基因克隆原理及实验介绍.pptx

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1、基因克隆原理及实验介绍现在学习的是第1页，共32页内容概要实验进展汇报（5.108.24）基因克隆基本原理及实验操作现在学习的是第2页，共32页目的基因目的基因长度度质粒粒载体体备注注结果果NS1-11056bppcDNA3.1+3flag中间有3个位点突变成功NS1-21056bppcDNA3.1+3flag中间有3个位点突变成功NS1-31056bppcDNA3.1+3flag中间有3个位点突变成功NS2A-1654bppcDNA3.1+3flag中间有2个位点突变成功NS2B-1390bppcDNA3.1+3flag不配对失败NS2B-2390bppcDNA3.1+3flag双峰失败NS

2、2B-3390bppcDNA3.1+3flag中间有1个位点突变成功NS3-11854bppcDNA3.1+3flag测序有问题，需要沟通NS3-21854bppcDNA3.1+3flag测序有问题，需要沟通NS3-31854bppcDNA3.1+3flag测序有问题，需要沟通NS4A-1859bppcDNA3.1+3flag需要重新设计引物，直接pcr成功NS4A-2859bppcDNA3.1+3flag需要重新设计引物，直接pcr成功NS4A-3859bppcDNA3.1+3flag需要重新设计引物，直接pcr成功NS4B-1336bppcDNA3.1+3flag需要重新设计引物，重新实验

3、失败NS4B-2336bppcDNA3.1+3flag需要重新设计引物，重新实验失败NS4B-3336bppcDNA3.1+3flag需要重新设计引物，重新实验失败NS5-12700bppcDNA3.1+3flagPCR做不出来失败NS5-22700bppcDNA3.1+3flagPCR做不出来失败NS5-32700bppcDNA3.1+3flagPCR做不出来失败E-31485bppcDNA3.1+3flag中间有4个位点突变成功Cap-1339bppcDNA3.1+3flag前后有数个位点突变成功Cap-2339bppcDNA3.1+3flag前后有数个位点突变成功Cap-3339bppc

4、DNA3.1+3flag前后有数个位点突变成功prM-1498bppcDNA3.1+3flag中间有3个位点突变成功prM-2498bppcDNA3.1+3flag中间有3个位点突变成功prM-3498bppcDNA3.1+3flag中间有3个位点突变成功M-1225bppcDNA3.1+3flag中间有1个位点突变成功M-2225bppcDNA3.1+3flag没有突变成功M-3225bppcDNA3.1+3flag没有突变成功目的基因目的基因长度度质粒粒载体体备注注结果果NS3-11854bppcDNA3.1+3flag有2个突变成功NS3-21854bppcDNA3.1+3flag有2个

5、突变成功NS3-31854bppcDNA3.1+3flag有2个突变成功NS4A-1381bppcDNA3.1+3flag没有突变成功NS4A-2381bppcDNA3.1+3flag没有突变成功NS4A-3381bppcDNA3.1+3flag没有突变成功NS4B-1744bppcDNA3.1+3flag有2个突变失败NS4B-2744bppcDNA3.1+3flag有3个突变失败NS4B-3744bppcDNA3.1+3flag有2个突变失败NS4A+2K-1450bppcDNA3.1+3flagNS4A+2K-2450bppcDNA3.1+3flagNS4A+2K-3450bppcDNA

6、3.1+3flagNS5-32700bppcDNA3.1+3flagE1485bppcDNA3.1+3flagPCR做不出来失败prM-1498bppLenti+3flag无信号，取消测序失败prM-2498bppLenti+3flag没有突变成功prM-3498bppLenti+3flag没有突变成功M-1225bppLenti+3flagM-2225bppLenti+3flagM-3225bppLenti+3flag现在学习的是第3页，共32页分子生物学DNARNA蛋白质转录翻译逆转录 分子生物学是在分子水平上研究生命现象、生命本质、生命活动及其规律的科学，其研究对象是核酸（DNA、RNA

7、）和蛋白质等生物大分子，其研究内容包括核酸和蛋白质等的结构、功能及其遗传信息和代谢信息传递中的作用和作用规律。现在学习的是第4页，共32页基因克隆基因克隆（gene cloning）或分子克隆，又称为重组DNA技术，是应用酶学方法，在体外将不同来源的DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。目的：大量扩增目的基因，为下一步基因的功能研究做准备。现在学习的是第5页，共32页pcDNA3.1+3flagpCR双酶切连接引物设计回收纯化重组质粒pcDNA3.1+3flag-NS3现在学习的是第6页，共32页pCR双酶切连接转化

8、挑菌提质粒测序大肠杆菌(感受态)引物设计回收纯化载体目的片段酶切鉴定现在学习的是第7页，共32页网上检索引物设计DNA制备PCR扩增扩增产物纯化与克隆载体连接感受态E.coli制备转化、培养重组克隆筛选PCR或酶切鉴定测序生物信息学分析等质粒提取实验流程现在学习的是第8页，共32页引物设计从 GenBank 下载全基因组序列（complete genome），记录编号 保存各目的基因的序列（如NS1、NS2A、NS5、Cap、E等）获取载体质粒的相关信息（抗性、标签、酶切位点）复制到Primer Premier 5 分析其酶切位点，选择共有的酶切位点在目的基因合适的位置添加引物，并在引物前/后

9、加上酶切位点pCR回收纯化双酶切连接转化挑菌提质粒测序引物设计现在学习的是第9页，共32页ori 是复制起点,他被宿主细胞识别后才能在该细胞中复制。现在学习的是第10页，共32页现在学习的是第11页，共32页Primer Premier 5pCR回收纯化双酶切连接转化挑菌提质粒测序引物设计现在学习的是第12页，共32页Primer Premier 5pCR回收纯化双酶切连接转化挑菌提质粒测序引物设计现在学习的是第13页，共32页引物处理 Procedure标记，Sense F，Antise R，如“NS3 Sense BamH1”，记为“NS3-F-BamH1”离心，使粉末在底部集聚，1200

10、0g，10min（注意是g，不是rpm）稀释，ddH2O按报告单储存浓度（100M）的10倍量稀释至使用浓度10M保存，分装-20pCR回收纯化双酶切连接转化挑菌提质粒测序引物设计现在学习的是第14页，共32页Attention离心时待离心机达到最高转速方可离开，防止不平衡造成损坏M 是浓度单位，如100M=100mol/L引物稀释量向上取5倍整数，如383l稀释至385lpCR回收纯化双酶切连接转化挑菌提质粒测序引物设计现在学习的是第15页，共32页1 预变性94 2min2c 变性98 10s3c 退火X 30s*4c 延伸68 需计算*5 总延伸68 10min6 冷却16 10min总

11、循环数30-40（from 2c to 4c）引物设计双酶切连接转化挑菌提质粒测序回收纯化pCR成分体积（l）灭菌dd H2O3310 KOD-plus-neo Buffer5dNTPs（2mM）5MgSO43Template1Primer R（10M）1Primer F（10M）1KOD-plus-neo Polymease1Total50AB*延伸时间计算：，向上取整数（多预留延伸时间）*退火温度计算：一般为上下游引物TM平均值5现在学习的是第16页，共32页Attention试剂如不完全融化，会造成浓度不均，酶需冰上放置PCR管根据目的基因名称、日期、编号做标记模板(Template)可

12、根据浓度确定加入体积，缓冲液(Buffer)必须在酶之前加入。注意不同引物对应不同PCR管PCR 结果优化略，详见pCR常见问题解决方法引物设计回收纯化双酶切连接转化挑菌提质粒测序pCR现在学习的是第17页，共32页琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶具有网络结构，本身不带电荷。具有分子筛效应(凝胶色谱)与电泳效应。目的：分离不同大小的核酸，以达到纯化、鉴定的目的。原理：DNA分子迁移率与其大小成反比，电泳时 根据分子大小不同形成不同的条带根据目的基因片段大小，配制不同浓度的凝胶引物设计pCR双酶切连接转化挑菌提质粒测序回收纯化凝胶浓度目的基因片段(bp)0.5%1000-300000.7%800-120

13、001.0%500-100001.2%400-70001.5%200-30002.0%50-2000现在学习的是第18页，共32页引物设计pCR双酶切连接转化挑菌提质粒测序回收纯化Attention琼脂糖凝胶可根据情况分成数小块（一般是每8孔），或插入孔径不同的梳子EB具有强致癌性，应在污染区操作为保持凝胶成像仪与点样顺序一致，点样时应从右往左点（靠近自己一段开始）Marker是已知大小的正对照DNA，电泳能分离出不同条带，相当于尺子上的刻度，可以用来测算未知DNA样品的大小。红色为正极，黑色黑色为负极，DNA 样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负)。现在学习的是第19页，共32页引物设

14、计pCR双酶切连接转化挑菌提质粒测序回收纯化2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp E E Cap Cap Cap Cap 2B 2B 2A 2A NS1 NS1现在学习的是第20页，共32页引物设计pCR双酶切连接转化挑菌提质粒测序回收纯化Procedure打开紫外灯，在操作台上根据荧光位置切胶，动作要快并尽可能切小块，切出的凝胶转移至1.5ml Ep 管里，称量凝胶重量 *凝胶成像仪的紫外灯对DNA有突变作用，应尽可能减少紫外灯对凝胶的照射按照E.Z.N.ATM Gel Extraction Kit(200)试剂盒说明书回收纯化DNA：现在学习的是第21页，共32

15、页Objective原理：限制性内切酶能特异地结合于一段特定的DNA序列的特异位点上,并切割双链DNA目的DNA与质粒载体同时进行双酶切（两个不同的酶切位点，如BamH1和EcoR1），形成同样的酶切位点为进行连接引物设计pCR回收纯化连接转化挑菌提质粒测序双酶切Procedure目的DNA酶切体系试剂用量目的DNA41lBuffer（10）5lenzyme 12lenzyme 22ldd H2O 补至50l载体酶切体系试剂用量Plasmid4g(X l*)Buffer（10）5lenzyme 12lenzyme 22ldd H2O 补至50l*根据质粒浓度（如pcDNA3.1+3flag浓度

16、为455ng/l，4000bp，反应体积约为9l）混匀，37孵育4-6h（6h以上更佳）现在学习的是第22页，共32页Objective通过凝胶电泳验证目的DNA、质粒是否酶切成功，并通过胶回收DNA及质粒（切去的片段除外）最终回收体积为30l通过连接使目的DNA导入质粒中，为下一步转染准备引物设计pCR回收纯化双酶切转化挑菌提质粒测序连接Procedure目的DNA与质粒连接体系试剂用量目的 DNA13-15lplasmid2-4l10 Ligase Buffer2lT4 DNA Ligase1lTotal20l混匀，4过夜或常温条件下反应4h现在学习的是第23页，共32页引物设计pCR回收

17、纯化双酶切连接挑菌提质粒测序转化Objective将连接产物通过转化转入到感受态大肠杆菌中，从而使连接产物（重组质粒）在大肠杆菌中大量复制LB培养基配制胰蛋白胨（Tryptone）10g/L酵母提取物（Yeast extract）5g/L氯化钠（NaCl）10g/L琼脂粉（Agar）*10-15g/L*配制固体LB时加入 每锥形瓶加入200/250ml（定量）现在学习的是第24页，共32页引物设计pCR回收纯化双酶切连接转化提质粒测序挑菌Objective从大肠杆菌培养基中挑取优势菌落（单菌落）进行扩大培养培养过夜后取出部分菌液进行保菌现在学习的是第25页，共32页Procedure消毒实验台

18、及器具，取酒精棉球擦拭桌面、镊子，准备无菌枪头、试管、试管板两个，点燃酒精灯，酒精消毒双手取LB培养液加入抗生素，向各试管中倒入LB培养液约10-15ml从培养箱中取出培养皿，在火源附近打开，用镊子夹取一个枪头，挑取一个单菌落，轻轻沾取菌落，枪头丢入试管内，每菌种挑取2-3管培养皿用封口膜封好放入4保存将试管放入摇床震荡培养过夜，次日出现浑浊消毒桌面，取1.5ml无菌Ep管标记摇匀试管，使底部菌落分散，吸取1000l菌液，加入200l 60%甘油，-20装袋保存引物设计pCR回收纯化双酶切连接转化提质粒测序挑菌现在学习的是第26页，共32页Objective从宿主细胞大肠杆菌中提取大量复制后的

19、质粒引物设计pCR回收纯化双酶切连接转化挑菌测序提质粒Procedure按照E.Z.N.ATM Endo-free Plasmid Mini Kit(200)试剂盒说明书提取质粒现在学习的是第27页，共32页引物设计pCR回收纯化双酶切连接转化挑菌测序质粒浓度检测器l 260/280比值（约1.8）l 260/230比值（约2.1）l 浓度400（ng/l）提质粒现在学习的是第28页，共32页Objective双酶切方法使鉴定重组质粒是否成功连接，凝胶电泳下观察条带（质粒、目的DNA）引物设计pCR回收纯化双酶切连接转化挑菌提质粒测序Procedure酶切验证体系试剂用量Plasmid1g(X

20、 l*)Buffer（10）2lenzyme 11lenzyme 21ldd H2O 补至20l1.混匀，4过夜或常温条件下反应4h2.37水浴反应1-2h3.获得的酶切产物加入2l Loading Buffer，取10l进行琼脂糖凝胶电泳（小孔）现在学习的是第29页，共32页Attention1.填写送样登记表，样品资料（样品名称、类型、抗性、载体名称、长度）2.用PCR管按上述样品名称标记，每管取10l送样测序引物设计pCR回收纯化双酶切连接转化挑菌提质粒测序 样品应完全解冻再取样 测序结果未完成前所有实验过程的中间产物不得丢弃，并做好记录 测序引物一般为通用，如结果不佳时才选择自备 测序要求一般为测通（单次反应800bp，测通即多次反应直到全部测出为止，结果需要拼接）现在学习的是第30页，共32页引物设计pCR回收纯化双酶切连接转化挑菌提质粒测序现在学习的是第31页，共32页引物设计pCR回收纯化双酶切连接转化挑菌提质粒测序现在学习的是第32页，共32页