阳性，但绝大时，原单有时可呈弱阳性，但绝大多数的原单是多数的原单是POX阴性。M6M6，原粒和幼稚粒细胞是，原粒和幼稚粒细胞是POXPOX阳性，幼红细胞是阳性，幼红细胞是POX阴性。在阴性。在M7M7，血小板POXPOX的活性只能在超微结构上证实。l lMDSMDS时，粒细胞白血病和感染所致的时，粒细胞白血病和感染所致的WBCWBC增高时，成熟中性粒细胞的POX活性可能降低或消失。活性可能降低或消失。l lCMLCML时，成熟中性粒细胞的时，成熟中性粒细胞的

9、POXPOX活性增强。活性增强。现在学习的是第17页，共65页注意事项 l l已固定的血膜因为酶已破坏不能再作过氧化物酶染色。l l所用过氧化氢必须新鲜，加于血膜上应能发生泡沫。过量时红细胞可出现假阳性。l l过氧化氢的浓度要适当加减，过量则颗粒色深，不足则颗粒色淡。l l滴加过氧化氢液之后，最好将染片置于载物台上，用低倍镜观察，发现胞浆出现阳性颗粒时，立即水洗。现在学习的是第18页，共65页现在学习的是第19页，共65页糖原染色（Periodicacid-Schiffreaction,PAS）现在学习的是第20页，共65页目的 l l红白血病（+）与巨幼红细胞贫血（-）的鉴别诊断l lMDS

10、与巨幼红细胞贫血（-）的鉴别诊断l l单核细胞白血病（+）与组织细胞病（MH）的鉴别诊断l l淋巴肉瘤、何杰金病与急性淋巴细胞白血病的鉴别诊断l l高歇病与尼曼-匹克病的鉴别诊断以上都是前者增高，后者降低或阴性。现在学习的是第21页，共65页试剂-1l l10g/L10g/L过碘酸液过碘酸液l lSchiffSchiff染液：碱性品红0.5g0.5gDH2O100mlDH2 2O煮沸后待片刻，加入碱性品红，振荡数分钟使品煮沸后待片刻，加入碱性品红，振荡数分钟使品红溶解，冷至红溶解，冷至5050加入加入1M的盐酸的盐酸20ml，混匀。待冷却至2525加入偏重亚硫酸钠0.5g，混合，置于带塞的棕色

11、瓶中，放于暗处24小时。染液为无色，如为微红则加活性炭1 12g2g，混合过滤，如过滤液仍有红色，混合过滤，如过滤液仍有红色，应再加少许活性炭，至红色完全被吸收为止。制成后置应再加少许活性炭，至红色完全被吸收为止。制成后置于棕色瓶内保存在冰箱备用，如变为红色，则不能使用。于棕色瓶内保存在冰箱备用，如变为红色，则不能使用。现在学习的是第22页，共65页试剂-2 l l苏木素液：苏木素0.9g0.9g95乙醇10ml铵（钾）明矾铵（钾）明矾20g20gDHDH2 2O200ml将苏木素溶于95的乙醇，钾明矾溶于水（可加热），的乙醇，钾明矾溶于水（可加热），然后将苏木素液加入明矾液中混合，用强火煮沸

12、后加氧然后将苏木素液加入明矾液中混合，用强火煮沸后加氧化汞化汞0.5g0.5g，迅速搅拌，呈深紫色，迅速移入冷水中，次日过滤，临用时取此液95ml95ml加冰醋酸5ml，可使细，可使细胞着色清楚。胞着色清楚。现在学习的是第23页，共65页染色步骤 l l将新鲜血片或骨髓片用95乙醇固定10分钟。l l10g/L过碘酸液作用20分钟l lDH2O洗涤1分钟，晾干l lSchiff染液，60分钟l l用自来水洗涤15分钟（细水长流冲洗）l l苏木素染液10分钟。l l自来水冲洗15分钟，待干镜检。现在学习的是第24页，共65页染色原理 l l过碘酸能使细胞内的多糖乙二醇基氧化成二醛，再与Schif

13、f氏液的无色品红结合，呈红色，定位于胞浆上。现在学习的是第25页，共65页结果判断 l l正常BM：有有核核红红细细胞胞几几乎乎均均呈呈阴阴性性反反应应，在在AMLAMLM6M6，幼红细胞为，幼红细胞为PASPAS强阳性。强阳性。l l中性粒细胞：原原粒粒细细胞胞多多为为阴阴性性，早早幼幼粒粒阶阶段段开开始始呈呈PASPAS阳性，其后各阶段阳性逐渐增强。l l巨巨核核细细胞胞和和血血小小板板：不含糖原，但含粘多糖等，故巨核细胞为细小弥散的阳性，PLT为粉红色。l lALLALL：可以是密集粗块状的颗粒，也能是细小弥散的颗粒，或是这两种颗粒的混合。ALLALL的的PASPAS也可能为阴性，特别是

14、L3L3时。时。l l单核细胞白血病，原单细胞常为阴性，幼单和成熟单可有弱阳性或弥散阳性。现在学习的是第26页，共65页注意事项 l l1）Schiff液变红不能再用。l l2）碱性品红的质量很重要，如碱性品红不合格，加活性炭，颜色也不被吸附。l l如无苏木精复染液，可用1%甲绿复染25分替代。现在学习的是第27页，共65页现在学习的是第28页，共65页现在学习的是第29页，共65页现在学习的是第30页，共65页非特异性酯酶染色现在学习的是第31页，共65页原理原理 l l非特异性酯酶是作用于短链脂肪的酶，当酯酶活性存在时，水解基质中的醋酸萘酚，与重氮盐偶联，生成不溶性的有机产物，定位于胞浆上

15、。现在学习的是第32页，共65页试剂试剂l l甲醛：l l基质液：1/15M的磷酸缓冲液 PH7.4 40mll l10g/L 醋酸萘酚50丙酮液 0.8ml 重氮盐（Diazo blue B）40mg现在学习的是第33页，共65页方法方法 l l新鲜涂片用甲醛蒸汽固定新鲜涂片用甲醛蒸汽固定5分钟。分钟。l l流水冲洗流水冲洗5分钟，晾干。分钟，晾干。l l置于基质液中置于基质液中371小时，水洗泡小时，水洗泡10分钟。分钟。l l20g/L甲绿复染甲绿复染2030分钟。分钟。l l水洗，晾干，镜检。水洗，晾干，镜检。现在学习的是第34页，共65页临床意义临床意义 l l单核细胞系统呈阳性，伴

16、随着细胞的成熟而加强，对AL有鉴别诊断作用。现在学习的是第35页，共65页非特异性酯酶-氟化钠抑制试验 l l同非特异性酯酶，只是在同非特异性酯酶，只是在1ml作用液中，加入作用液中，加入1.5mg 氟化钠，即可抑制单核细胞的酯酶，氟化钠，即可抑制单核细胞的酯酶，故可作急性单核细胞白血病的鉴别诊断。故可作急性单核细胞白血病的鉴别诊断。现在学习的是第36页，共65页现在学习的是第37页，共65页现在学习的是第38页，共65页现在学习的是第39页，共65页急性白血病中的组化染色 白血病白血病白血病白血病POXNSEPASPOXNSEPASALL ALL+AML AML M0M0+M1M1+(3(3

17、原始细胞原始细胞原始细胞原始细胞)M2M2+M3M3+M4M4+（原单细胞）（原单细胞）（原单细胞）（原单细胞）M5M5/+/+/+/+M6M6+（原粒细胞）（原粒细胞）（原粒细胞）（原粒细胞）+（幼红细胞）（幼红细胞）（幼红细胞）（幼红细胞）M7M7+现在学习的是第40页，共65页中性粒细胞碱性磷酸酶染色（AKP）现在学习的是第41页，共65页目的l l鉴别白血病（低）和白血病样（高）反应鉴别白血病（低）和白血病样（高）反应l l鉴别淋巴肉瘤（高）和何杰金病鉴别淋巴肉瘤（高）和何杰金病l l鉴别细菌性感染（高）与病毒性感染鉴别细菌性感染（高）与病毒性感染 现在学习的是第42页，共65页分布

18、l l血细胞的碱性磷酸酶活性，主要见于成熟的中性血细胞的碱性磷酸酶活性，主要见于成熟的中性粒细胞，定位于胞浆中。粒细胞，定位于胞浆中。现在学习的是第43页，共65页原理 l l细胞中的细胞中的AKP在在PH9.59.6缓冲液中能使基缓冲液中能使基质中的磷酸萘酚钠水解，释放出萘酚。后者质中的磷酸萘酚钠水解，释放出萘酚。后者与一种稳定的重氮盐（常用有固紫与一种稳定的重氮盐（常用有固紫Fast-Garnet，GBC或固蓝或固蓝RR）偶联，生成不溶性的）偶联，生成不溶性的偶氮染料，沉积于细胞上。偶氮染料，沉积于细胞上。现在学习的是第44页，共65页试剂 l l95%乙醇乙醇乙醇乙醇l l固酱紫固酱紫固

19、酱紫固酱紫GBCGBCl lAS-BI磷酸萘酚磷酸萘酚12.5mg+DH2O100ml12.5mg+DH2O100mll l0.2Mtris缓缓冲冲液液：三三羟羟甲甲基基氨氨基基甲甲烷烷2.43g+DH2O溶溶溶溶至至至至100ml100ml。l l0.05Mtris缓缓冲冲液液（PH8.6-9.0）：0.20.2MMtristris缓缓冲冲液液25ml+0.1MHCL49mll l贮贮存存液液：50mlAS-BI磷磷磷磷酸酸酸酸萘萘萘萘酚酚酚酚+PH8.80.05Mtris缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液50ml混匀，冰箱保存混匀，冰箱保存l l1%1%甲基绿甲基绿甲基绿甲基绿 现在学习的是第45页

20、，共65页染色步骤 新鲜新鲜BM片及血片待干片及血片待干l l95%乙醇固定乙醇固定10分钟分钟l l固固酱酱紫紫1mg+2ml贮贮存存液液混混匀匀，立立即即滴滴加加数数滴滴在血片或在血片或BM片上，置片上，置37孵箱孵育孵箱孵育30分钟分钟l l用蒸馏水快冲用蒸馏水快冲 l l放入放入1%甲绿中复染甲绿中复染5分钟分钟l l用蒸馏水快冲，待干，镜检用蒸馏水快冲，待干，镜检 现在学习的是第46页，共65页结果判断 l l阳性颗粒呈红色，定位于成熟中性粒细胞胞浆阳性颗粒呈红色，定位于成熟中性粒细胞胞浆阳性颗粒呈红色，定位于成熟中性粒细胞胞浆阳性颗粒呈红色，定位于成熟中性粒细胞胞浆 内。内。l l

21、 计数方法，按碱酶活性强弱，分为计数方法，按碱酶活性强弱，分为计数方法，按碱酶活性强弱，分为计数方法，按碱酶活性强弱，分为0-4+0-4+共共5 5级。级。级。级。分数分数分数分数特点特点特点特点0胞浆内无红色的颗粒胞浆内无红色的颗粒胞浆内无红色的颗粒胞浆内无红色的颗粒1弥散的红色，偶见颗粒弥散的红色，偶见颗粒2弥散的红色，有中等量的颗粒弥散的红色，有中等量的颗粒弥散的红色，有中等量的颗粒弥散的红色，有中等量的颗粒3显著的红色，有较多的颗粒显著的红色，有较多的颗粒显著的红色，有较多的颗粒显著的红色，有较多的颗粒44显著的红色，有充满胞浆的粗大颗粒显著的红色，有充满胞浆的粗大颗粒现在学习的是第4

22、7页，共65页计算积分分数分数细胞数目细胞数目积分积分0200145452255035154520总数总数100130=LAP积分积分 现在学习的是第48页，共65页临床意义临床意义 l l正正正正常常常常的的的的LAPLAP积积积积分分分分是是是是2020100分分分分，但但但但因因因因为为为为计计计计数数数数的的的的主主主主观观观观性性性性，很重要的是建立每个实验室自己的正常值。很重要的是建立每个实验室自己的正常值。很重要的是建立每个实验室自己的正常值。很重要的是建立每个实验室自己的正常值。临床诊断临床诊断积分积分正常正常2020100100CML1313类白血病类白血病100真红真红10

23、0100200继发性红细胞增多继发性红细胞增多继发性红细胞增多继发性红细胞增多1010100100 现在学习的是第49页，共65页现在学习的是第50页，共65页铁粒染色铁粒染色现在学习的是第51页，共65页原理原理 l骨髓小粒中的含铁血黄素称细胞外铁，骨髓小粒中的含铁血黄素称细胞外铁，其中的三价铁与分子中的蛋白质结合其中的三价铁与分子中的蛋白质结合不牢，经稀盐酸处理后而游离出来，不牢，经稀盐酸处理后而游离出来，并能在酸性亚铁氰化钾溶液中产生普并能在酸性亚铁氰化钾溶液中产生普鲁士蓝反应。细胞内铁也可用此法显鲁士蓝反应。细胞内铁也可用此法显示。根据反应的强弱了解骨髓中铁的示。根据反应的强弱了解骨髓

24、中铁的含量。含量。现在学习的是第52页，共65页试剂试剂 l l酸性亚铁氰化钾溶液：酸性亚铁氰化钾溶液：酸性亚铁氰化钾溶液：酸性亚铁氰化钾溶液：200g/L200g/L亚铁氰化钾溶液亚铁氰化钾溶液亚铁氰化钾溶液亚铁氰化钾溶液 5 5份份份份 浓盐酸浓盐酸浓盐酸浓盐酸 1 1份份 取取200g/L200g/L亚铁氰化钾溶液置于试管中，缓缓加入浓盐亚铁氰化钾溶液置于试管中，缓缓加入浓盐亚铁氰化钾溶液置于试管中，缓缓加入浓盐亚铁氰化钾溶液置于试管中，缓缓加入浓盐酸，边滴加边摇匀，至出现白色沉淀，再滴加酸，边滴加边摇匀，至出现白色沉淀，再滴加酸，边滴加边摇匀，至出现白色沉淀，再滴加酸，边滴加边摇匀，至

25、出现白色沉淀，再滴加200g/L亚铁氰化钾，边滴加边摇匀，至白色沉淀消失为止，备亚铁氰化钾，边滴加边摇匀，至白色沉淀消失为止，备亚铁氰化钾，边滴加边摇匀，至白色沉淀消失为止，备亚铁氰化钾，边滴加边摇匀，至白色沉淀消失为止，备用。用。用。用。l l2g/L核固红硫酸铝溶液：取硫酸铝核固红硫酸铝溶液：取硫酸铝核固红硫酸铝溶液：取硫酸铝核固红硫酸铝溶液：取硫酸铝10g10g加入加入加入加入100ml 100ml DH2ODH2O再加入核固红再加入核固红EMER出品出品 0.2g，置于，置于37水水浴中浴中1小时，并经常振荡，使溶解，过滤后使用。小时，并经常振荡，使溶解，过滤后使用。现在学习的是第53

26、页，共65页方法方法l l选骨髓小粒丰富的骨髓涂片l l玻片上滴加酸性亚铁氰化钾，染色30分钟。（可置于37）l l用DH2O冲洗后用核固红染液复染1015分钟。l l流水冲洗，晾干，油镜检查。现在学习的是第54页，共65页结果结果 l l正常人细胞外铁：幼红细胞呈鲜红色，胞浆成淡黄红色，铁粒呈蓝绿色。细胞外铁的判断用低倍镜观察涂片，特别时涂片尾部和骨髓小粒附近。现在学习的是第55页，共65页细胞外铁判断标准l l无颗粒l l有少数铁颗粒或偶见铁小珠l l有较多的铁颗粒和小珠l l有很多的铁颗粒，小珠和少数小块状l l有极多的铁颗粒，小珠并有很多的小块，密集成堆现在学习的是第56页，共65页现

27、在学习的是第57页，共65页铁粒幼红细胞的分型l l1型仅含一个铁颗粒l l2型含25个铁颗粒l l3型含69个铁颗粒l l4型含10个以上的铁颗粒现在学习的是第58页，共65页现在学习的是第59页，共65页环形铁粒幼细胞 l l含铁颗粒6个以上，其中2/3以上的铁颗粒围绕核周围排列成完全环形或不完全环形（围绕核周围指分布紧靠着细胞核或靠近细胞核的1/3胞浆内，铁颗粒增多时，可分布于外2/3的胞浆内。现在学习的是第60页，共65页现在学习的是第61页，共65页临床意义临床意义 l lIDA：骨骨髓髓细细胞胞外外铁铁和和内内铁铁显显著著减减少少或或消消失失，铁铁粒粒幼幼红红细细胞胞阳阳性性率率为

28、为016，铁铁颗颗粒粒极极少少并并着着色色浅浅，以以1型型为为主主，2型型者者极极少少，3型型以以上上者者不不见见。经经铁铁剂剂治治疗疗后后细细胞胞外外铁铁和和内内铁铁可可迅迅速速增增多多，因因此此是是诊诊断断IDA和和指指导导铁铁剂剂治治疗疗的的一一种种辅辅助方法。助方法。现在学习的是第62页，共65页l l是诊断铁粒幼红细胞贫血的重要依据，能发现是诊断铁粒幼红细胞贫血的重要依据，能发现数量不等的环状铁粒幼红细胞，并且多见粗颗数量不等的环状铁粒幼红细胞，并且多见粗颗粒的粒的3型和型和4型铁粒幼红细胞。型铁粒幼红细胞。现在学习的是第63页，共65页注意事项注意事项 l l玻玻片片必必须须经经无无铁铁处处理理：将将新新玻玻片片经经清清洁洁液液浸浸泡泡24小小时时，取取出出后后反反复复水水洗洗浸浸入入95酒酒精精24小小时时，晾晾干干，再再浸浸泡泡在在5盐盐酸酸中中24小小时时，用用D2H2O反复洗玻片，取出烤干后备用。反复洗玻片，取出烤干后备用。l l酸性亚铁氰化钾液必须新鲜配制。酸性亚铁氰化钾液必须新鲜配制。l l最好用骨髓小粒丰富的骨髓涂片进行染色并作最好用骨髓小粒丰富的骨髓涂片进行染色并作细胞外铁观察。细胞外铁观察。现在学习的是第64页，共65页感谢大家观看现在学习的是第65页，共65页