第八章超敏反应及其疾病课件.ppt
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1、第八章超敏反应及其疾病第1页,此课件共58页哦提要提要l l 利用免疫学原理建立的免疫学检测利用免疫学原理建立的免疫学检测 技术主要应用于对多种免疫性疾病(感技术主要应用于对多种免疫性疾病(感染性疾病、免疫缺陷病、超敏反应、自染性疾病、免疫缺陷病、超敏反应、自身免疫病、免疫增殖病、移植排斥反应身免疫病、免疫增殖病、移植排斥反应和肿瘤等)的诊断、疗效评估、发病机和肿瘤等)的诊断、疗效评估、发病机制探讨、以及对抗原性物质或免疫细胞制探讨、以及对抗原性物质或免疫细胞的定性、定量,对细胞因子、粘附分子的定性、定量,对细胞因子、粘附分子及细胞受体的检测等。及细胞受体的检测等。第2页,此课件共58页哦第一
2、节第一节 抗原或抗体的检测抗原或抗体的检测l l 抗原抗原-抗体反应包括沉淀反应、凝集反抗体反应包括沉淀反应、凝集反应、溶解反应、补体结合反应和中和反应、溶解反应、补体结合反应和中和反应等。应等。抗原抗原-抗体反应可抗体反应可 用已知的特异用已知的特异性抗体检测未知的抗原;也可用已知的性抗体检测未知的抗原;也可用已知的抗原检测未知的抗体。抗原检测未知的抗体。l l 免疫荧光技术、免疫酶技术、同位素免疫荧光技术、免疫酶技术、同位素标记技术、发光免疫分析等免疫标记技标记技术、发光免疫分析等免疫标记技术提高了抗原抗体反应的敏感性。术提高了抗原抗体反应的敏感性。第3页,此课件共58页哦抗原抗原-抗体反
3、应的特点抗体反应的特点抗原抗原-抗体的结合是特异性结合抗体的结合是特异性结合抗原抗体结合是分子表面的非抗原抗体结合是分子表面的非 共价键结合共价键结合抗原抗体反应可分为两个阶段抗原抗体反应可分为两个阶段 特异性结合阶段特异性结合阶段 可见的反应阶段可见的反应阶段抗原和抗体结合是否呈现可见的反应现抗原和抗体结合是否呈现可见的反应现 象,于两者的分子比例密切相关象,于两者的分子比例密切相关第4页,此课件共58页哦抗原抗体比例对反应现象的影响抗原抗体比例对反应现象的影响第5页,此课件共58页哦抗原抗原-抗体反应受多种因素影响抗体反应受多种因素影响l l1 电解质电解质:抗原:抗原-抗体反应通常应用抗
4、体反应通常应用0.85%的氯化钠作为的氯化钠作为 稀稀 释液释液,以供给适,以供给适应浓度的电解质。应浓度的电解质。l l2 温度温度:一般常使用反应在:一般常使用反应在37度水浴度水浴 或或孵育箱中进孵育箱中进 行。行。l l3.酸碱度酸碱度:抗原:抗原-抗体反应适应的酸碱度抗体反应适应的酸碱度 为为PH68。抗原-抗体反应受多种因素影响第6页,此课件共58页哦抗原抗体的检测方法抗原抗体的检测方法l l凝集反应凝集反应l l沉淀反应沉淀反应l l补体溶血反应补体溶血反应 和补体结合反应和补体结合反应l l中和反应中和反应l l用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反
5、应第7页,此课件共58页哦凝集反应凝集反应(Agglutination)l l 细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成凝集结合后形成凝集 现象,称为凝聚反应。现象,称为凝聚反应。l l 1、直接凝集:将细菌或红细胞与相应、直接凝集:将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应,出现细菌凝集或红细的抗体直接反应,出现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法和试管法。胞凝集现象。又分为玻片法和试管法。l l 2、间接凝集:将可溶性抗原包被在红、间接凝集:将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面,与相应抗体反应细胞或乳胶颗粒表面,与相应抗体反应出现颗粒凝集现象。出现颗粒凝集
6、现象。第8页,此课件共58页哦血血 球球 凝凝 集集第9页,此课件共58页哦沉淀反应沉淀反应(Precipitation)血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉等可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物,这一类反应称为沉淀反应。沉淀淀物,这一类反应称为沉淀反应。沉淀反应可在液体中进行,如絮状沉淀。大反应可在液体中进行,如絮状沉淀。大多沉淀反应是用半固体琼脂凝胶为介质,多沉淀反应是用半固体琼脂凝胶为介质,进行琼脂扩散故也称免疫扩散。进行琼脂扩散故也称免疫扩散。第10页,此课件共58页哦单向免疫扩散单向免疫扩散(Single Immunodi
7、ffusion)l l是将一定量已知抗体混于琼是将一定量已知抗体混于琼是将一定量已知抗体混于琼是将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制琼脂板,在适当脂凝胶中制琼脂板,在适当脂凝胶中制琼脂板,在适当脂凝胶中制琼脂板,在适当位置打孔后将抗原加入孔中位置打孔后将抗原加入孔中位置打孔后将抗原加入孔中位置打孔后将抗原加入孔中扩散。抗原在扩散过程中与扩散。抗原在扩散过程中与扩散。抗原在扩散过程中与扩散。抗原在扩散过程中与凝胶中的抗体相遇,形成以凝胶中的抗体相遇,形成以凝胶中的抗体相遇,形成以凝胶中的抗体相遇,形成以抗原孔为中心的沉淀环,环抗原孔为中心的沉淀环,环抗原孔为中心的沉淀环,环抗原孔为中心的沉淀环,环的
8、直径与抗原含量成正比相的直径与抗原含量成正比相的直径与抗原含量成正比相的直径与抗原含量成正比相关。本法常用于测定血清关。本法常用于测定血清关。本法常用于测定血清关。本法常用于测定血清IgGIgG、IgMIgM、IgA IgA 和和和和 C C 3 3等的含量。等的含量。等的含量。等的含量。含抗体的凝胶含抗体的凝胶沉淀环沉淀环第11页,此课件共58页哦双向免疫扩散双向免疫扩散(Double Immunodiffusion)l l是将抗原与抗体分别加入是将抗原与抗体分别加入是将抗原与抗体分别加入是将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中,二者琼脂凝胶的小孔中,二者琼脂凝胶的小孔中,二者琼脂凝胶的小孔中
9、,二者自由向周围扩散并相遇,自由向周围扩散并相遇,自由向周围扩散并相遇,自由向周围扩散并相遇,在比例合适处形成沉淀线。在比例合适处形成沉淀线。在比例合适处形成沉淀线。在比例合适处形成沉淀线。如果反应体系中含两种以如果反应体系中含两种以如果反应体系中含两种以如果反应体系中含两种以上的抗原抗体系统,则小上的抗原抗体系统,则小上的抗原抗体系统,则小上的抗原抗体系统,则小孔间可出现两条以上的沉孔间可出现两条以上的沉孔间可出现两条以上的沉孔间可出现两条以上的沉淀线。本法常用于抗原或淀线。本法常用于抗原或淀线。本法常用于抗原或淀线。本法常用于抗原或抗体的定性抗体的定性抗体的定性抗体的定性 、组成和两种、组
10、成和两种、组成和两种、组成和两种抗原相关性分析的检测。抗原相关性分析的检测。抗原相关性分析的检测。抗原相关性分析的检测。第12页,此课件共58页哦免疫电泳免疫电泳(Immunoelectrophoresis)l l是先将待侧血清标本作琼脂是先将待侧血清标本作琼脂是先将待侧血清标本作琼脂是先将待侧血清标本作琼脂凝胶电泳,血清中各蛋白组凝胶电泳,血清中各蛋白组凝胶电泳,血清中各蛋白组凝胶电泳,血清中各蛋白组分被分成不同的区带,然后分被分成不同的区带,然后分被分成不同的区带,然后分被分成不同的区带,然后与电泳方向平行挖一小槽,与电泳方向平行挖一小槽,与电泳方向平行挖一小槽,与电泳方向平行挖一小槽,加
11、入相应的抗血清,把分成加入相应的抗血清,把分成加入相应的抗血清,把分成加入相应的抗血清,把分成区带的蛋白抗原成分作双向区带的蛋白抗原成分作双向区带的蛋白抗原成分作双向区带的蛋白抗原成分作双向免疫扩散,在各区带相应的免疫扩散,在各区带相应的免疫扩散,在各区带相应的免疫扩散,在各区带相应的位置形成沉淀弧。该法常用位置形成沉淀弧。该法常用位置形成沉淀弧。该法常用位置形成沉淀弧。该法常用于血清蛋白种类分析,以观于血清蛋白种类分析,以观于血清蛋白种类分析,以观于血清蛋白种类分析,以观察察察察IgIg的异常增多或缺失。的异常增多或缺失。的异常增多或缺失。的异常增多或缺失。第13页,此课件共58页哦火箭电泳
12、火箭电泳(Rocket Electrophoresis)火箭电泳也称免疫扩散,是把单向免疫扩散火箭电泳也称免疫扩散,是把单向免疫扩散同电泳结合在一起的方法。抗原在含有定量抗体同电泳结合在一起的方法。抗原在含有定量抗体的琼脂中泳动,两者比例适宜时,在较短时间内的琼脂中泳动,两者比例适宜时,在较短时间内生成锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内,沉淀峰生成锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内,沉淀峰的高度与抗原含量成正比。此法的特点是需时较的高度与抗原含量成正比。此法的特点是需时较短,故可用于快速沉淀标本中抗原的含量。短,故可用于快速沉淀标本中抗原的含量。第14页,此课件共58页哦火箭电泳示意图火箭电泳示意图第
13、15页,此课件共58页哦补体结合反应补体结合反应(Complement Fixation,CFT)敏感性和特异性均较高,但该试验影响因素敏感性和特异性均较高,但该试验影响因素较多,现在已有被其它新方法取代的趋势。较多,现在已有被其它新方法取代的趋势。第16页,此课件共58页哦免疫标记技术免疫标记技术l l 用荧光素、同位素或酶等示踪物质用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标记抗体(或抗原)进行抗原标记抗体(或抗原)进行抗原-抗体反应。抗体反应。标记物质与抗体(或抗原)的化学连接标记物质与抗体(或抗原)的化学连接未改变抗体(或抗原)的免疫学特性,未改变抗体(或抗原)的免疫学特性,同时标记物的性质依然
14、存在,因而极大同时标记物的性质依然存在,因而极大的提高了反应的灵敏度,可以对微量物的提高了反应的灵敏度,可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。免疫标质进行定量、定性或定位检测。免疫标记技术主要有三种基本类型:免疫荧光记技术主要有三种基本类型:免疫荧光技术、免疫酶技术和同位素标记技术。技术、免疫酶技术和同位素标记技术。第17页,此课件共58页哦免疫荧光显微技术免疫荧光显微技术(Immunofluorescence Technique)l l 是用荧光素(常用的有异硫氰酸荧光素,是用荧光素(常用的有异硫氰酸荧光素,FITC)与抗体连接成荧光抗体,再与待与抗体连接成荧光抗体,再与待测标本的抗原反应
15、,置荧光显微镜下测标本的抗原反应,置荧光显微镜下观察,抗原抗体复合物散发出荧光,借观察,抗原抗体复合物散发出荧光,借此对标本中的抗原作鉴定和定位。此对标本中的抗原作鉴定和定位。l l 包括直接荧光法、间接荧光法和补体法。包括直接荧光法、间接荧光法和补体法。第18页,此课件共58页哦l l直接荧光法:将荧光素直接标记抗体作标本染色。直接荧光法:将荧光素直接标记抗体作标本染色。直接荧光法:将荧光素直接标记抗体作标本染色。直接荧光法:将荧光素直接标记抗体作标本染色。该法的优点是特异性强,但其缺点是每检测一种抗该法的优点是特异性强,但其缺点是每检测一种抗该法的优点是特异性强,但其缺点是每检测一种抗该法
16、的优点是特异性强,但其缺点是每检测一种抗原必须制备相应的荧光抗体。原必须制备相应的荧光抗体。原必须制备相应的荧光抗体。原必须制备相应的荧光抗体。l l间接荧光法:用一抗与标本中的抗原结合,再用间接荧光法:用一抗与标本中的抗原结合,再用间接荧光法:用一抗与标本中的抗原结合,再用间接荧光法:用一抗与标本中的抗原结合,再用荧光素标记的二抗染色。该法的优点是敏感性比荧光素标记的二抗染色。该法的优点是敏感性比荧光素标记的二抗染色。该法的优点是敏感性比荧光素标记的二抗染色。该法的优点是敏感性比直接法高,制备一种荧光素标记的二抗可用于多直接法高,制备一种荧光素标记的二抗可用于多直接法高,制备一种荧光素标记的
17、二抗可用于多直接法高,制备一种荧光素标记的二抗可用于多种抗原的检测,但非特异性荧光亦会增加。种抗原的检测,但非特异性荧光亦会增加。种抗原的检测,但非特异性荧光亦会增加。种抗原的检测,但非特异性荧光亦会增加。l l补体结合免疫荧光法:此法是在间接法的第一步补体结合免疫荧光法:此法是在间接法的第一步补体结合免疫荧光法:此法是在间接法的第一步补体结合免疫荧光法:此法是在间接法的第一步抗原抗原抗原抗原抗体反应时加入补体,使之与抗原抗体反应时加入补体,使之与抗原抗体反应时加入补体,使之与抗原抗体反应时加入补体,使之与抗原抗抗抗抗体复合物结合;再用荧光素标记的抗体复合物结合;再用荧光素标记的抗体复合物结合
18、;再用荧光素标记的抗体复合物结合;再用荧光素标记的抗C3C3抗体进行示抗体进行示抗体进行示抗体进行示踪。踪。踪。踪。第19页,此课件共58页哦间间接接免免疫疫荧荧光光法法示示意意图图第20页,此课件共58页哦免免疫疫荧荧光光显显微微技技术术第21页,此课件共58页哦流式细胞术流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)FCM是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪,是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪,对单个细胞的表面标志(抗原或受体)进行快对单个细胞的表面标志(抗原或受体)进行快速、精确的分析和自动检测,并将不同类型的速、精确的分析和自动检测,并将不同类型的细胞分选收集。细胞分选收集。FCM还可对
19、同一细胞的多种参还可对同一细胞的多种参数(如数(如DNA、RNA、蛋白质和细胞体积等)进行蛋白质和细胞体积等)进行多信息分析,为当代生命科学研究领域中广泛使多信息分析,为当代生命科学研究领域中广泛使用的一项新技术。用的一项新技术。第22页,此课件共58页哦流式细胞仪工作原理流式细胞仪工作原理第23页,此课件共58页哦酶免疫测定酶免疫测定(Enzyme Immunoassay,EIA)l l 是是用用酶酶(常常用用的的有有辣辣根根过过氧氧化化物物酶酶,HRP和和碱碱性性磷磷酸酸酶酶,AP)标标记记的的抗抗体体进进行行的的抗抗原原抗抗体体反反应应。EIA将将抗抗原原抗抗体体反反应应的的特特异异性性
20、与与酶酶催催化化作作用用的的高高效效性性相相结结合合,通通过过酶酶作作用用于于底底物物后后显显色色来来判判定定结结果果。常常用用的的方方法法有有酶酶联联免免疫疫吸吸附附试试验验和和酶酶免免疫疫组组化化法法,前前者者测测定定可可溶溶性性抗抗原原或或抗抗体体,后后者者测测定定组组织织中中或或细细胞胞表表面面的的抗抗原原。第24页,此课件共58页哦酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)l l是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面,使抗原(聚苯乙烯微量反应板)表面,使抗原
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