分子杂交技术hu讲稿.ppt

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1、分子杂交技术hu第一页，讲稿共一百二十九页哦BasicPrincipleDenatureHybridizeSouthern,FishPCRProtein:Antigen-antibodyinteractionDNA:denaturationandhybridizationofthehelixstructure第二页，讲稿共一百二十九页哦第十章第十章 分子杂交技术分子杂交技术第一节第一节 分子杂交分子杂交第二节第二节 核酸杂交简史与原理核酸杂交简史与原理第三节第三节 核酸探针标记的方法核酸探针标记的方法第四节第四节 核酸分子杂交因素核酸分子杂交因素第五节第五节 几种常见的杂交几种常见的杂交第六节

2、第六节 其他类型杂交介绍其他类型杂交介绍第七节第七节 原位杂交原位杂交第三页，讲稿共一百二十九页哦第一节第一节 分子杂交分子杂交1.1 原位分子杂交原位分子杂交（in situ hybridization）1.2 斑点杂交（斑点杂交（dot blotting）1.4 Northern hybridization1.5 Western blotting1.6 电镜观察电镜观察第四页，讲稿共一百二十九页哦1.1 原位分子杂交原位分子杂交（in situ hybridizationin situ hybridization）原位分子杂交有两种原位分子杂交有两种:玻片原位杂交玻片原位杂交膜上原位杂交膜

3、上原位杂交第五页，讲稿共一百二十九页哦玻片原位杂交玻片原位杂交玻片原位杂交玻片原位杂交 一般都先要制片，如中期染色体片和组织切片等一般都先要制片，如中期染色体片和组织切片等一般都先要制片，如中期染色体片和组织切片等一般都先要制片，如中期染色体片和组织切片等;片子制好后不染色，放在缓冲溶液中缓缓变性，然后片子制好后不染色，放在缓冲溶液中缓缓变性，然后片子制好后不染色，放在缓冲溶液中缓缓变性，然后片子制好后不染色，放在缓冲溶液中缓缓变性，然后再加入探针让其复性，将没有结合的探针充分洗脱；再加入探针让其复性，将没有结合的探针充分洗脱；再加入探针让其复性，将没有结合的探针充分洗脱；再加入探针让其复性，

4、将没有结合的探针充分洗脱；若是同位素标记探针，就须在片子涂一层乳胶或复若是同位素标记探针，就须在片子涂一层乳胶或复若是同位素标记探针，就须在片子涂一层乳胶或复若是同位素标记探针，就须在片子涂一层乳胶或复盖上一张同样大小盖上一张同样大小盖上一张同样大小盖上一张同样大小X X光片进行放射自显影，然后观光片进行放射自显影，然后观光片进行放射自显影，然后观光片进行放射自显影，然后观察同位素的爆光点在组织细胞或染色体上的相对位察同位素的爆光点在组织细胞或染色体上的相对位察同位素的爆光点在组织细胞或染色体上的相对位察同位素的爆光点在组织细胞或染色体上的相对位置。置。置。置。如用荧光标记可用荧光显微镜直接观

5、察。如用荧光标记可用荧光显微镜直接观察。如用荧光标记可用荧光显微镜直接观察。如用荧光标记可用荧光显微镜直接观察。第六页，讲稿共一百二十九页哦膜上分子杂交膜上分子杂交膜上分子杂交膜上分子杂交 将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜上（以前用硝酸纤维膜），将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜上（以前用硝酸纤维膜），将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜上（以前用硝酸纤维膜），将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜上（以前用硝酸纤维膜），这种膜只吸附单链这种膜只吸附单链这种膜只吸附单链这种膜只吸附单链DNADNA。将影印好的膜用将影印好的膜用将影印好的膜用将影印好的膜用NaOHNaOH处理，这样不仅可以杀死细菌，处理，这样不仅可以杀死细菌，处理

6、，这样不仅可以杀死细菌，处理，这样不仅可以杀死细菌，同时可使同时可使同时可使同时可使DNADNA变性吸附在膜上；变性吸附在膜上；变性吸附在膜上；变性吸附在膜上；然后用无关的单链然后用无关的单链然后用无关的单链然后用无关的单链DNADNA，如常用小牛胸腺，如常用小牛胸腺，如常用小牛胸腺，如常用小牛胸腺DNADNA和鲑鱼和鲑鱼和鲑鱼和鲑鱼精子精子精子精子DNADNA吸附到膜上的空白处，称预杂交，防止探针被吸附到膜上的空白处，称预杂交，防止探针被吸附到膜上的空白处，称预杂交，防止探针被吸附到膜上的空白处，称预杂交，防止探针被吸附在背景上，干挠实验结果。吸附在背景上，干挠实验结果。吸附在背景上，干挠实

7、验结果。吸附在背景上，干挠实验结果。膜经中和后再将同位素探针和膜放在缓冲溶液中缓膜经中和后再将同位素探针和膜放在缓冲溶液中缓膜经中和后再将同位素探针和膜放在缓冲溶液中缓膜经中和后再将同位素探针和膜放在缓冲溶液中缓缓复性，经放射自显影来确定阳性菌落。缓复性，经放射自显影来确定阳性菌落。缓复性，经放射自显影来确定阳性菌落。缓复性，经放射自显影来确定阳性菌落。第七页，讲稿共一百二十九页哦1.2 1.2 斑点杂交（斑点杂交（斑点杂交（斑点杂交（dot blottingdot blotting）也叫狭缝杂交。是由也叫狭缝杂交。是由也叫狭缝杂交。是由也叫狭缝杂交。是由Southern blotSouthe

8、rn blot衍生而来。方法是衍生而来。方法是衍生而来。方法是衍生而来。方法是将某种生物的总将某种生物的总将某种生物的总将某种生物的总DNADNA直接点滴在尼龙膜上，或者通过一直接点滴在尼龙膜上，或者通过一直接点滴在尼龙膜上，或者通过一直接点滴在尼龙膜上，或者通过一个小的长形狭缝印在尼龙膜上，将后将膜变性处理，预杂个小的长形狭缝印在尼龙膜上，将后将膜变性处理，预杂个小的长形狭缝印在尼龙膜上，将后将膜变性处理，预杂个小的长形狭缝印在尼龙膜上，将后将膜变性处理，预杂交后，经中和、洗脱、干燥。交后，经中和、洗脱、干燥。交后，经中和、洗脱、干燥。交后，经中和、洗脱、干燥。再将其和探针放入复性缓冲溶液中

9、缓缓复性，洗涤干再将其和探针放入复性缓冲溶液中缓缓复性，洗涤干再将其和探针放入复性缓冲溶液中缓缓复性，洗涤干再将其和探针放入复性缓冲溶液中缓缓复性，洗涤干燥后进行放射自显影，观察结果。这种方法是用来初燥后进行放射自显影，观察结果。这种方法是用来初燥后进行放射自显影，观察结果。这种方法是用来初燥后进行放射自显影，观察结果。这种方法是用来初步探测某种生物中含有一种特殊的基因或顺序。来分步探测某种生物中含有一种特殊的基因或顺序。来分步探测某种生物中含有一种特殊的基因或顺序。来分步探测某种生物中含有一种特殊的基因或顺序。来分析析析析DNADNA样品之间的同源性。样品之间的同源性。样品之间的同源性。样品

10、之间的同源性。此法因有假阳性的存在，所以发现阳性斑后还要进一此法因有假阳性的存在，所以发现阳性斑后还要进一此法因有假阳性的存在，所以发现阳性斑后还要进一此法因有假阳性的存在，所以发现阳性斑后还要进一步做步做步做步做Southern blottingSouthern blotting加以验证。加以验证。加以验证。加以验证。第八页，讲稿共一百二十九页哦1.3 Southern blotting1.3 Southern blotting 该技术是该技术是该技术是该技术是SouthernSouthern，E.ME.M于于于于19751975年首先建立的，故称为年首先建立的，故称为年首先建立的，故称为年

11、首先建立的，故称为SouthernSouthern杂交，该方法经杂交，该方法经杂交，该方法经杂交，该方法经SouthernSouthern印迹法将胶上的电印迹法将胶上的电印迹法将胶上的电印迹法将胶上的电泳条带吸印尼龙膜上，然后和泳条带吸印尼龙膜上，然后和泳条带吸印尼龙膜上，然后和泳条带吸印尼龙膜上，然后和DNADNA探针杂交。探针杂交。探针杂交。探针杂交。用这种方法可以制作染色体的物理图谱，限制性片用这种方法可以制作染色体的物理图谱，限制性片用这种方法可以制作染色体的物理图谱，限制性片用这种方法可以制作染色体的物理图谱，限制性片段长度的多态性，及动物园吸印（段长度的多态性，及动物园吸印（段长度

12、的多态性，及动物园吸印（段长度的多态性，及动物园吸印（Zoo blotZoo blot）（用）（用）（用）（用一个物种的一个物种的一个物种的一个物种的DNADNA探针和别种动物的探针和别种动物的探针和别种动物的探针和别种动物的DNADNA进行进行进行进行Southern Southern blottingblotting）等。）等。）等。）等。第九页，讲稿共一百二十九页哦1.4 Northern hybridization1.4 Northern hybridization NorthernNorthern杂交的技术和杂交的技术和杂交的技术和杂交的技术和SouthernSouthern杂交相似

13、，作者并不姓杂交相似，作者并不姓杂交相似，作者并不姓杂交相似，作者并不姓“Northern”Northern”，因，因，因，因“Southern”Southern”意为意为意为意为“南方南方南方南方”，故戏称自己的分析方，故戏称自己的分析方，故戏称自己的分析方，故戏称自己的分析方法为法为法为法为“北方北方北方北方”“”“（NorthernNorthern）杂交。）杂交。）杂交。）杂交。Northern Northern 杂交与杂交与杂交与杂交与SouthernSouthern杂交主要的不同之处在于检验杂交主要的不同之处在于检验杂交主要的不同之处在于检验杂交主要的不同之处在于检验RNARNA，而

14、，而，而，而不是不是不是不是DNADNA。首先是提取某种生物或组织的总首先是提取某种生物或组织的总首先是提取某种生物或组织的总首先是提取某种生物或组织的总RNARNA或或或或mRNAmRNA，然后用含有变，然后用含有变，然后用含有变，然后用含有变性剂的琼脂糖凝胶电泳分离性剂的琼脂糖凝胶电泳分离性剂的琼脂糖凝胶电泳分离性剂的琼脂糖凝胶电泳分离RNARNA，变性剂的作用是防止，变性剂的作用是防止，变性剂的作用是防止，变性剂的作用是防止RNARNA自自自自我退火形成局部双链，影响泳动率，干扰实验结果。我退火形成局部双链，影响泳动率，干扰实验结果。我退火形成局部双链，影响泳动率，干扰实验结果。我退火形

15、成局部双链，影响泳动率，干扰实验结果。电泳分离后再将凝胶上的电泳分离后再将凝胶上的电泳分离后再将凝胶上的电泳分离后再将凝胶上的RNARNA带吸印到尼龙膜上，在液相中和带吸印到尼龙膜上，在液相中和带吸印到尼龙膜上，在液相中和带吸印到尼龙膜上，在液相中和标记的核酸探针进行杂交。用此方法可以测定某基因表达的时标记的核酸探针进行杂交。用此方法可以测定某基因表达的时标记的核酸探针进行杂交。用此方法可以测定某基因表达的时标记的核酸探针进行杂交。用此方法可以测定某基因表达的时空特异性。空特异性。空特异性。空特异性。第十页，讲稿共一百二十九页哦1.5 Western blotting1.5 Western b

16、lotting 既然有了既然有了既然有了既然有了“南方南方南方南方”杂交，杂交，杂交，杂交，“北方北方北方北方”杂交，那么随之杂交，那么随之杂交，那么随之杂交，那么随之而来的就是而来的就是而来的就是而来的就是“西方西方西方西方”杂交（杂交（杂交（杂交（Western blottingWestern blotting），但），但），但），但Western blottingWestern blotting和前面的几种杂交都不相同，它是用来和前面的几种杂交都不相同，它是用来和前面的几种杂交都不相同，它是用来和前面的几种杂交都不相同，它是用来测蛋白而不是检测核酸。测蛋白而不是检测核酸。测蛋白而不是检测

17、核酸。测蛋白而不是检测核酸。此法是由电场的作用将聚丙烯酰胺的电泳胶上的蛋白质带此法是由电场的作用将聚丙烯酰胺的电泳胶上的蛋白质带此法是由电场的作用将聚丙烯酰胺的电泳胶上的蛋白质带此法是由电场的作用将聚丙烯酰胺的电泳胶上的蛋白质带转移到尼龙膜上，以亲和反应或免疫反应或结合反应测定转移到尼龙膜上，以亲和反应或免疫反应或结合反应测定转移到尼龙膜上，以亲和反应或免疫反应或结合反应测定转移到尼龙膜上，以亲和反应或免疫反应或结合反应测定蛋白质技术。蛋白质技术。蛋白质技术。蛋白质技术。第十一页，讲稿共一百二十九页哦1.6 1.6 电镜观察电镜观察电镜观察电镜观察 先进行分子杂交，再通过电镜观察可以进行基因定

18、位，内含先进行分子杂交，再通过电镜观察可以进行基因定位，内含先进行分子杂交，再通过电镜观察可以进行基因定位，内含先进行分子杂交，再通过电镜观察可以进行基因定位，内含子的探测以及缺失的确定等。子的探测以及缺失的确定等。子的探测以及缺失的确定等。子的探测以及缺失的确定等。断裂基因就是用这种方法发现的。断裂基因就是用这种方法发现的。断裂基因就是用这种方法发现的。断裂基因就是用这种方法发现的。电镜观察有二种，一是异源双链定位法（电镜观察有二种，一是异源双链定位法（电镜观察有二种，一是异源双链定位法（电镜观察有二种，一是异源双链定位法（Heferoduplex mappingHeferoduplex m

19、apping），），），），二是二是二是二是R-R-环定位法（环定位法（环定位法（环定位法（R-loop mappingR-loop mapping）将异源将异源将异源将异源DNADNA双链变性后进行分子杂交，然后制片在电镜下观察，双链变性后进行分子杂交，然后制片在电镜下观察，双链变性后进行分子杂交，然后制片在电镜下观察，双链变性后进行分子杂交，然后制片在电镜下观察，可发现环形不配对的部分，表明可能存在缺失。可发现环形不配对的部分，表明可能存在缺失。可发现环形不配对的部分，表明可能存在缺失。可发现环形不配对的部分，表明可能存在缺失。R-R-环法是将标记的环法是将标记的环法是将标记的环法是将标记

20、的mRNAmRNA和变性后的待测双链和变性后的待测双链和变性后的待测双链和变性后的待测双链DNADNA进行杂交，进行杂交，进行杂交，进行杂交，制片后，可以观察到制片后，可以观察到制片后，可以观察到制片后，可以观察到R-R-环，这是由于环，这是由于环，这是由于环，这是由于RNARNA形成的双链比原来的形成的双链比原来的形成的双链比原来的形成的双链比原来的DNADNA双链更为稳定，将一条双链更为稳定，将一条双链更为稳定，将一条双链更为稳定，将一条DNADNA单链置换了出来，表明该单链置换了出来，表明该单链置换了出来，表明该单链置换了出来，表明该mRNAmRNA基因就位于基因就位于基因就位于基因就位

21、于R-R-环这个位置。环这个位置。环这个位置。环这个位置。第十二页，讲稿共一百二十九页哦第二节第二节 核酸杂交简史与原理核酸杂交简史与原理2.1 核酸杂交技术简史核酸杂交技术简史2.2 核酸杂交原理核酸杂交原理第十三页，讲稿共一百二十九页哦2.1 2.1 核酸杂交技术简史核酸杂交技术简史核酸杂交技术简史核酸杂交技术简史19611961年，年，年，年，HallHall等开始进行探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡等开始进行探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡等开始进行探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡等开始进行探针与靶序列在溶液中杂交，通过平衡密度梯度离心分离杂交体。开拓了核酸杂交技术的研究。密度梯

22、度离心分离杂交体。开拓了核酸杂交技术的研究。密度梯度离心分离杂交体。开拓了核酸杂交技术的研究。密度梯度离心分离杂交体。开拓了核酸杂交技术的研究。19621962年，年，年，年，BoltonBolton等设计了第一种简单的固相杂交方法，称为等设计了第一种简单的固相杂交方法，称为等设计了第一种简单的固相杂交方法，称为等设计了第一种简单的固相杂交方法，称为DNA-DNA-琼脂技术。琼脂技术。琼脂技术。琼脂技术。变性变性变性变性DNADNA固定在琼脂中，固定在琼脂中，固定在琼脂中，固定在琼脂中，DNADNA不能复性，但能与其它互补核酸不能复性，但能与其它互补核酸不能复性，但能与其它互补核酸不能复性，但

23、能与其它互补核酸序列杂交。序列杂交。序列杂交。序列杂交。用放射性标记的短用放射性标记的短用放射性标记的短用放射性标记的短DANDAN或或或或RNARNA分子与胶中分子与胶中分子与胶中分子与胶中DNADNA杂交过夜，然后将杂交过夜，然后将杂交过夜，然后将杂交过夜，然后将胶置于柱中进行漂洗，去除游离探针。胶置于柱中进行漂洗，去除游离探针。胶置于柱中进行漂洗，去除游离探针。胶置于柱中进行漂洗，去除游离探针。在高温、低盐条件下将结合的探针洗脱，洗脱液的放射性与结合在高温、低盐条件下将结合的探针洗脱，洗脱液的放射性与结合在高温、低盐条件下将结合的探针洗脱，洗脱液的放射性与结合在高温、低盐条件下将结合的探

24、针洗脱，洗脱液的放射性与结合的探针量呈正比。的探针量呈正比。的探针量呈正比。的探针量呈正比。第十四页，讲稿共一百二十九页哦 上世纪上世纪上世纪上世纪6060年代中期，年代中期，年代中期，年代中期，Nygaard Nygaard 等的研究为应用标记等的研究为应用标记等的研究为应用标记等的研究为应用标记DNADNA或或或或RNARNA探探探探针检测固定在硝酸纤维素（针检测固定在硝酸纤维素（针检测固定在硝酸纤维素（针检测固定在硝酸纤维素（NCNC）膜上的）膜上的）膜上的）膜上的DNADNA序列奠定了基础。序列奠定了基础。序列奠定了基础。序列奠定了基础。如如如如BrownBrown等应用这一技术评估了

25、爪蟾等应用这一技术评估了爪蟾等应用这一技术评估了爪蟾等应用这一技术评估了爪蟾rRNArRNA基因的拷贝数。基因的拷贝数。基因的拷贝数。基因的拷贝数。RNARNA在在在在代谢过程中被代谢过程中被代谢过程中被代谢过程中被3 3HH尿嘧啶标记，并在过量的情况下与膜上固定尿嘧啶标记，并在过量的情况下与膜上固定尿嘧啶标记，并在过量的情况下与膜上固定尿嘧啶标记，并在过量的情况下与膜上固定的基因组的基因组的基因组的基因组DNADNA杂交，继而用杂交，继而用杂交，继而用杂交，继而用RNaseRNase处理，消化非特异性结合的处理，消化非特异性结合的处理，消化非特异性结合的处理，消化非特异性结合的RNARNA。

26、漂洗后计数以测定杂交探针的量。漂洗后计数以测定杂交探针的量。漂洗后计数以测定杂交探针的量。漂洗后计数以测定杂交探针的量。通过计算与已知量通过计算与已知量通过计算与已知量通过计算与已知量DNADNA杂交的杂交的杂交的杂交的RNARNA量即可评估量即可评估量即可评估量即可评估rRNArRNA基因数。基因数。基因数。基因数。由于当时缺乏特异探针，这种方法不能用于研究其它特异基因由于当时缺乏特异探针，这种方法不能用于研究其它特异基因由于当时缺乏特异探针，这种方法不能用于研究其它特异基因由于当时缺乏特异探针，这种方法不能用于研究其它特异基因的表达，这些早期过量探针膜杂交试验实际上是现代膜杂交实的表达，这

27、些早期过量探针膜杂交试验实际上是现代膜杂交实的表达，这些早期过量探针膜杂交试验实际上是现代膜杂交实的表达，这些早期过量探针膜杂交试验实际上是现代膜杂交实验的基础。验的基础。验的基础。验的基础。第十五页，讲稿共一百二十九页哦上世纪上世纪上世纪上世纪6060年代末，年代末，年代末，年代末，BrittenBritten等设计了另一种分析细胞基因等设计了另一种分析细胞基因等设计了另一种分析细胞基因等设计了另一种分析细胞基因组的方法。研究液相中组的方法。研究液相中组的方法。研究液相中组的方法。研究液相中DNADNA的复性以比较不同来源核酸的复性以比较不同来源核酸的复性以比较不同来源核酸的复性以比较不同来

28、源核酸的复杂度，的复杂度，的复杂度，的复杂度，从不同生物体（细菌、酵母、鱼和哺乳动物等）内从不同生物体（细菌、酵母、鱼和哺乳动物等）内从不同生物体（细菌、酵母、鱼和哺乳动物等）内从不同生物体（细菌、酵母、鱼和哺乳动物等）内分离分离分离分离DNADNA，用水压器剪切成长约，用水压器剪切成长约，用水压器剪切成长约，用水压器剪切成长约450450核苷酸（核苷酸（核苷酸（核苷酸（ntnt）的片）的片）的片）的片段。剪切的段。剪切的段。剪切的段。剪切的DNADNA液，经煮沸使液，经煮沸使液，经煮沸使液，经煮沸使dsDNAdsDNA热变性成热变性成热变性成热变性成ssDNAssDNA。然后冷至约。然后冷至

29、约。然后冷至约。然后冷至约6060，在此温度孵育过程中，测定溶液一，在此温度孵育过程中，测定溶液一，在此温度孵育过程中，测定溶液一，在此温度孵育过程中，测定溶液一定时间内的定时间内的定时间内的定时间内的UV260nmUV260nm的吸光度（减色效应）来监测的吸光度（减色效应）来监测的吸光度（减色效应）来监测的吸光度（减色效应）来监测互补链的复性程度。互补链的复性程度。互补链的复性程度。互补链的复性程度。该实验可比较不同来源生物该实验可比较不同来源生物该实验可比较不同来源生物该实验可比较不同来源生物DNADNA的复性速率，并可建的复性速率，并可建的复性速率，并可建的复性速率，并可建立序列复杂度与

30、动力学复杂度间的关系。立序列复杂度与动力学复杂度间的关系。立序列复杂度与动力学复杂度间的关系。立序列复杂度与动力学复杂度间的关系。第十六页，讲稿共一百二十九页哦进入进入进入进入7070年代早期，许多重要的发展促进了核酸杂交技术的进展。年代早期，许多重要的发展促进了核酸杂交技术的进展。年代早期，许多重要的发展促进了核酸杂交技术的进展。年代早期，许多重要的发展促进了核酸杂交技术的进展。例如：例如：例如：例如：对特异基因转录产物的分析和对动力学杂交实验的研究。对特异基因转录产物的分析和对动力学杂交实验的研究。对特异基因转录产物的分析和对动力学杂交实验的研究。对特异基因转录产物的分析和对动力学杂交实验

31、的研究。固相化的固相化的固相化的固相化的Poly U SepharosePoly U Sepharose和寡（和寡（和寡（和寡（dTdT）-纤维素使人们能纤维素使人们能纤维素使人们能纤维素使人们能从总从总从总从总RNARNA中分离中分离中分离中分离Poly A+RNAPoly A+RNA。用用用用mRNAmRNA的经纯化技术可从网织红细胞总的经纯化技术可从网织红细胞总的经纯化技术可从网织红细胞总的经纯化技术可从网织红细胞总RNARNA中制备中制备中制备中制备-和和和和-珠蛋白珠蛋白珠蛋白珠蛋白mRNAmRNA混合物。这些珠蛋白混合物。这些珠蛋白混合物。这些珠蛋白混合物。这些珠蛋白mRNAmRN

32、A首次被用于合首次被用于合首次被用于合首次被用于合成特异的探针以分析珠蛋白基因的表达。成特异的探针以分析珠蛋白基因的表达。成特异的探针以分析珠蛋白基因的表达。成特异的探针以分析珠蛋白基因的表达。由于制备由于制备由于制备由于制备cDNAcDNA探针很繁琐，所获得探针很繁琐，所获得探针很繁琐，所获得探针很繁琐，所获得cDNAcDNA的长度和纯度也不的长度和纯度也不的长度和纯度也不的长度和纯度也不稳定。所以寻求新的探针来源是使分子杂交技术进一步推稳定。所以寻求新的探针来源是使分子杂交技术进一步推稳定。所以寻求新的探针来源是使分子杂交技术进一步推稳定。所以寻求新的探针来源是使分子杂交技术进一步推广的基

33、础。广的基础。广的基础。广的基础。第十七页，讲稿共一百二十九页哦7070年代末期到年代末期到年代末期到年代末期到8080年代早期，分子生物学技术有了突破年代早期，分子生物学技术有了突破年代早期，分子生物学技术有了突破年代早期，分子生物学技术有了突破性进展。性进展。性进展。性进展。限制性内切酶的发展和应用使分子克隆成为可能。限制性内切酶的发展和应用使分子克隆成为可能。限制性内切酶的发展和应用使分子克隆成为可能。限制性内切酶的发展和应用使分子克隆成为可能。各种载体系统的诞生，尤其是质粒和噬菌体各种载体系统的诞生，尤其是质粒和噬菌体各种载体系统的诞生，尤其是质粒和噬菌体各种载体系统的诞生，尤其是质粒

34、和噬菌体DANDAN载体的载体的载体的载体的构建，使特异性构建，使特异性构建，使特异性构建，使特异性DNADNA探针的来源变得十分丰富。探针的来源变得十分丰富。探针的来源变得十分丰富。探针的来源变得十分丰富。人们可以从基因组人们可以从基因组人们可以从基因组人们可以从基因组DNADNA文库和文库和文库和文库和cDNAcDNA文库中获得特定文库中获得特定文库中获得特定文库中获得特定基因克隆，只需培养细菌，便可提取大量的探针基因克隆，只需培养细菌，便可提取大量的探针基因克隆，只需培养细菌，便可提取大量的探针基因克隆，只需培养细菌，便可提取大量的探针DNADNA。迄今为止，已克隆和定性了许多特异。迄今

35、为止，已克隆和定性了许多特异。迄今为止，已克隆和定性了许多特异。迄今为止，已克隆和定性了许多特异DNADNA探针。探针。探针。探针。第十八页，讲稿共一百二十九页哦由于固相化学技术和核酸自动合成仪的诞由于固相化学技术和核酸自动合成仪的诞生，现在可常规制备生，现在可常规制备18100个碱基的寡核个碱基的寡核苷酸探针。苷酸探针。应用限制酶和应用限制酶和Southern印迹技术，用数微克印迹技术，用数微克DNA就可分析特异基因。就可分析特异基因。特异特异DNA或或RNA序列的量和大小均可用序列的量和大小均可用Southern印迹和印迹和Northern印迹来测定，与以印迹来测定，与以前的技术相比，大大

36、提高了杂交水平和可前的技术相比，大大提高了杂交水平和可信度。信度。第十九页，讲稿共一百二十九页哦2.2 核酸杂交原理核酸杂交原理分子杂交分子杂交(简称杂交，简称杂交，hybridization)是核酸是核酸研究中一项最基本的实验技术。研究中一项最基本的实验技术。应用核酸分子的变性和复性的性质，使来应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的源不同的DNA(或或RNA)片段，按碱基互补片段，按碱基互补关系形成杂交双链分子关系形成杂交双链分子(heteroduplex)。杂。杂交双链可以在交双链可以在DNA与与DNA链之间，也可在链之间，也可在RNA与与DNA链之间形成。链之间形成。第二十页，讲稿

37、共一百二十九页哦荧光原位杂交荧光原位杂交第二十一页，讲稿共一百二十九页哦2.2.1 2.2.1 制备样品制备样品制备样品制备样品 首先需要从待检测组织样品提取首先需要从待检测组织样品提取首先需要从待检测组织样品提取首先需要从待检测组织样品提取DNADNA或或或或RNARNA。用限制性内切酶消化用限制性内切酶消化用限制性内切酶消化用限制性内切酶消化DNADNA以产生特定长度的片段，以产生特定长度的片段，以产生特定长度的片段，以产生特定长度的片段，然后通过凝胶电泳将消化产物按分子大小进行分离。然后通过凝胶电泳将消化产物按分子大小进行分离。然后通过凝胶电泳将消化产物按分子大小进行分离。然后通过凝胶电

38、泳将消化产物按分子大小进行分离。将含有将含有将含有将含有DNADNA片段的凝胶进行变性处理，转印到支持膜片段的凝胶进行变性处理，转印到支持膜片段的凝胶进行变性处理，转印到支持膜片段的凝胶进行变性处理，转印到支持膜上并使其牢固结合。上并使其牢固结合。上并使其牢固结合。上并使其牢固结合。RNARNA样品则可直接在变性条件下电泳分离，然后转印样品则可直接在变性条件下电泳分离，然后转印样品则可直接在变性条件下电泳分离，然后转印样品则可直接在变性条件下电泳分离，然后转印并交联固定。并交联固定。并交联固定。并交联固定。第二十二页，讲稿共一百二十九页哦2.2.2 2.2.2 制备探针制备探针制备探针制备探针

39、 探针是指一段能和待检测核酸分子依碱基配对原则而结合的核酸探针是指一段能和待检测核酸分子依碱基配对原则而结合的核酸探针是指一段能和待检测核酸分子依碱基配对原则而结合的核酸探针是指一段能和待检测核酸分子依碱基配对原则而结合的核酸片段。片段。片段。片段。作为探针的已知作为探针的已知作为探针的已知作为探针的已知DNADNA或或或或RNARNA片段一般为片段一般为片段一般为片段一般为30305050核苷酸长，可用核苷酸长，可用核苷酸长，可用核苷酸长，可用化学方法合成或者直接利用从特定细胞中提取的化学方法合成或者直接利用从特定细胞中提取的化学方法合成或者直接利用从特定细胞中提取的化学方法合成或者直接利用

40、从特定细胞中提取的mRNAmRNA。在核酸杂交实验中，探针需要被标记上可直接检测的元素或分子。在核酸杂交实验中，探针需要被标记上可直接检测的元素或分子。在核酸杂交实验中，探针需要被标记上可直接检测的元素或分子。在核酸杂交实验中，探针需要被标记上可直接检测的元素或分子。标记常用的为同位素标记法和生物素标记法。标记常用的为同位素标记法和生物素标记法。标记常用的为同位素标记法和生物素标记法。标记常用的为同位素标记法和生物素标记法。通过检测与膜上的核酸分子结合上的探针分子，既可知道被检测的核通过检测与膜上的核酸分子结合上的探针分子，既可知道被检测的核通过检测与膜上的核酸分子结合上的探针分子，既可知道被

41、检测的核通过检测与膜上的核酸分子结合上的探针分子，既可知道被检测的核酸片段在膜上的位置，也就是在电泳凝胶上的位置，也就知道了它的酸片段在膜上的位置，也就是在电泳凝胶上的位置，也就知道了它的酸片段在膜上的位置，也就是在电泳凝胶上的位置，也就知道了它的酸片段在膜上的位置，也就是在电泳凝胶上的位置，也就知道了它的分子大小。分子大小。分子大小。分子大小。第二十三页，讲稿共一百二十九页哦2.2.3 2.2.3 杂交杂交杂交杂交 杂交方法又可分为液相杂交和固相杂交。杂交方法又可分为液相杂交和固相杂交。杂交方法又可分为液相杂交和固相杂交。杂交方法又可分为液相杂交和固相杂交。应用较多固相杂交：先将待测单链核酸

42、样品（如为双链，应用较多固相杂交：先将待测单链核酸样品（如为双链，应用较多固相杂交：先将待测单链核酸样品（如为双链，应用较多固相杂交：先将待测单链核酸样品（如为双链，则须先变性成为单链）结合到硝酸纤维素膜上，然后与溶则须先变性成为单链）结合到硝酸纤维素膜上，然后与溶则须先变性成为单链）结合到硝酸纤维素膜上，然后与溶则须先变性成为单链）结合到硝酸纤维素膜上，然后与溶液中标记探针进行杂交。液中标记探针进行杂交。液中标记探针进行杂交。液中标记探针进行杂交。首先要进行预杂交，即用非特异的核酸溶液封闭膜上首先要进行预杂交，即用非特异的核酸溶液封闭膜上首先要进行预杂交，即用非特异的核酸溶液封闭膜上首先要进

43、行预杂交，即用非特异的核酸溶液封闭膜上的非特异性结合位点。的非特异性结合位点。的非特异性结合位点。的非特异性结合位点。杂交过程中只需变性标记好的探针，再让探针与膜杂交过程中只需变性标记好的探针，再让探针与膜杂交过程中只需变性标记好的探针，再让探针与膜杂交过程中只需变性标记好的探针，再让探针与膜在特定的温度下反应，然后洗去未结合的探针分子在特定的温度下反应，然后洗去未结合的探针分子在特定的温度下反应，然后洗去未结合的探针分子在特定的温度下反应，然后洗去未结合的探针分子即可。即可。即可。即可。第二十四页，讲稿共一百二十九页哦2.2.4 2.2.4 检测检测检测检测 检测的方法依标记探针的方法而异。

44、检测的方法依标记探针的方法而异。检测的方法依标记探针的方法而异。检测的方法依标记探针的方法而异。用放射性同位素标记的探针需要用放射自显影来检测其在用放射性同位素标记的探针需要用放射自显影来检测其在用放射性同位素标记的探针需要用放射自显影来检测其在用放射性同位素标记的探针需要用放射自显影来检测其在膜上的位置；膜上的位置；膜上的位置；膜上的位置；用生物素等非同位素方法标记的探针则需要用相应的免用生物素等非同位素方法标记的探针则需要用相应的免用生物素等非同位素方法标记的探针则需要用相应的免用生物素等非同位素方法标记的探针则需要用相应的免疫组织化学的方法进行检测。疫组织化学的方法进行检测。疫组织化学的

45、方法进行检测。疫组织化学的方法进行检测。第二十五页，讲稿共一百二十九页哦第三节第三节 核酸探针标记的方法核酸探针标记的方法3.1 双链双链DNA探针及其标记方法探针及其标记方法3.2 单链单链DNA探针探针3.3 寡核苷酸探针寡核苷酸探针3.4 RNA探针探针第二十六页，讲稿共一百二十九页哦核酸探针根据核酸的性质，可分为核酸探针根据核酸的性质，可分为DNA和和RNA探针；探针；根据是否使用放射性标记物的与否，可分根据是否使用放射性标记物的与否，可分为放射性标记探针和非放射性标记探针；为放射性标记探针和非放射性标记探针；根据是否存在互补链，可分为单链和双链根据是否存在互补链，可分为单链和双链探针

46、；探针；根据放射性标记物掺入情况，可分为均匀根据放射性标记物掺入情况，可分为均匀标记和末端标记探针。标记和末端标记探针。第二十七页，讲稿共一百二十九页哦第二十八页，讲稿共一百二十九页哦3.1 双链双链DNA探针及其标记方法探针及其标记方法 分子生物研究中，最常用的探针即为双链分子生物研究中，最常用的探针即为双链DNA探针，它广泛应用于基因的鉴定、临探针，它广泛应用于基因的鉴定、临床诊断等方面。床诊断等方面。双链双链DNA探针的合成方法主要有下列两种探针的合成方法主要有下列两种:切口平移法和随机引物合成法。切口平移法和随机引物合成法。第二十九页，讲稿共一百二十九页哦3.1.1 3.1.1 切口平

47、移法切口平移法切口平移法切口平移法(nick translation)(nick translation)当双链当双链当双链当双链DNADNA分子的一条链上产生切口时，分子的一条链上产生切口时，分子的一条链上产生切口时，分子的一条链上产生切口时，E.coli DNAE.coli DNA聚聚聚聚合酶合酶合酶合酶就可将核苷酸连接到切口的就可将核苷酸连接到切口的就可将核苷酸连接到切口的就可将核苷酸连接到切口的33羟基末端。羟基末端。羟基末端。羟基末端。该酶同时具有从该酶同时具有从该酶同时具有从该酶同时具有从5353的核酸外切酶活性，能从切口的的核酸外切酶活性，能从切口的的核酸外切酶活性，能从切口的的

48、核酸外切酶活性，能从切口的55端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的33端端端端补上核苷酸，从而使切口沿着补上核苷酸，从而使切口沿着补上核苷酸，从而使切口沿着补上核苷酸，从而使切口沿着DNADNA链移动，用放射性链移动，用放射性链移动，用放射性链移动，用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位

49、素掺入到合成新链中。到合成新链中。到合成新链中。到合成新链中。最合适的切口平移片段一般为最合适的切口平移片段一般为最合适的切口平移片段一般为最合适的切口平移片段一般为50-50050-500个核苷酸。个核苷酸。个核苷酸。个核苷酸。第三十页，讲稿共一百二十九页哦(2)DNA(2)DNA酶酶酶酶的用量和的用量和的用量和的用量和E.coli DNAE.coli DNA聚合酶的质量会影响产聚合酶的质量会影响产聚合酶的质量会影响产聚合酶的质量会影响产物片段的大小。物片段的大小。物片段的大小。物片段的大小。(3)DNA(3)DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性，故模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性

50、，故模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性，故模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性，故应使用仔细纯化后的应使用仔细纯化后的应使用仔细纯化后的应使用仔细纯化后的DNADNA。缺口平移标记示意图缺口平移标记示意图影响因素影响因素影响因素影响因素:(1)(1)产物的比活性取决于产物的比活性取决于产物的比活性取决于产物的比活性取决于-3232PdNTPPdNTP的比活性和的比活性和的比活性和的比活性和模板中核苷酸被置换的模板中核苷酸被置换的模板中核苷酸被置换的模板中核苷酸被置换的程度。程度。程度。程度。第三十一页，讲稿共一百二十九页哦3.1.2 3.1.2 随机引物合成法随机引物合成法随机引物合成法随机