分子克隆工具酶讲稿.ppt

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1、分子克隆工具酶分子克隆工具酶分子克隆工具酶分子克隆工具酶第一页，讲稿共九十页哦n在基因工程的实际操作中，工具酶的使用是一在基因工程的实际操作中，工具酶的使用是一项基本技术。项基本技术。n用于基因工程的工具酶种类繁多、根据其用于基因工程的工具酶种类繁多、根据其功能可粗略分为功能可粗略分为限制酶、连接酶、聚合酶和限制酶、连接酶、聚合酶和修饰酶修饰酶4类。类。第二页，讲稿共九十页哦工具工具酶类 主要用途主要用途限制性核酸内切限制性核酸内切酶 切割切割DNA分子形成片段分子形成片段DNA连接接酶 DNA片段的片段的连接重接重组大大肠杆菌杆菌DNA聚合聚合酶 切口平移法切口平移法标记DNA探探针T7 D

2、NA聚合聚合酶 DNA序列序列测定分析定分析Taq DNA聚合聚合酶 PCR体外体外扩增技增技术多核苷酸激多核苷酸激酶 末端末端标记法制法制备探探针S1核酸核酸酶 去除双去除双链DNA的局部的局部单链常用工具酶与基因克隆技术常用工具酶与基因克隆技术常用工具酶与基因克隆技术常用工具酶与基因克隆技术第三页，讲稿共九十页哦核酸酶核酸酶是通过切割相邻的两个核苷酸残基间的是通过切割相邻的两个核苷酸残基间的磷酸磷酸二酯键二酯键，导致多核苷酸链共价键断裂的一类水解酶，导致多核苷酸链共价键断裂的一类水解酶，可分为核糖核酸酶可分为核糖核酸酶(RNase)(RNase)和脱氧核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶(DNase

3、)(DNase)。按其水解断裂核酸分子的不同方式：按其水解断裂核酸分子的不同方式：核酸外切酶核酸外切酶(exonuclease):(exonuclease):从核酸末端从核酸末端顺次水解磷顺次水解磷酸二酯键酸二酯键 核酸内切酶核酸内切酶(endonuclease)(endonuclease)：内部磷酸二酯键：内部磷酸二酯键2.1 2.1 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶第四页，讲稿共九十页哦寄主控制的寄主控制的限制限制(restriction)(restriction)与修饰与修饰 (modification)(modification)现象：现象：人们发现侵染

4、大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。性障碍。噬菌体在感染某一宿主后，再去感染其他噬菌体在感染某一宿主后，再去感染其他宿主时会受到限制。即所谓的寄主控制的限制与修饰宿主时会受到限制。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（现象简称（R/MR/M体系）。体系）。细菌的细菌的R/MR/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNADNA与外来的与外来的DNADNA，并能使后者降解。，并能使后者降解。2.1.1 2.1.1 限制性核酸内切酶的发现及其生物功能限制性核酸内切酶的发现及其生物功能限制性核酸内切酶的发现及其生物功能限制性

5、核酸内切酶的发现及其生物功能第五页，讲稿共九十页哦限限制制与与修修饰饰现现象象图图解解Arber限制修饰酶限制修饰酶第六页，讲稿共九十页哦1968年，MeselsonandYuan从E.coli菌株和中发现了型限制酶；型限制酶；1970年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出HindII。第七页，讲稿共九十页哦限制性内切酶将侵入细菌体内的限制性内切酶将侵入细菌体内的外源外源DNA切成切成小片断。小片断。限制（限制（Restriction）第八页，讲稿共九十页哦细菌自身的细菌自身的DNA碱基被碱基被甲基化酶甲基化酶甲基化修饰甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。所保护，不能

6、被自身的限制性内切酶识别切割。Dam甲基化酶甲基化酶GATC腺嘌呤腺嘌呤N6位置引入甲基。位置引入甲基。Dcm甲基化酶甲基化酶CCAGG或或CCTGG序列在第二个序列在第二个C上上C5位置上引入甲基。位置上引入甲基。修饰（修饰（Modification）第九页，讲稿共九十页哦第十页，讲稿共九十页哦2.1.2 限制酶的分类与命名限制酶的分类与命名n限制性内切酶限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外本是微生物细胞中用于专门水解外源源DNADNA的一类酶，其的一类酶，其功能功能是避免外源是避免外源DNADNA的干扰或的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。由于噬菌体的感染，是细胞中的一种防

7、御机制。由于R/MR/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。工具酶。n根据酶的功能、大小和反应条件，及切割根据酶的功能、大小和反应条件，及切割DNADNA的特的特点，可以将限制性内切酶分为三类：点，可以将限制性内切酶分为三类：型酶、型酶、型型酶、酶、型酶。型酶。第十一页，讲稿共九十页哦三种类型限制酶的主要特性差异比较三种类型限制酶的主要特性差异比较距识别序列下游24-26bp处识别序列内或附近特异性切割距识别序列1kb处随机性切割切割位点切割位点GAGCC CAGCAG旋转对称序列TGAN8TGCTAACN6GTGC识别序列识别序列ATP

8、、Mg2+、SAMMg2+ATP、Mg2+、SAM（S-腺苷甲硫氨酸）辅助因子辅助因子异源二聚体同源二聚体异源三聚体蛋白结构蛋白结构双功能单功能多功能限制修饰限制修饰 型型 型型I I 型型主要特性主要特性第十二页，讲稿共九十页哦 I型酶属复合功能酶，兼具限制、修饰两种型酶属复合功能酶，兼具限制、修饰两种功能。核酸内切酶、甲基化酶、功能。核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶和酶和DNA解旋酶解旋酶4种活性。种活性。显著特点：显著特点：识别位点与切割位点不一致。识别位点与切割位点不一致。酶分子首先由酶分子首先由M.Meselson和和R.Yuan在在1968年年从大肠杆菌从大肠杆菌 B株株和和 K株株

9、分离的。分离的。代表：代表：EcoB和和 EcoK。I型限制性内切酶型限制性内切酶第十三页，讲稿共九十页哦识别位点序列识别位点序列EcoB：TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC未甲基化修饰的特异序列。未甲基化修饰的特异序列。需需ATP、Mg2+和和SAM(S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸)。作用机理作用机理第十四页，讲稿共九十页哦在距离特异性识别位点约在距离特异性识别位点约10001500 bp处处随机随机切开一条切开一条单链单链。Recognize sitecut1-1.5kb切割位点切割位点第十五页，讲稿共九十页哦有有核酸内切酶核酸内切酶和和甲基化酶甲基化酶作用。酶分子由两

10、作用。酶分子由两个亚基组成。个亚基组成。M亚基负责位点识别与修饰，亚基负责位点识别与修饰，R亚基具有核酸酶活性。亚基具有核酸酶活性。在在完全肯定的完全肯定的位点切割位点切割DNA，但反应需要，但反应需要ATP、Mg2+和和SAM（S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸）。）。在基因工程操作中用途不大。在基因工程操作中用途不大。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG类限制性内切酶类限制性内切酶第十六页，讲稿共九十页哦 1970年，由年，由H.O.Smith和和K.W.Wilcox（威（威尔科克斯）从流感嗜血菌中分离出来。尔科克斯）从流感嗜血菌中分离出来。分离分离的第一个酶是的第一个酶是Hind。

11、限制限制-修饰系统分别由限制酶与修饰酶两种不修饰系统分别由限制酶与修饰酶两种不同酶分子组成，分子量小，能识别同酶分子组成，分子量小，能识别DNA的特殊的特殊序列，种类多，在基因工程中起重要作用。序列，种类多，在基因工程中起重要作用。型限制性内切型限制性内切酶酶第十七页，讲稿共九十页哦 能能识别识别双双链链DNADNA的特殊序列，并在的特殊序列，并在这这个个序序列内列内进进行切割，行切割，产产生特异的生特异的DNADNA片段。其种片段。其种类类繁繁多。通常所指的多。通常所指的DNADNA限制性核酸内切限制性核酸内切酶酶即即为为此此类类。在基因工程技术中，在基因工程技术中，I型不能用，型不能用，型

12、酶型酶基本不用，基本不用，型酶最有用。型酶最有用。第十八页，讲稿共九十页哦限制酶的命名限制酶的命名n1973年年Smith和和Nathans提出限制酶的命名原则，提出限制酶的命名原则，1980年年Roberts对其系统化，如今简化成：对其系统化，如今简化成：nHind，来源菌株来源菌株Haemophilus influenzaed嗜血流感杆菌d株H H i n i n d d 微生物属名种名株名(品系)发现序数第十九页，讲稿共九十页哦识别双链识别双链DNADNA分子中分子中4 48 8对碱基对碱基的特定序列的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧内部或两侧识

13、别切割序列呈典型的识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构旋转对称型回文结构5 5 G C T G C T G A A T T CG A A T T C G A G 3 G A G 33 3 C G A C G A C T T A A GC T T A A G C T C 5 C T C 5EcoRI的识别序列EcoEcoR IR I的切割位点的切割位点2.1.3 2.1.3 型限制酶的特性与型限制酶的特性与型限制酶的特性与型限制酶的特性与DNADNA切割切割切割切割(1)(1)基本特性基本特性基本特性基本特性大多为回文序列第二十页，讲稿共九十页哦5 5 G G-C C-T T-GG-A A-A

14、 A-T T-T T-C C-GG-A A-G 3G 33 3 C C-GG-A A-C C-T T-T T-A A-A A-GG-C C-T T-C 5C 5EcoRI 37 EcoRI 37 5 5 G G-C C-T T-GG-OHOH PP-A A-A A-T T-T T-C C-GG-A A-G3G33 3 C C-GG-A A-C C-T T-T T-A A-A A-PP OHOH-GG-C C-T T-C 5 C 5 退火退火 4-7 4-7 5 5 G G-C C-T T-GG A A-A A-T T-T T-C C-GG-A A-G 3G 33 3 C C-GG-A A-C

15、C-T T-T T-A A-A A GG-C C-T T-C 5C 5OHOHPPOHOHPPEcoEcoRIRI产生的产生的产生的产生的55粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端第二十一页，讲稿共九十页哦5 5 G G-CC-T T-CC-T T-GG-CC-AA-GG-GG-AA-G 3G 33 3 C C-GG-A A-GG-A A-C C-GG-T T-C C-C C-T T-C 5C 5PstI 37 PstI 37 5 5 G G-C C-T T-C C-T T-GG-C C-A A-OHOH PP-GG-GG-A A-G 3G 33 3 C C-GG-A A-GG-PP OHOH-A

16、A-C C-GG-T T-C C-C C-T T-C 5 C 5 退火退火 4-7 4-7 5 5 G G-C C-T T-C C-T T-GG-C C-A A GG-GG-A A-G 3G 33 3 C C-GG-A A-GG A A-C C-GG-T T-C C-C C-T T-C 5C 5OHOHPPOHOHPPPstPstI I产生的产生的产生的产生的3 3 粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端第二十二页，讲稿共九十页哦连接便利连接便利 n 不同的不同的DNA双链：双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易的多。这比连接两个平齐末端容易的

17、多。n 同一个同一个DNA分子内连接：分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成通过两个相同的粘性末端可以连接成环形环形分子分子。粘性末端的意义粘性末端的意义第二十三页，讲稿共九十页哦第二十四页，讲稿共九十页哦 补平成平齐末端补平成平齐末端凸出的凸出的3端端可以通过可以通过末端转移酶末端转移酶添加几个多添加几个多聚核苷酸的尾巴（如聚核苷酸的尾巴（如AAA或或TTT等）造成人等）造成人工粘性末端。工粘性末端。5 5末端标记末端标记凸出的凸出的5末端末端可用可用DNA多核苷酸激酶多核苷酸激酶进行进行32P标记。标记。粘性末端可以用粘性末端可以用DNA聚合酶聚合酶补平成平齐末端。补平成平齐末端。第

18、二十五页，讲稿共九十页哦5 5 G G-C C-T T-C C-A A-GG-C C-T T-GG-GG-A A-G 3G 33 3 C C-GG-A A-GG-T T-C C-GG-A A-C C-C C-T T-C 5C 5PvuPvu 37 37 5 5 G G-C C-T T-C C-A A-GG-OHOH PP-C C-T T-GG-GG-A A-G 3G 33 3 C C-GG-A A-GG-T T-C C-PP OHOH-GG-A A-C C-C C-T T-C 5 C 5 PvuPvu 等产生的平头末端等产生的平头末端等产生的平头末端等产生的平头末端第二十六页，讲稿共九十页哦常

19、用的限制酶及其识别序列和切割位点常用的限制酶及其识别序列和切割位点名称识别序列及切割位点名称识别序列及切割位点BamHGGATCCPstCTGCAGClaATCGATSalGTCGACEcoRGAATTCSau3A GATCHindAAGCTTSfiGGCCNNNN NGGCCHindCTPyPuACSmaCCCGGGKpnGGTACCXbaTCTAGANotGCGGCCGCXhoCTCGAG第二十七页，讲稿共九十页哦n同裂酶（同裂酶（Isoschizomers)识别位点的序列相同的限制性内切酶。识别位点的序列相同的限制性内切酶。完全同裂酶完全同裂酶识别位点和切点完全相同。识别位点和切点完全相

20、同。如如Hind 和和Hsu I。Hind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5(2)同裂酶与同尾酶同裂酶与同尾酶第二十八页，讲稿共九十页哦XmaI5-CCCGGG-33-GGGCCC-5SmaI5-CCCGGG-33-GGGCCC-5识别位点相同，但切点不同。识别位点相同，但切点不同。如如Xma I 和和 Sma I。不完全同裂酶不完全同裂酶第二十九页，讲稿共九十页哦识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如如BamH I、Bgl、Bcl I、Xho 等。等。5-GGATCC-33-CCTAG

21、G-5BamH IBcl I5-TGATCA-33-ACTAGT-55-AGATCT-33-TCTAGA-5Bgl 5-UGATCY-33-YCTAGU-5Xho U代表嘌呤；代表嘌呤；Y代表嘧啶。代表嘧啶。同尾酶同尾酶(Isocaudamers）第三十页，讲稿共九十页哦5-GATC-33-CTAG-5Sau3A I同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点位点一般不能一般不能再被原来的酶识别。再被原来的酶识别。？5-G 3-CCTAG GATCT-3 A-5BamH IBgl Sau3A I5-GGATCT-33-CCTAGA-5BamH IBgl 第三十一页，

22、讲稿共九十页哦n限制酶识别序列与限制酶识别序列与DNA的来源无关的来源无关，不具，不具有种的特异性，对不同的有种的特异性，对不同的DNA普遍适用。普遍适用。n识别序列的长短涉及对识别序列的长短涉及对DNA分子分子切割的频切割的频率率，可从理论上推导酶切，可从理论上推导酶切DNA片段的大小。片段的大小。(3)型限制酶的识别序列与型限制酶的识别序列与DNA的切割的切割第三十二页，讲稿共九十页哦n限制酶识别序列的限制酶识别序列的相邻序列相邻序列（长度要求）效（长度要求）效应。大多数限制酶对只含识别序列的寡核苷应。大多数限制酶对只含识别序列的寡核苷酸也不具催化活性的。酸也不具催化活性的。n限制酶的限制

23、酶的偏爱现象偏爱现象。限制酶对识别序列。限制酶对识别序列两侧两侧的的核苷酸的组成有关。（对不同位置的同一个核苷酸的组成有关。（对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率）识别序列表现出不同的切割效率）n限制酶的限制酶的星星活性星星活性。指某些限制酶在不适的环。指某些限制酶在不适的环境中其识别序列发生改变（切割与识别序列相境中其识别序列发生改变（切割与识别序列相似的序列）的现象。似的序列）的现象。第三十三页，讲稿共九十页哦(1)底物底物DNA样样品的品的纯纯度：度：蛋白蛋白质质、苯酚、苯酚、氯氯仿、乙醇、仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等。等。加大加大酶酶的用量的用量加大反加大反应总应总

24、体体积积（稀（稀释释）延延长长反反应时间应时间2.1.4 2.1.4 影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素影响限制性核酸内切酶活性的因素n当当DNA样品确定后，为完全切割此样品确定后，为完全切割此DNA，酶的用量视酶的催化活，酶的用量视酶的催化活性而定。性而定。n酶活力单位：酶活力单位：在最佳反应条件下反应在最佳反应条件下反应 1 h，完全水解，完全水解 1 mg 标准标准DNA所需的酶量定为所需的酶量定为1U。第三十四页，讲稿共九十页哦n修饰体系组成部分，强烈影响酶的活性。修饰体系组成部分，强烈影响酶的活性。n大肠杆菌中的大肠杆菌中的da

25、m甲基化酶在甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤序列中的腺嘌呤N6位引入甲基。位引入甲基。n受其影响的酶有受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但等，但BamH I、Bgl II、Sau3A I不受影响。不受影响。nE.coli的的dcm甲基化酶在甲基化酶在5CCAGG3或或5CCTGG3序列序列中的胞嘧啶中的胞嘧啶C5位上引入甲基。位上引入甲基。n受其影响的酶有受其影响的酶有EcoR II等。等。(2)DNA(2)DNA样品的甲基化程度样品的甲基化程度样品的甲基化程度样品的甲基化程度第三十五页，讲稿共九十页哦不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多

26、数是数是3737，少数要求，少数要求40406565。酶最适温度酶最适温度ApaIBclIMaeIITaqIApyI3050506530BstEIIMaeIIIBanIMaeISmaI6055504525(3)酶切消化反应的温度酶切消化反应的温度第三十六页，讲稿共九十页哦n缓缓冲液冲液组组分包括：分包括：氯氯化化镁镁、氯氯化化钠钠或或氯氯化化钾钾、-巯巯基乙醇或基乙醇或DTT（二二巯巯基基苏苏糖醇糖醇）、）、BSA（牛血牛血清白蛋白清白蛋白）、）、Tris-HCl等。等。n高高浓浓度的度的酶酶、高、高浓浓度的甘油、低离子度的甘油、低离子强强度、极端度、极端pH值值等，会使一些限制等，会使一些限

27、制酶酶的的识别识别和切割序列和切割序列发发生生低特异性，即所低特异性，即所谓谓的的Star activity现现象。象。n每种每种酶酶只有在最适的反只有在最适的反应缓应缓冲液中才具有最冲液中才具有最强强的的催化活性。催化活性。(4)(4)核酸内切酶的缓冲液性质核酸内切酶的缓冲液性质核酸内切酶的缓冲液性质核酸内切酶的缓冲液性质第三十七页，讲稿共九十页哦大部分大部分大部分大部分II II 型核酸内切型核酸内切型核酸内切型核酸内切酶酶酶酶需要相似的反需要相似的反需要相似的反需要相似的反应应应应条件条件条件条件II II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作型限制性核酸内切酶酶解反应的操作型限制性核酸内切

28、酶酶解反应的操作型限制性核酸内切酶酶解反应的操作050 mM 低盐酶；低盐酶；100 mM 中盐酶；中盐酶；150 mM 高盐酶高盐酶MgCl2、NaCl/KCl：提供提供Mg2+和离子强度；和离子强度；Tris-HCl：维持维持pH；二硫苏糖醇（二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；等：有助于酶的稳定；试剂条件试剂条件Tris-HCl50 mM pH 7.5DTT1 mMMgCl210 mMVolume20-100 lNaCl 0-150 mMT t37 1-1.5 h第三十八页，讲稿共九十页哦对盐浓度要求相同的酶，原则上可以

29、同时酶切，对对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，对盐浓度要求不同的酶，盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：可采取下列方法：使用较使用较贵贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解；同时酶解；低盐低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再酶先切，然后补加盐，高盐酶再切；一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切；一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切。切。型核酸内切酶的多酶联合酶解型核酸内切酶的多酶联合酶解型核酸内切酶的多酶联合酶解型核酸内切酶的多酶联合酶解第三十九页，讲稿共九十页哦修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键。DNADNA连接酶连接酶OHOHPPnicknic

30、k5 5 G G-C C-T T-C C-T T-GG-C C-A A GG-GG-A A-G 3G 33 3 C C-GG-A A-GG A A-C C-GG-T T-C C-C C-T T-C 5C 5OHOHPPnicknick2.2 DNA2.2 DNA连接酶连接酶连接酶连接酶5 5 G G-C C-T T-C C-T T-GG-C C-A A-GG-GG-A A-G 3G 33 3 C C-GG-A A-GG-A A-C C-GG-T T-C C-C C-T T-C 5C 5第四十页，讲稿共九十页哦n大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶连接酶只能催化双链只能催化双链DNA的互补黏性末端，以的

31、互补黏性末端，以NAD+为能量。为能量。nT4噬菌体连接酶噬菌体连接酶黏性、平末端均可连接，以黏性、平末端均可连接，以ATP为能量。为能量。2.2.1 2.2.1 基本性质基本性质基本性质基本性质第四十一页，讲稿共九十页哦2.2.2 DNA连接酶的连接作用连接酶的连接作用1）必须是两条）必须是两条双链双链DNA。2）DNA3端有游离的端有游离的-OH，5端有一个磷酸基团（端有一个磷酸基团（P）。）。3）需要）需要能量能量动物或噬菌体中：动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中：大肠杆菌中：NAD+(1)连接条件连接条件第四十二页，讲稿共九十页哦第四十三页，讲稿共九十页哦1 U DNA连接酶的酶活性：

32、连接酶的酶活性：在最佳反应条件下在最佳反应条件下15反反应应 1 h，完全连接，完全连接 1 mg l-DNA（Hind 片段）所需片段）所需的酶量。的酶量。试剂条件试剂条件Tris-HCl50100 mM,pH 7.5DTT5 mMMgCl210 mMVolume10-20 mlATP0.5-1 mMTt4-15 4-16 h(2)DNA(2)DNA连接酶反应条件连接酶反应条件连接酶反应条件连接酶反应条件第四十四页，讲稿共九十页哦nATP（NAD+)提供激活的提供激活的AMP。nATP与连接酶形成共价与连接酶形成共价“连接酶连接酶-AMP”复合复合物，并释放出焦磷酸物，并释放出焦磷酸PPi。

33、nAMP与连接酶的与连接酶的赖氨酸赖氨酸-氨基氨基相连。相连。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+H3NAMPATPPPi(3)连接反应过程连接反应过程“连接酶连接酶-AMP”复合物复合物第四十五页，讲稿共九十页哦nAMP随后从连接酶的赖氨酸随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到氨基转移到DNA一条链的一条链的5端端P上，形成上，形成“DNA-腺苷酸腺苷酸”复合物。复合物。-OHHO-P-AMP-OHO-P-AMPDNA-腺苷酸腺苷酸”复合物复合物第四十六页，讲稿共九十页哦n3-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出释放出AMP。第四十七页，

34、讲稿共九十页哦连接多个平头双链连接多个平头双链DNADNA分子：分子：5 5 G G-C C-T T-C C-A A-GG-C C-T T-GG-GG-A A-GG 333 3 C C-GG-A A-GG-T T-C C-GG-A A-C C-C C-T T-C C 5 55 5 G G-C C-T T-C C-A A-GG-OHOH PP-C C-T T-GG-GG-A A-GG 333 3 C C-GG-A A-GG-T T-C C-PP OHOH-GG-A A-C C-C C-T T-C C 5 5 T4-DNAT4-DNA连接酶连接酶T4 DNAT4 DNA连接酶连接酶连接酶连接酶第四

35、十八页，讲稿共九十页哦1020倍。增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。(1)插入片段与载体的浓度比例插入片段与载体的浓度比例 (2)反应温度反应温度一般一般1416。3.酶用量酶用量2.2.3 影响连接反应的因素影响连接反应的因素第四十九页，讲稿共九十页哦2.3 DNA聚合酶聚合酶常常用用的的聚聚合合酶酶n大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 nKlenow fragment nT7 DNA聚合酶聚合酶 nT4 DNA聚合酶聚合酶 n修饰过的修饰过的T7 DNA聚合酶聚合酶 n逆转录酶逆转录酶催化以DNA为模板合成DNA的一类酶。第五十页，讲稿共九十页哦DNA聚合酶35外切酶活

36、性53外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中TaqDNA聚合酶无有快高常用常用DNA聚合酶的特性比较聚合酶的特性比较第五十一页，讲稿共九十页哦共同特点共同特点把把dNTPs连续地加到引物的连续地加到引物的3-OH端。端。主要区别主要区别持续合成能力和外切酶活性不同。持续合成能力和外切酶活性不同。T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模而不从模板上掉下来。板上掉下来。其它几种聚合酶只能连续添加其它几种聚合酶只能连

37、续添加10多个多个dNTPs就会从模就会从模板上解离下来。板上解离下来。常用的常用的DNA聚合酶的特点聚合酶的特点第五十二页，讲稿共九十页哦n基本性质：基本性质：53的的DNA聚合酶活性聚合酶活性53的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性35的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性3 3 G G-CC-T T-CC-AA-GG-CC-T T-GG-GG-AA-GG-A 5A 55 5 C C-GG-AA-GG-T T-OHOH5 5ppp dNTP Mgppp dNTP Mg2+2+3 3 G G-CC-T T-CC-AA-GG-CC-T T-GG-GG-AA-GG-A 5A 55 5 C C-GG-AA-

38、GG-T T-CC-GG-AA-CC-CC-OHOHDNA polDNA pol2.3.1 E.coli DNA2.3.1 E.coli DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 (DNA pol(DNA pol)第五十三页，讲稿共九十页哦缺口前移标记法缺口前移标记法5 5 G G-CC-T T-CC-AA-GG-CC-T T-GG-GG-AA-GG-T 3T 33 3 C C-GG-AA-GG-T T-CC-GG-AA-CC-CC-T T-CC-A A 5 5 5 5 G G-CC-T T-C AC A-GG-CC-T T-GG-GG-AA-GG-T 3T 33 3 C C-GG-AA-GG-T T-

39、CC-GG-AA-CC-CC-T T-CC-A A 5 5 5 5 G G-CC-T T-CC-A-GA-G-CC-T T-GG-GG-AA-GG-T 3T 33 3 C C-GG-AA-GG-T T-CC-GG-AA-CC-CC-T T-CC-A A 5 5 Nick translation制备制备32P标记标记的探针的探针DNaseDNaseMgMg2+2+5 5dNTP dNTP 5 5ppppp p dA dA（a a-3232P-dATPP-dATPDNA pol DNA pol 基本用途基本用途基本用途基本用途第五十四页，讲稿共九十页哦n基本性质基本性质n大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合

40、酶聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三端三分之二的大肽段，即为分之二的大肽段，即为Klenow酶；酶；nKlenow酶仍拥有酶仍拥有53的的DNA聚合酶活性和聚合酶活性和35的核的核酸外切酶活性，但失去了酸外切酶活性，但失去了53的核酸外切酶活性。的核酸外切酶活性。2.3.2 E.coli DNA2.3.2 E.coli DNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶 I I 大片段大片段大片段大片段(Klenow)(Klenow)第五十五页，讲稿共九十页哦基本用途基本用途补平由核酸内切酶产生的补平由核酸内切酶产生的5粘性末端粘性末端DNA片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记

41、cDNA第二链的合成第二链的合成双脱氧末端终止法测定双脱氧末端终止法测定DNA序列序列第五十六页，讲稿共九十页哦n补平由核酸内切酶产生的补平由核酸内切酶产生的5粘性末端粘性末端5 5 G G-C C-T T-GG-OHOH PP-A A-A A-T T-T T-C C-GG-A A-G 3G 33 3 C C-GG-A A-C C-T T-T T-A A-A A-PP OHOH-GG-C C-T T-C 5 C 5 KlenowKlenowdATP dTTPdATP dTTP5 5 G G-C C-T T-GG-A A-A A-T T-T T-OHOH PP-A A-A A-T T-T T-C

42、 C-GG-A A-G 3G 33 3 C C-GG-A A-C C-T T-T T-A A-A A-PP OHOH-T T-T T-A A-A A-GG-C C-T T-C 5 C 5 第五十七页，讲稿共九十页哦nDNA片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记5 5 G G-CC-T T-GG-OHOH PP-AA-AA-T T-T T-CC-GG-AA-G 3G 33 3 C C-GG-AA-CC-T T-T T-AA-AA-PP OHOH-GG-CC-T T-C 5 C 5 KlenowKlenowa a-3232P-ppP-ppp pdA dTTPdA dTTP5 5 G G-C C-

43、T T-GG-A A-A A-T T-T T-OHOH PP-A A-A A-T T-T T-C C-GG-A A-G 3G 33 3 C C-GG-A A-C C-T T-T T-A A-A A-PP OHOH-T T-T T-A A-A A-GG-C C-T T-C 5 C 5 第五十八页，讲稿共九十页哦3隐蔽末端的隐蔽末端的DNA片断片断Klenow fragment补平补平根据末端的顺序选择一根据末端的顺序选择一种种 -32P-dNTPs末端标记的末端标记的DNA 限制性内切酶切限制性内切酶切5-G33-CTTAA55-GAA33-CTTAA55-GAATT33-CTTAA55-G33

44、-CCTAG55-GG33-CCTAG55-GGATC33-CCTAG5EcoR IBamH I-32P-dATP-32P-dGTP25 1h第五十九页，讲稿共九十页哦mRNAcDNA第一链第一链逆转录逆转录cDNA第二链第二链klenow533553引物引物cDNA第二链的合成第二链的合成第六十页，讲稿共九十页哦2.3.3 T4-DNA聚合酶聚合酶基本特性基本特性53的的DNA聚合酶活性和聚合酶活性和35的核酸外切的核酸外切酶活性；酶活性；在无在无dNTP时，可以从任何时，可以从任何3-OH端外切；端外切；在只有一种在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时，外切至互补核苷酸暴露时停止；时

45、停止；在四种在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。均存在时，聚合活性占主导地位。第六十一页，讲稿共九十页哦n切平由核酸内切酶产生的切平由核酸内切酶产生的3粘性末端粘性末端5 5 G G-C C-T T-C C-T T-GG-C C-A A-OHOH PP-GG-GG-A A-G 3G 33 3 C C-GG-A A-GG-PP HOHO-A A-C C-GG-T T-C C-C C-T T-C 5 C 5 T4-DNAT4-DNA聚合酶聚合酶5 5 G G-C C-T T-C C-OHOH PP-GG-GG-A A-G 3G 33 3 C C-GG-A A-GG-PP HOHO-C C-

46、C C-T T-C 5C 5n注意：注意：该酶也能降解双链该酶也能降解双链DNA，只是其活性比单链降只是其活性比单链降解活性低很多。解活性低很多。基本用途基本用途基本用途基本用途第六十二页，讲稿共九十页哦DNA片段的同位素末端标记片段的同位素末端标记5 5GG-C C-T T-C C-A A-GG-C C-T T-GG-GG-A A-GG-T 3T 33 3CC-GG-A A-GG-T T-C C-GG-A A-C C-C C-T T-C C-A A 5 5 5 5GG-C C-T T-C AC A-GG-C C-T T-GG-OHOH HOHO-T T-C C-GG-A A-C C-C C-

47、T T-C C-A A 5 5 T4-DNA polT4-DNA polMgMg2+2+5 5ppp dN ppp dN 5 5ppppp p dA dA（a a-3232P-dATPP-dATP）T4-DNA polT4-DNA pol5 5GG-C C-T T-C C-A A-GG-C C-T T-GG-GG-A A-GG-T T 333 3 C C-GG-A A-GG-T T-C C-GG-A A-C C-C C-T T-C C-A A 5 5 第六十三页，讲稿共九十页哦n从从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成：两个亚基组成：T7

48、基因基因5编码的大亚基：编码的大亚基：有有53聚合酶和聚合酶和35外切酶活性。外切酶活性。大肠杆菌编码的小亚基：大肠杆菌编码的小亚基：增加大亚基对模板的亲和性。增加大亚基对模板的亲和性。2.3.4 T7-DNA聚合酶聚合酶第六十四页，讲稿共九十页哦 持续合成能力强持续合成能力强n一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。35外切酶活性高外切酶活性高n单链和双链都能降解。单链和双链都能降解。不受不受DNA二级结构的影响二级结构的影响n其它其它DNA聚合酶受聚合酶受DNA二级结构的阻碍。二级结构的阻碍。T7 DNA聚合酶的特点聚合酶的特点第六十五页，讲稿共九十页哦

49、 进行末端标记进行末端标记 以大分子量以大分子量DNA为模板的合成为模板的合成如如M13 补平隐蔽末端补平隐蔽末端3末端标记。末端标记。与与T4 DNA聚合酶相同。聚合酶相同。合成合成补平补平3隐蔽末端；隐蔽末端；水解水解修平修平3突出末端。突出末端。用途用途第六十六页，讲稿共九十页哦T7DNA聚合酶的化学修饰聚合酶的化学修饰n去除去除35外切酶活性，使外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合聚合能力和聚合速率提高了速率提高了3倍。倍。修饰后的修饰后的T7 DNA聚合酶的用途聚合酶的用途n DNA测序双脱氧法。测序双脱氧法。n 标记标记DNA 3隐蔽末端隐蔽末端n 更有效地补平末端更有效地补平末端修

50、饰后的修饰后的T7 DNA聚合酶聚合酶第六十七页，讲稿共九十页哦n基本特性：基本特性：以以RNA为模板聚合为模板聚合cDNA链链反转录酶反转录酶MgMg2+2+dNTP dNTP3 3AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA55mRNAmRNA5 5TTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTT oligo(dT)oligo(dT)12-1812-183 3AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA55mRNAmRNA5 5TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT33cDNAcDNA2.3.5 2.3.5 反转录酶反转录酶反转录酶反转录酶第六十