化学发光免疫技术课件.ppt
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1、关于化学发光免疫技术现在学习的是第1页,共27页 化学发光免疫技术:化学发光免疫技术:集灵敏的化学集灵敏的化学 发光分析和特异的抗原抗体免疫测发光分析和特异的抗原抗体免疫测 定于一体的检测技术。定于一体的检测技术。概概 念念 特点:特点:特异性高、敏感性高、分离简便、特异性高、敏感性高、分离简便、快速、试剂无毒、安全稳定、快速、试剂无毒、安全稳定、可自动化。可自动化。现在学习的是第2页,共27页化学发光免疫技术的类型化学发光免疫技术的类型 按发光剂不同分为按发光剂不同分为 1.1.发光酶免疫测定(发光酶免疫测定(C CLEIALEIA)chemiluminescence enzymeimmun
2、oasssaychemiluminescence enzymeimmunoasssay 2.2.化学发光免疫测定技术化学发光免疫测定技术(CLIA)(CLIA)chemiluminescence immunoassay chemiluminescence immunoassay 3.3.电化学发光免疫测定技术电化学发光免疫测定技术(ECLI)ECLI)electrochemiluminescence immunoassay electrochemiluminescence immunoassay 按分离方法不同分按分离方法不同分 1.1.微粒子化学发光免疫测定微粒子化学发光免疫测定 2.2.磁
3、颗粒化学发光免疫测定磁颗粒化学发光免疫测定现在学习的是第3页,共27页第一节第一节 发光与化学发光剂发光与化学发光剂一、发光一、发光 一种物质由电子激发态回复到基态时,一种物质由电子激发态回复到基态时,释放出的能量表现为光的发射。释放出的能量表现为光的发射。1.1.光照发光光照发光:发光剂经短波长入射光照射后进入激发光剂经短波长入射光照射后进入激 发态,当回复至基态时发出较长波长的可见光。发态,当回复至基态时发出较长波长的可见光。2.2.生物发光生物发光:反应底物在荧光素酶的催化下利用反应底物在荧光素酶的催化下利用 ATPATP产能,生成激发态的氧化荧光素,后者在回产能,生成激发态的氧化荧光素
4、,后者在回 复到基态时多余的能量以光子形式放出。复到基态时多余的能量以光子形式放出。3.3.化学发光化学发光:在常温下由化学反应产生的光的发射。在常温下由化学反应产生的光的发射。化学发光是一个多步骤的过程。化学发光是一个多步骤的过程。现在学习的是第4页,共27页 荧光素酶荧光素酶ATP;O2;Mg2+氧化萤火虫荧光素氧化萤火虫荧光素萤火虫荧光素萤火虫荧光素返回返回光光 +AMP+O2+CO2+现在学习的是第5页,共27页化学发光化学发光 机制:机制:某些化合物可以利用化学反应产生的能某些化合物可以利用化学反应产生的能 量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子量使其产物分子或反应中间态分子上升至
5、电子 激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基 态时,以发射光子的形式释放能量(即发光)。态时,以发射光子的形式释放能量(即发光)。化学发光剂或发光底物:化学发光剂或发光底物:在化学发光反应中参在化学发光反应中参 与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量 的化合物。的化合物。发光剂分为发光剂分为荧光素、生物发光剂、化学发光剂荧光素、生物发光剂、化学发光剂现在学习的是第6页,共27页 能参与化学发光反应;能参与化学发光反应;与抗原或抗体偶联后形成稳定的结合物试剂;与抗原或抗体偶联后形成稳定的结合物试剂;偶联后仍保留高
6、的量子效应和反应动力;偶联后仍保留高的量子效应和反应动力;应不改变或极少改变被标记物的理化特性,应不改变或极少改变被标记物的理化特性,特别是免疫活性。特别是免疫活性。化学发光剂应符合以下几个条件化学发光剂应符合以下几个条件返回返回现在学习的是第7页,共27页1.1.酶促反应的发光底物酶促反应的发光底物 是指经酶的降解作用而发出光的一类发光是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物。底物。CLEIACLEIA中常用的酶有中常用的酶有HRPHRP和和APAP HRP HRP的发光底物有鲁米诺、对的发光底物有鲁米诺、对-羟基苯乙酸羟基苯乙酸 APAP的发光底物有的发光底物有AMPPDAMPPD、4-M
7、UP4-MUP(荧光底物)(荧光底物)特点:可作标记物、也可作过氧化物酶的底物特点:可作标记物、也可作过氧化物酶的底物 1.1 1.1 鲁米诺鲁米诺H2O2/OH HRP+N2+H2O+光光现在学习的是第8页,共27页对对-羟基苯乙酸(羟基苯乙酸(HPAHPA)HPAHPA在在H H2 2O O2 2存在下被存在下被HRPHRP氧化成氧化二聚体(荧光氧化成氧化二聚体(荧光 物质),在物质),在350nm350nm激发光作用下,发出激发光作用下,发出450nm450nm波长波长 的荧光,可用荧光光度计测量。的荧光,可用荧光光度计测量。1.2 HPA1.2 HPAH2O2HRP+荧荧 光光氧化二聚
8、体氧化二聚体现在学习的是第9页,共27页AMPPDAMPPD AMPPDAMPPD在碱性条件下,被在碱性条件下,被APAP酶解生成相当稳定的酶解生成相当稳定的 AMP-DAMP-D阴离子,其有阴离子,其有2 230min30min的分解半衰期,发的分解半衰期,发 出波长为出波长为470nm470nm的持续性光,在的持续性光,在15min15min时其强度时其强度 达到高峰,达到高峰,151560min60min内光强度保持相对稳定。内光强度保持相对稳定。光光AP/OH HPO4 2 1.3 AMPPD1.3 AMPPD现在学习的是第10页,共27页4-MUP4-MUP 发出发出448nm448
9、nm的荧光的荧光4-MUP被被AP催化生成催化生成4-甲基伞形酮,在甲基伞形酮,在360nm的的 激发光的作用下,激发光的作用下,可用荧,可用荧 光光度计进行测量。光光度计进行测量。荧荧光光AP 1.4 4-MUP1.4 4-MUP4-MU4-MU360nm360nm激发光激发光H H3 3POPO4 4+现在学习的是第11页,共27页2.2.直接化学发光剂直接化学发光剂特点:特点:不需催化剂,只需改变溶液的不需催化剂,只需改变溶液的pHpH等条件等条件 就能发光的物质。反应迅速、背景低、就能发光的物质。反应迅速、背景低、信比高,发光量与信比高,发光量与AEAE浓度呈线性关系。浓度呈线性关系。
10、常用试剂:常用试剂:吖啶酯(吖啶酯(acridinium,AEAE)+CO+CO2 2+光光现在学习的是第12页,共27页3.3.电化学发光剂电化学发光剂 是指通过在电极表面进行电化学反应而发出是指通过在电极表面进行电化学反应而发出 光的物质。光的物质。特点:特点:反应在电极进行;反应在电极进行;电子供体为:三丙胺(电子供体为:三丙胺(TPATPA)化学发光剂:三联毗啶钌化学发光剂:三联毗啶钌返回返回返回返回三联毗啶钌三联毗啶钌分子结构图分子结构图现在学习的是第13页,共27页第二节第二节 发光酶免疫测定发光酶免疫测定(CLEIA)一、原理一、原理 属于酶免疫测定的一种。只是最后一属于酶免疫测
11、定的一种。只是最后一 步酶反应所用底物为发光剂,通过发光反应步酶反应所用底物为发光剂,通过发光反应 发出的光在特定的仪器上进行测定。发出的光在特定的仪器上进行测定。二、技术类型二、技术类型 根据酶促反应底物不同可分为:根据酶促反应底物不同可分为:1.1.荧光酶免疫测定技术荧光酶免疫测定技术 2.2.化学发光酶免疫测定技术化学发光酶免疫测定技术 根据免疫学反应模式分根据免疫学反应模式分 1.1.双抗体夹心法和双抗原夹心法双抗体夹心法和双抗原夹心法 3.3.固相抗原竞争法:固相抗原竞争法:现在学习的是第14页,共27页荧光酶免疫测定技术反应原理图荧光酶免疫测定技术反应原理图 洗涤洗涤弃上清弃上清
12、是利用理想的酶荧光底物,生成的产物稳定并有是利用理想的酶荧光底物,生成的产物稳定并有 强的荧光强度,通过测定荧光强度进行定量。强的荧光强度,通过测定荧光强度进行定量。现在学习的是第15页,共27页化学发光酶免疫测定技术反应原理图化学发光酶免疫测定技术反应原理图 洗涤洗涤弃上清弃上清 是利用酶对发光底物催化作用而直接发光,是利用酶对发光底物催化作用而直接发光,通过光强度的测定而直接进行定量。通过光强度的测定而直接进行定量。现在学习的是第16页,共27页电化学发光原理图电化学发光原理图 这一过程可在电极表面周而复始地进行这一过程可在电极表面周而复始地进行 产生许多光子,使光信号增强产生许多光子,使
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