血清球蛋白的分离纯化实验六课件.ppt

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1、关于血清球蛋白的分离纯化实验六现在学习的是第1页，共12页实验原理实验原理实验原理实验原理1.1.了解并初步掌握盐析法分离、纯化蛋白质的原理。了解并初步掌握盐析法分离、纯化蛋白质的原理。2.2.熟悉盐析法分离、纯化蛋白质的方法。熟悉盐析法分离、纯化蛋白质的方法。现在学习的是第2页，共12页实验原理实验原理（一）蛋白质盐析（一）蛋白质盐析在水溶液中，蛋白质分子由于表面生成在水溶液中，蛋白质分子由于表面生成水化层水化层和同性和同性电荷层电荷层而成为稳定的亲水胶体颗粒，因此蛋白质在而成为稳定的亲水胶体颗粒，因此蛋白质在水溶液中比较稳定而水溶液中比较稳定而不易沉淀不易沉淀。当加入当加入较高浓度较高浓度

2、的的中性盐中性盐时，这些盐类时，这些盐类与水有亲和性与水有亲和性，与蛋白质争夺水分，破坏蛋白质颗粒表面的水化膜。同时，与蛋白质争夺水分，破坏蛋白质颗粒表面的水化膜。同时，由于这些盐是由于这些盐是强电解质强电解质，离子浓度相对的比较高，可以，离子浓度相对的比较高，可以大量中和蛋白质颗粒上的电荷，这样使蛋白质成了既不含大量中和蛋白质颗粒上的电荷，这样使蛋白质成了既不含水膜又不带电荷的不稳定颗粒而容易沉淀，这就是利用水膜又不带电荷的不稳定颗粒而容易沉淀，这就是利用盐析沉淀蛋白质的基本原理盐析沉淀蛋白质的基本原理。现在学习的是第3页，共12页由于血清中各种蛋白质所带电荷多少、颗粒大小及由于血清中各种蛋

3、白质所带电荷多少、颗粒大小及亲水程度都不一样，因此使用某种中性盐进行盐析亲水程度都不一样，因此使用某种中性盐进行盐析时，所需要的盐浓度也各不相同。时，所需要的盐浓度也各不相同。50%50%饱和度饱和度的硫酸铵能使的硫酸铵能使血清中的球蛋白血清中的球蛋白沉淀，而沉淀，而3333饱和度饱和度的硫酸铵则使的硫酸铵则使-球蛋白球蛋白沉淀。沉淀。可根据所要分离的蛋白质，选择不同饱和度的硫酸铵可根据所要分离的蛋白质，选择不同饱和度的硫酸铵溶液进行盐析。溶液进行盐析。现在学习的是第4页，共12页（二）浓缩（二）浓缩 一般实验室常用的是一般实验室常用的是透析袋（半透膜）透析袋（半透膜）浓缩。浓缩。半透膜半透膜

4、具有选择透过性，只允许具有选择透过性，只允许离子离子和和小分子小分子扩散进扩散进出，出，生物大分子生物大分子（蛋白质等）不能自由通过半透膜。（蛋白质等）不能自由通过半透膜。将待浓缩的蛋白质溶液放入透析袋内，用绳子扎紧，然后将待浓缩的蛋白质溶液放入透析袋内，用绳子扎紧，然后置于烧杯中。置于烧杯中。现在学习的是第5页，共12页实验试剂与器材实验试剂与器材试剂：试剂：(1)小牛血清小牛血清(2)PBS（pH7.2磷酸盐缓冲生理盐水）磷酸盐缓冲生理盐水）(3)3%BaCl2溶液溶液(4)pH7.2饱和硫酸胺溶液饱和硫酸胺溶液器材器材：(1)离心管离心管(2)离心机离心机(3)移液管移液管(4)透析袋透

5、析袋现在学习的是第6页，共12页实验步骤实验步骤（一）盐析（一）盐析中性盐沉淀中性盐沉淀离心管加入离心管加入血清血清2ml 2ml+2ml PBS2ml PBS 摇匀摇匀逐滴加入逐滴加入pH7.2pH7.2饱和硫酸胺溶液饱和硫酸胺溶液7 7mlml边加边摇边加边摇静置静置1 10 0minmin离心离心（30003000转转/分）分）10min10min弃弃上清液上清液沉淀沉淀+1.0mlPBS1.0mlPBS使使之溶解之溶解逐滴加逐滴加饱和硫饱和硫酸胺酸胺1 1.5ml.5ml摇匀摇匀静置静置10min10min离心离心（30003000转转/分）分）10min10min弃弃上清液上清液沉淀

6、（沉淀（球蛋白）球蛋白）现在学习的是第7页，共12页现在学习的是第8页，共12页现在学习的是第9页，共12页（二）浓缩（二）浓缩将上述收集的蛋白质将上述收集的蛋白质+1mlPBS，沉淀完全溶解后，放，沉淀完全溶解后，放入入透析袋透析袋内，用内，用绳子扎紧绳子扎紧，然后置于，然后置于100ml烧杯中，烧杯中，加入加入纯净水纯净水。35min后，后，取取1ml烧杯中溶液至试管中，再烧杯中溶液至试管中，再滴加滴加BaCl2若出现若出现白色混浊白色混浊，将烧杯中的水倒掉，再换上纯净，将烧杯中的水倒掉，再换上纯净水。水。直至滴加直至滴加BaCl2溶液不再出现白色混浊为止。溶液不再出现白色混浊为止。现在学

7、习的是第10页，共12页注意事项注意事项1.在盐析时，饱和硫酸铵应在盐析时，饱和硫酸铵应逐滴加入，速度不能过快逐滴加入，速度不能过快，一，一定要边滴加定要边滴加边搅拌边搅拌，以减少局部高浓度硫酸铵所引起，以减少局部高浓度硫酸铵所引起的的共沉现象共沉现象，搅拌速度不宜过快，以免产生过多泡，搅拌速度不宜过快，以免产生过多泡沫，致使蛋白质变性。沫，致使蛋白质变性。2.硫酸铵硫酸铵浓度越高越容易沉淀。但浓度过高容易引起浓度越高越容易沉淀。但浓度过高容易引起其他杂蛋白的其他杂蛋白的共沉作用共沉作用，因此必须根据分离蛋白的浓，因此必须根据分离蛋白的浓度要求，度要求，控制适当的蛋白质浓度控制适当的蛋白质浓度。3.离心时应离心时应平衡放置平衡放置离心管。离心管。4.浓缩时，滴加浓缩时，滴加BaCl2前，先取出透析袋再滴加。前，先取出透析袋再滴加。5.更换蒸馏水的目的，是为了更换蒸馏水的目的，是为了增大增大半透膜两边的半透膜两边的浓度差浓度差。现在学习的是第11页，共12页感谢大家观看现在学习的是第12页，共12页