酶催化反应动力学固定化酶 (2)课件.ppt

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1、酶催化反应动力学固定化酶第1页，此课件共127页哦酶催化反应动力学也称酶促反应动力学（kinetics of enzyme-catalyzed reactions），是研究酶促反应速度以及影响此速度的各种因素的科学。在研究酶的结构与功能的关系以及酶的作用机制时，需要酶促反应动力学提供相关的实验证据；为了找到最最有有利利的的反反应应条条件件从而提提高高酶酶催催化化反反应应的的效效率率以及了了解解酶在代谢过程中的作用和某些药物的作作用用机机制制等，也需要我们掌握酶促反应动力学的相关规律。因此，对于酶促反应动力学的研究既有重要的理论意义又具有相当的实践价值。第2页，此课件共127页哦酶促反应动力学以

2、化学动力学为基础，通过对酶促反应速度的测定来讨论诸如底底物物浓浓度度、抑抑制制剂剂、温度、温度、pH和激活剂等因素和激活剂等因素对酶促反应速度的影响。酶的动力学研究包括哪些内容?重重 要要第3页，此课件共127页哦温度、pH及激活剂都会对酶促反应速度产生十分重要的影响，酶促反应不但需要最适温度和最适pH，还要选择合适的激活剂。而且在研究酶促反应速度以及测定酶的活力时，都应选择相关酶的最适反应条件。第4页，此课件共127页哦3.1酶催化反应速度如果我们以产物生成量(或底物减少量)来对反应时间作图，便可以得到如图3-1所示的曲线图。第5页，此课件共127页哦图3-1 酶促反应的速度曲线该曲线的斜率

3、表示单位时间内产物生成量的变化，因此曲线上任何一点的斜率就是相应横坐标上时间点的反应速度。从图中的曲线可以看出在反应开始的一段时间内斜率几乎不变，然而随着反应时间的延长，曲线逐渐变平坦，相应的斜率也渐渐减小，反应速度逐渐降低，显然这时测得的反应速度不能代表真实的酶活力。第6页，此课件共127页哦引起酶促反应速度随反应时间延长而降低的原因很多，如底物浓度的降低、产物浓度增加从而加速了逆反应的进行、产物对酶的抑制或激活作用以及随着反应时间的延长引起酶本身部分分子失活等等。因此在测定酶活力时，应测定酶促反应的初速度，从而避免上述各种复杂因素对反应速度的影响。由于反应初速度与酶量呈线性关系，因因此此可

4、可以以用用测测定定反反应应初初速速度度的的方方法法来来测测定定相相关关制制剂中酶的含量。剂中酶的含量。第7页，此课件共127页哦酶活力测定时需注意：1 选择反应的最适温度，根据不同的底物和缓冲液选择反应的最适pH。2 速度要快，取反应的初速度3 底物浓度要足够大（一般在10Km以上）使酶被底物饱和，以充分反应待测酶的活力第8页，此课件共127页哦测定酶活力的基本原理酶蛋白的含量很低，很难直接测定其蛋白质的含量，且常与其他各种蛋白质混合存在，将其提纯耗时费力。故不能直接用重量或体积等指标来衡量。测定产物增加量测定产物增加量测定底物减少量测定底物减少量第9页，此课件共127页哦测定酶活力常用的方法

5、：分光光度法（spectrophotometry）利用底物和产物再紫外或可见光部分的光吸收的不同，选择某一适当的波长，测定反应过程中反应进行的情况荧光法（fluorometry）根据酶促反应的底物或产物的荧光性质的差别来进行酶活力的测定同位素法（isotope method）放射性同位素的底物在经酶作用后所得到的产物，通过适当的方法进行分离，从而只需测定产物的脉冲数即可换算出酶的活力单位电化学方法（electrochemical method）其他方法：如旋光法、量气法、量热法和层析法等第10页，此课件共127页哦3.2 底物浓度对酶促反应速度的影响底物浓度对酶促反应速度的影响中间络合物学说中

6、间络合物学说中间络合物学说也称酶底物中间络合物学说，最早是由Henri和Wurtz两位科学家提出的。在1903年，Henri在用蔗糖酶水解蔗糖实验研究化学反应中底物浓度与反应速度的关系时发现，当酶浓度不变时，可以测出一系列不同底物浓度下的化学反应速度，以该反应速度对底物浓度作图，可得到如图3-2所示的曲线。第11页，此课件共127页哦图3-2 底物浓度对酶促反应速度的影响第12页，此课件共127页哦从该曲线图可以看出，当底物浓度较低时，反应速度与底物浓度的关系呈正比关系，反应表现为一级反应。然而随着底物浓度的不断增加，反应速度不再按正比升高，此时反应表现为混合级反应。当底物浓度达到相当高时，底

7、物浓度对反应速度影响逐渐变小，最后反应速度几乎与底物浓度无关，这时反应达到最大反应速度（Vmax），反应表现为零级反应。第13页，此课件共127页哦根据这一实验结果，Henri和Wurtz提出了酶促化学反应的酶底物中间络合物学说。该学说认为：当酶催化某一化学反应时，酶(E)首先需要和底物(S)结合生成酶底物中间络合物即中间复合物(ES)，然后再生成产物(P)，同时释放出酶。该学说可以用下面的化学反应方程式来表示：S+E ES P+E第14页，此课件共127页哦我们根据中间络合物学说很容易解释图3-2所示的实验曲线，在酶浓度恒定这一前提条件下，当底物浓度很小时酶还未被底物所饱和，这时反应速度取决

8、于底物浓度并与之成正比。随着底物浓度不断增大，根据质量作用定律，中间复合物ES生成也不断增多，而反应速度取决于ES的浓度，故反应速度也随之增高但此时二者不再成正比关系。第15页，此课件共127页哦当底物浓度达到相当高的程度时，溶液中的酶已经全部被底物所饱和，此时溶液中再也没有多余的酶，虽增加底物浓度也不会有更多的中间复合物ES生成，因此酶促反应速度变得与底物浓度无关，而且反应达到最大反应速度（Vmax）。当我们以底物浓度S对反应速度v作图时，就形成一条双曲线。在此需要特别指出的是，只只有有酶酶促促催催化化反反应应才才会会有有这这种种饱饱和和现现象象，而与此相反，非催化反应则不会出现这种饱和现象

9、。第16页，此课件共127页哦酶促反应的动力学方程式（米氏方程）1913年Michaelis和Menten两位科学家在前人工作的基础上，根据酶促反应的中间络合物学说，推导出一个数学方程式，用来表示底物浓度与酶反应速度之间的量化关系，通常把这个数学方程式称为米氏方程：其中Km称为米氏常数 第17页，此课件共127页哦米氏常数的含义Km值就代表着反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。第18页，此课件共127页哦米氏常数的应用价值Km是酶的一个特征性常数：也就是说Km的大小只与酶本身的性质有关，而与酶浓度无关。Km值还可以用于判断酶的专一性和天然底物，Km值最小的底物往往被称为该酶的最适底物或天

10、然底物。Km可以作为酶和底物结合紧密程度的个度量指标，用来表示酶与底物结合的亲和力大小。已知某个酶的Km值，就可以计算出在某一底物浓度条件下，其反应速度相当于Vmax的百分比。Km值还可以帮助我们推断具体条件下某一代谢反应的方向和途径，只有Km值小的酶促反应才会在竞争中占优势。第19页，此课件共127页哦3.3抑制剂对酶促反应速度的影响抑制剂对酶促反应速度的影响由于酶的本质是蛋白质，凡可使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用都称为失活作用(inactivation)。如果由于酶必需基团的化学性质发生改变，但酶并未发生变性，而引起酶活力降低或丧失的作用则称为抑制作用(inhibition)。导致酶发

11、生抑制作用的物质称为抑制剂(inhibitor)。第20页，此课件共127页哦由于抑制作用与变性作用从本质而言是不同的，因此与变性剂对酶的变性作用无选择性不同的是，抑制剂对酶的抑制作用是有选择性的，即一种抑制剂只能使某一种酶或对某一类酶产生抑制作用。第21页，此课件共127页哦对酶抑制作用的探讨是研究酶的结构与功能、酶的催化机制以及阐明机体代谢途径的基本手段，也可以为医药产业中设计新药物和农业生产中设计新农药提供重要的理论依据，从这个角度而言，对酶抑制作用的研究不仅具有重要的理论意义，而且具有突出的实践价值。第22页，此课件共127页哦3.3.1抑制作用的类型抑制作用的类型根据抑制剂与酶的作用

12、方式的区别以及抑制作用是否可逆，我们可以将抑制作用分为两大类，即：不可逆的抑制作用不可逆的抑制作用可逆的抑制作用。可逆的抑制作用。第23页，此课件共127页哦3.3.1.1 不可逆的抑制作用不可逆的抑制作用由于抑制剂与酶的必需基团以共价键的形式结合而引起酶活力降低或丧失，因此不能用透析、超滤等物理方法去除抑制剂而使酶复活，这种抑制作用是不可逆的，我们称之为不可逆抑制。此时被抑制的酶分子受到抑制剂对其不同程度的化学修饰，因此不可逆抑制从本质上来说就是酶的修饰抑制。第24页，此课件共127页哦不可逆抑制剂 通常把不可逆抑制剂分为两种类型，即非专一性不可逆抑制剂和专一性不可逆抑制剂。第25页，此课件

13、共127页哦非专一性不可逆抑制剂 主要包括以下六大类：a)有机磷化合物b)有机汞、有机砷化合物：抑制含巯基的酶。c)重金属盐：能使酶蛋白变性而失活。d)烷化剂：与酶必需基团中的巯基、氨基、羧基、咪唑基和硫醚基等结合，从而抑制酶活性。e)硫化物、氰化物和CO：这类物质能通过与酶中金属离子形成较为稳定络合物的形式，来抑制酶的活性。f)青霉素（Penicillin）：青霉素可通过与糖肽转肽酶活性部位丝氨酸羟基共价结合的方式，使糖肽转肽酶失活，导致细菌细胞壁合成受阻，从而损害细菌生长。第26页，此课件共127页哦专一性不可逆抑制剂 可以分为Ks型和Kat型两大类。a)Ks型不可逆抑制剂：具有与底物相类

14、似的结构b)Kat型不可逆抑制剂：该类抑制剂不但具有与天然底物相类似的结构，而且抑制剂本身也是酶的底物，这类不可逆抑制剂的特点是专一性极高，因此也被称为自杀性底物（suicide substrate）。第27页，此课件共127页哦3.3.1.2 可逆的抑制作用可逆的抑制作用由于抑制剂与酶以非共价键的形式结合而引起酶活力降低或丧失，但是能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活，这种抑制作用是可逆的，我们称之为可逆抑制(reversible inhibition)。第28页，此课件共127页哦根据可逆抑制剂与底物的关系，我们将可逆抑制作用分为三种类型，它们分别是竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争

15、性抑制。第29页，此课件共127页哦竞争性抑制竞争性抑制(competitive inhibition)：是最常见的一种可逆抑制作用。抑制剂(I)与底物(S)竞争酶(E)的同一结合部位，因此抑制剂的存在直接影响底物与酶的正常结合。这是由于酶的活性部位不能同时既与底物结合又与抑制剂结合，所以在底物和抑制剂之间会产生竞争，从而形成一定的平衡关系。第30页，此课件共127页哦对于绝大多数竞争性抑制剂而言，其结构与底物结构十分类似，因此也能与酶的活性部位结合形成可逆的酶-抑制剂复合物EI，但酶-抑制剂复合物EI不能分解成产物P，导致相应的酶促反应速度下降。其抑制程度取决于底物和抑制剂的相对浓度，可以通

16、过增加底物浓度的方法来解除这种抑制作用。这类抑制最典型的例子是丙二酸和戊二酸竞争与琥珀酸脱氢酶结合，但不能催化脱氢反应。第31页，此课件共127页哦非竞争性抑制非竞争性抑制(noncompetitive inhibition)：这类抑制作用的特点是底物(S)和抑制剂(I)可以同时与酶(E)结合，两者之间不存在竞争关系。但是在酶与抑制剂结合后，还可以进一步与底物结合形成酶-底物-抑制剂复合物ESI；酶与底物结合后，也可以进一步与抑制剂结合形成酶-底物-抑制剂复合物ESI。但是这种中间的三元复合物，即酶-底物-抑制剂复合物ESI不能进一步分解产生产物，因此相应的酶促反应速度下降。第32页，此课件共

17、127页哦由于这类抑制剂与酶活性部位以外的基团相结合，因此其结构与底物结构并无相似之处，而且不能用增加底物浓度的方法来解除这种抑制作用，故称非竞争性抑制。这类抑制最典型的例子是亮氨酸是精氨酸酶的一种非竞争性抑制剂。还有某些重金属离子如Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+等对酶的抑制作用也属于这一类。第33页，此课件共127页哦反竞争性抑制(uncompetitive inhibition)：这类抑制作用的特点是只有在酶(E)与底物(S)结合后，才能与抑制剂(I)结合，形成酶-底物-抑制剂复合物ESI，与非竞争性抑制相似，这种中间的三元复合物，即酶-底物-抑制剂复合物ESI不能进一步分解产生产物

18、，因此相应的酶促反应速度下降。第34页，此课件共127页哦这种抑制作用在单底物反应中比较少见，而常见于多底物反应中。目前已经证明，肼类化合物对胃蛋白酶的抑制作用、氰化物对芳香硫酸酯酶的抑制作用、L-Phe和L-同型精氨酸等多种氨基酸对碱性磷酸酶的抑制作用都属于反竞争性抑制。第35页，此课件共127页哦图3-3酶与底物或抑制剂结合的中间物第36页，此课件共127页哦第37页，此课件共127页哦3.3.2可逆抑制作用和不可逆抑制作用的鉴别可逆抑制作用和不可逆抑制作用的鉴别鉴别可逆抑制作用和不可逆抑制作用，除了用透析、超滤和凝胶过滤等物理方法能否除去抑制剂来判断外，还可采用化学动力学的方法来区分。第

19、38页，此课件共127页哦图3-4 可逆抑制剂与不可逆抑制剂的区别（一）曲线1，无抑制剂；曲线2，不可逆抑制剂；曲线3，可逆抑制剂第39页，此课件共127页哦在测定酶活力的系统中加入一定量的抑制剂，然后测定不同酶浓度条件下的酶促反应初速度，以酶促反应应初初速速度度对对酶酶浓浓度度作作图。在测定酶活力的系统中不加抑制剂时，以酶促反应初速度对酶浓度作图得到如图3-4曲线1所示的一条通过原点的直线；当测定酶活力的系统中加入一定量的不可逆抑制剂时，由于抑制剂会使一定量的酶失活，因此只有加入的酶量大于不可逆抑制剂的量时，才表现出酶活力。第40页，此课件共127页哦以酶促反应初速度对酶浓度作图得到如图3-

20、4曲线2所示的一条与曲线1平行的相交于横坐标正侧的直线，所以不可逆抑制剂的作用相当于把原点向右移动；当测定酶活力的系统中加入一定量的可逆抑制剂时，由于抑制剂的量是恒定的，因此以酶促反应初速度对酶浓度作图得到如图3-4曲线3所示的一条通过原点，但斜率较低于曲线1的直线。第41页，此课件共127页哦3.3.3可逆抑制作用动力学可逆抑制作用动力学对于可逆抑制剂与酶结合后产生的抑制作用，可以根据米氏学说基本原理加以推导，来定量说明可逆抑制剂对酶促反应速度的影响，下面着重讨论三种类型可逆抑制作用的化学动力学。第42页，此课件共127页哦3.3.3.1 竞争性抑制竞争性抑制在竞争性抑制中，底物(S)或抑制

21、剂(I)与酶(E)的结合都是可逆的，因此存在着如下的化学平衡式：第43页，此课件共127页哦在加入竞争性抑制剂后，Vmax不变，Km变大，KmKm，而且Km随抑制剂浓度I的增加而增加。抑制分数与抑制剂浓度I成正比，而与成反应物浓度S反比。双倒数作图所得直线相交于纵轴，这就是竞争性抑制作用的特点。第44页，此课件共127页哦图3-5 竞争性抑制曲线第45页，此课件共127页哦3.3.3.2 非竞争性抑制非竞争性抑制在非竞争性抑制中，抑制剂(I)与酶(E)或酶-底物复合物(ES)以及底物(S)与酶-抑制剂复合物(EI)的结合都是可逆的，因此存在着如下的化学平衡式：第46页，此课件共127页哦在加入

22、非竞争性抑制剂后，Km值不变，Vmax变小，而且Km=Km，Vmax随I的增加而减小。抑制分数与抑制剂浓度I成正比，而与底物浓度S无关，即I不变时，任何S的抑制分数是一个常数。双倒数作图所得直线相交于横轴，这是非竞争性抑制作用的特点。第47页，此课件共127页哦图3-6 非竞争性抑制曲线第48页，此课件共127页哦3.3.3.3 反竞争性抑制反竞争性抑制反竞争性抑制的特点是，酶(E)必须先与底物(S)结合，然后才与抑制剂(I)结合，即抑制剂(I)与酶-底物复合物(ES)的结合是可逆的，因此存在着如下的化学平衡式：第49页，此课件共127页哦在加入反竞争性抑制剂后，Km及Vmax都变小，而且Km

23、Km，VmaxVmax，即表观Km及表观Vmax，都随I的增加而减小。抑制分数既与抑制剂浓度I成正比，也与底物浓度S成正比。双倒数作图为一组平行线，这是反竞争性抑制作用的特点。第50页，此课件共127页哦图3-7 反竞争性抑制曲线第51页，此课件共127页哦为了方便理解和记忆，我们现将无抑制剂和有抑制剂等不同情况下的米氏方程和Vmax及Km的变化总结归纳在表3-1中。第52页，此课件共127页哦为了便于比较三种抑制类型的区别，我们可以用Dixon作图法求Ki，只要以抑制剂浓度I为横坐标，以酶促反应速度的倒数1/v为纵坐标，采用一个以上的底物浓度S，然后给出不同S时的直线，再由这些直线的交点即可

24、以得到Ki，如图3-8所示。第53页，此课件共127页哦图3-8 Dixon作图法求Ki（S2S1）A.非竞争性抑制 B.竞争性抑制 C.反竞争性抑制第54页，此课件共127页哦3.4 其它因素对酶促反应速度的影响其它因素对酶促反应速度的影响其它各种影响酶促反应速度的因素主要包括温度、pH和激活剂等。第55页，此课件共127页哦3.4.1温度对酶促反应速度的影响温度对酶促反应速度的影响和绝大多数化学反应一样，酶促化学反应速度也和温度密切相关。温度对酶促化学反应速度的影响主要表现在两个方面，其一是当温度升高时，与一般化学反应一样，反应速度加快，这种影响可以用反应的温度系数来衡量。第56页，此课件

25、共127页哦所谓反应的温度系数是指反应温度提高10，其反应速度与原来反应速度之比，通常用Q10来表示。对大多数酶而言，酶促化学反应的温度系数Q10多为2，即温度每升高10，酶促化学反应速度为原反应速度的2倍。其二是由于酶的本质是蛋白质，因此随着温度逐渐升高，酶蛋白会因逐渐变性而失活从而导致酶促化学反应速度下降。第57页，此课件共127页哦在不同温度条件下进行某种酶促化学反应，然后将所测得的酶促反应速度相对于温度来作图，即可得到如图3-9所示的钟罩形曲线。从该曲线我们可以看出，在较低的温度范围内，酶促化学反应速度随温度升高而增大，但在超过一定温度后，酶促化学反应速度不见上升反而下降，因此只有在某

26、一温度条件下，酶促化学反应速度达到最大值，通常把这个温度称为酶促化学反应的最适温度(optimum temperature)。在一定条件下每种酶都有其催化反应的最适温度。第58页，此课件共127页哦酶所表现的最适温度是上述两种影响综合作用的结果。在酶促化学反应的最初阶段，酶蛋白的变性尚未表现出来，第一个方面的影响占主导地位，因此反应速度随温度升高而增加；但当反应温度逐渐高于最适温度时，酶蛋白变性逐渐突出，第二个方面的影响逐渐取代第一个方面的影响从而占主导地位，反应速度随温度升高的效应也将逐渐被酶蛋白变性效应所抵消，反应速度开始迅速下降，因此表现出酶促化学反应的最适温度。第59页，此课件共127

27、页哦一般来说，动物细胞内的酶最适温度一般为3540，植物细胞中的酶最适温度较动物细胞中稍高，通常在4050之间，而微生物中的酶最适温度差别则较大，如用于进行PCR反应的Taq DNA聚合酶的最适温度可高达70。第60页，此课件共127页哦需要指出的是，最适温度不是酶的特征物理常数，相反它常常受到其他各种条件如底物种类、作用时间、pH和离子强度等因素影响。如最适温度随酶促反应进行时间的长短而改变，这是因为温度使酶蛋白发生变性效应是随时间而逐步累加的。一般而言，酶促反应进行时间长时酶的最适温度低，酶促反应进行时间短则最适温度高，所以只有在规定的酶促反应时间内才可确定酶的最适温度。第61页，此课件共

28、127页哦图3-9 温度对酶促反应速度的影响 酶在固体状态下比在溶液中对温度的耐受力更高。酶的冰冻干粉制剂通常在冰箱中可存放几个月以上，而酶溶液一般在冰箱中只能保存数周。所以酶制剂以固体保存为佳。第62页，此课件共127页哦4.5.2 pH对酶促反应速度的影响对酶促反应速度的影响除温度影响之外，酶的活力还受到环境pH的影响。通常在一定pH下，酶会表现出最大活力，而一旦高于或低于此pH，酶活力就会降低，我们把表现出酶最大活力时的pH称为该酶的最适pH，在不同pH条件下进行某种酶促化学反应，然后将所测得的酶促反应速度相对于pH来作图，即可得到如图3-10所示的钟罩形曲线。第63页，此课件共127页

29、哦图3-10 pH对酶活力的影响第64页，此课件共127页哦与酶促化学反应的最适温度不同的是，各种酶在一定条件下都有其特定的最适pH，因此最适pH是酶的特性之一。但是酶的最适pH并不是一个常数，它受诸如底物种类和浓度、缓冲液种类和浓度等众多因素的影响，因此只有在一定条件下最适pH才有意义。第65页，此课件共127页哦绝大多数酶的最适pH在58之间，动物体内的酶最适pH多在6.58.0之间，植物及微生物中的酶酶最适pH多在4.56.5左右。但并不排除例外，如胃蛋白酶的最适pH为1.5，肝中精氨酸酶最适pH为9.7等等。第66页，此课件共127页哦pH影响酶活力的原因可能包括以下几个方面：(1)过

30、酸或过碱使酶的空间结构遭到破坏，引起酶变性从而导致酶构象的改变、酶活性随之丧失。(2)当pH改变不是十分剧烈时，酶虽未发生变性，但其活力已经受到影响。这是由于pH影响了底物的解离状态或酶分子活性部位上有关基团的解离状态或酶-底物复合物的解离状态，而使底物不能与酶结合形成酶-底物复合物，或者形成酶-底物复合物后不能生成产物，使酶活性降低。第67页，此课件共127页哦(3)pH影响了与维持酶分子空间结构有关的基团解离，从而改变酶活性部位的构象，进而降低了酶的活性。第68页，此课件共127页哦4种pH-酶活性曲线第69页，此课件共127页哦3.4.3激活剂对酶促反应速度的影响激活剂对酶促反应速度的影

31、响与抑制剂相对的是，凡是能提高酶活性的物质都称为激活剂(activator)，而激活剂中大部分是无机离子或简单的有机化合物。作为激活剂的金属离子主要包括K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Zn2+及Fe2+等离子，无机阴离子主要包括Cl-、Br-、I-、CN-、PO4-等。如Mg2+可以作为多种激酶及合成酶的激活剂，Cl-可以作为唾液淀粉酶的激活剂。第70页，此课件共127页哦激活剂对酶的作用具有一定程度的选择性，即一种激活剂只对某种酶起激活作用，而对另一种酶可能不起任何作用或起抑制作用，如对脱羧酶而言有激活作用的Mg2+对肌球蛋白腺三磷酶却有抑制作用；而对脱羧酶而言有抑制作用的Ca2+对肌球蛋

32、白腺三磷酶却有激活作用。有时各种离子之间有拮抗作用，如被K+激活的酶会受Na+的抑制，被Mg2+激活的酶会受Ca2+的抑制。有时金属离子的作用也可以相互替代，如作为激酶的激活剂的Mg2+可被Mn2+所代替。第71页，此课件共127页哦除此以外，可因浓度不同，同一种激活剂对于同一种酶会起不同的作用，如对于NADP+合成酶，当Mg2+浓度为(510)10-3molL时起激活作用酶活性上升，但当浓度升高到3010-3molL时酶活性下降；如果用Mn2+代替Mg2+，则在110-3 molL起激活作用酶活性上升，高于此浓度时则起抑制作用酶活性下降。第72页，此课件共127页哦除了上面提到的金属离子之外

33、，有些小分子有机化合物也可作为酶的激活剂。例如对木瓜蛋白酶和甘油醛3-磷酸脱氢酶等含巯基的酶而言半胱氨酸，还原型谷胱甘肽等还原剂对其有激活作用，它们可使酶中二硫键还原成巯基从而提高酶活性。因此在分离纯化木瓜蛋白酶和甘油醛3-磷酸脱氢酶等含巯基的酶过程中，往往需加半胱氨酸，还原型谷胱甘肽等还原剂，以保护巯基不至于在分离纯化过程中被氧化。第73页，此课件共127页哦第4章 固定化酶和固定化细胞 （2学时）主要内容：主要内容：4.1 固定化酶的定义与优点 4.2 酶固定化技术发展史 4.3 固定化酶的制备方法 4.4 固定化酶的特性 4.5 固定化活细胞 4.6 酶催化反应器及其类型第74页，此课件

34、共127页哦本章主要介绍了固定化技术的发展史、酶和细胞的固定化方法以及酶经固定化后性质的变化，从动力学方面分析了固定化后酶特性变化的原因，并简要介绍了酶反应器的结构特点。第75页，此课件共127页哦固定化酶、固定化细胞是一种在空间运动上受到完全约束或局部约束的酶、细胞。近代工业化利用始于1969年固定化氨基酰化酶的应用。利用固定化技术，解决了酶应用过程中的很多问题，为酶的应用开辟了新的前景。如可使所使用的酶、细胞能反复使用，使产物分离提取容易，并在生产工艺上可以实现连续化和自动化，故在20世纪70年代后得到迅速发展。其新的功能和新的应用正在迅速不断地扩展，是一项研究领域宽广、应用前景极为引人瞩

35、目的新研究领域和新技术。第76页，此课件共127页哦4.1 固定化酶的定义与优点所谓固定化酶(immobilized enzyme)，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。第77页，此课件共127页哦固定化酶的优点：（1）同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用重复多次地使用；（2）固定化后，和反应物分开，有有利利于于控控制制生生产产过过程程，同时也同时也省去了热处理使酶失活的步骤省去了热处理使酶失活的步骤；（3）稳定性显著提高稳定性显著提高；（4）可长期使用可长期使用，并可预测衰变的速度；（5）提供了研究酶动力学的良好模型研究酶动力学的良好模型。第78页，此课件共127

36、页哦4.2 酶固定化技术发展史酶固定化技术发展史 酶作为一种生物催化剂，因其催化作用具有高度专一性、催化条件温和、无污染等特点，广泛应用于食品加工、医药和精细化工等行业。但在使用过程中，人们也注意到酶的一些不足之处，如酶稳定性差、不能重复使用，并且反应后混入产品，纯化困难，使其难以在工业中更为广泛的应用。为适应工业化生产的需要，人们模仿人体酶的作用方式，通过固定化技术对酶加以固定改造，来克服游离酶在使用过程中的一些缺陷。第79页，此课件共127页哦将酶固定化以后，既保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不足之处，使其具有一般化学催化剂能回收反复使用的优点，并在生产工艺上可以实现连续化和自动化。事

37、实上，早在1916年，Nelson和Griffin就用吸附的方法实现了酶的固定化，他们将蔗糖酶吸附在骨炭粉上，发现吸附以后酶不溶于水而且具有和液体酶同样的活性，可惜这个重要的发现长期以来没有得到酶学家的重视。第80页，此课件共127页哦系统地进行酶的固定化研究则是从20世纪50年代开始的。1953年Grubhofer和Schleith将聚氨基苯乙烯树氮脂重化，然后将淀粉酶、羧肽酶、胃蛋白酶和核糖核酸酶等酶与这种载体结合，制成了固定化酶。六十年代后期，酶固定化技术迅速发展，出现了很多新的酶固定化方法。1969年，日本的著名学者千畑一郎等将固定化氨基酰化酶应用于DL-氨基酸的光学拆分上，来生产L-

38、氨基酸，开创了固定化酶应用于工业生产的先例。第81页，此课件共127页哦在20世纪60年代后期对酶的固定化研究主要是将酶与水不溶性载体结合起来，成为不溶于水的酶衍生物，所以最初曾称为水不溶酶（water insoluble enzyme）和固相酶（solid phase enzyme）。但是随着理论与技术的发展，后来发现也可以将溶解状态的酶固定在一个有限的空间使其不能自由移动，也能达到固定酶的作用。如把酶包埋在凝胶内，酶本身是可溶的，因此，用水不溶酶和固相酶的名称就不恰当了。所以在1971年召开的第一届国际酶工程会议上，建议采用统一的英文名称Immobilized Enzyme。第82页，此课

39、件共127页哦用于固定化的酶，起初都是采用经提取和分离纯化后的酶，后来随着固定化技术的发展，作为固定化的对象已不一定是酶，也可对含酶细胞或细胞器进行固定化。1973年，日本的千畑一郎等成功的使用固定化大肠杆菌菌体中的天冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天冬氨酸，将固定化微生物细胞首次应用于工业生产，使细胞固定化技术迅速发展1986年，我国科学家利用固定化原生质体发酵生产碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等相继获得成功。第83页，此课件共127页哦目前，固定化技术已经取得了许多重要成果，充分发挥了固定化酶和固定化细胞在改革工艺和降低成本方面的巨大潜力。但从目前的发展状况来看，尽管酶种类繁多，但已经固定化的

40、酶却相对有限，采用固定化酶技术大规模生产的企业尚属少数，真正在工业上使用的固定化酶还仅限于葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶和青霉素酰化酶等为数不多的十几个酶种，故仍需大力研究开发使更多的固定化酶和细胞能适用于工业规模生产。第84页，此课件共127页哦4.3固定化酶的制备方法固定化酶的制备方法固定化酶的制备方法、制备材料多种多样，不同的制备方法和材料，固定化后酶的特性不同。对于特定的目标酶，要根据酶自身的性质、应用目的、应用环境来选择固定化载体和方法。第85页，此课件共127页哦在具体选择时，一般应遵循以下几个原则。（1）必须注意维持酶的构象，特别是活性中心的构象。酶的催化反应取决于酶本身蛋白质分子所

41、特有的高级结构和活性中心，为了不损害酶的催化活性及专一性，酶在固定化状态下发挥催化作用时，既需要保证其高级结构，又要使构成活性中心的氨基酸残基不发生变化。第86页，此课件共127页哦这就要求酶与载体的结合部位不应当是酶的活性部位，应避免活性中心的氨基酸残基参与固定化反应；另外，由于酶蛋白的高级结构是凭借疏水键、氢键、盐键等较弱的键维持的，所以固定化时应采取尽可能温和的条件，避免那些可能导致酶蛋白高级结构破坏的条件，如高温、强酸、强碱、有机溶剂等处理。第87页，此课件共127页哦（2）酶与载体必须有一定的结合程度。酶的固定化既不影响酶的原有构象，又能使固定化酶能有效回收贮藏，利于反复使用。（3）

42、固定化应有利于自动化、机械化操作。这要求用于固定化的载体必须有一定的机械强度，才能使之在制备过程中不易破坏或受损。（4）固定化酶应有最小的空间位阻。固定化应尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高催化效率和产物的量。第88页，此课件共127页哦（5）固定化酶应有最大的稳定性。在应用过程中，所选载体应不和底物、产物或反应液发生化学反应。（6）固定化酶的成本适中。工业生产必须要考虑到固定化成本，要求固定化酶应是廉价的，以利于工业使用。第89页，此课件共127页哦酶的固定化方法主要可分为四类：吸附法、包埋法、共价键结合法和交联法等。吸附法和共价键结合法又可统称为载体结合法。第90页，此课件共127页哦4.

43、3.1吸附法吸附法吸附法（adsorption）是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法，是固定化中最简单的方法。酶与载体之间的亲和力是范德华力、疏水相互作用、离子键和氢键等。吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法。第91页，此课件共127页哦物理吸附法(physical adsorption)是通过物理方法将酶直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定化的方法。是制备固定化酶最早采用的方法，如-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶等都曾采用过此法进行固定化。物理吸附法常用的有机载体如纤维素、胶原、淀粉及面筋等；无机载体如活性炭、氧化铝、皂土、多孔玻璃、硅胶、二氧化钛、羟基磷灰石等。

44、（1）物理吸附法第92页，此课件共127页哦物理吸附法制备固定化酶，优点：操作简单、价廉、条件温和，载体可反复使用，酶与载体结合后，活性部位及空间构象变化不大，故所制得的固定化酶活力较高。缺点：由于靠物理吸附作用，酶和载体结合不牢固，在使用过程中容易脱落，所以使用受到限制。常与交联法结合使用。第93页，此课件共127页哦离子吸附法(ion adsorption)是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合的固定化方法，即通过离子键使酶与载体相结合的固定化方法。此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、-淀粉酶、纤维素酶等，在工业上用途较广。如最早应用于工业化生产的氨基酰化酶，就是使用多糖

45、类阴离子交换剂二乙基氨基乙基(DEAE)-葡聚糖凝胶固定化的。此外，DEAE-纤维素吸附的-淀粉酶、蔗糖酶已作为商品固定化酶。（2）离子吸附法第94页，此课件共127页哦离子吸附法所使用的载体是某些离子交换剂。常用的阴离子交换剂有DEAE-纤维素、混合胺类(ECTEOLA)-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、Amberlite IRA-93、410、900等；阳离子交换剂有羧甲基(CM)-纤维素、纤维素柠檬酸盐、Amberlite CG-50、IRC-50、IR-200、Dowex-50等。其吸附容量一般大于物理吸附剂。离子吸附法优点：具有操作简便、条件温和、酶活

46、力不易丧失等优点。此外，吸附过程同时可以纯化酶。第95页，此课件共127页哦4.3.2包埋法包埋法包埋法（entrapment）是将酶包埋在高聚物的细微凝胶网格中或高分子半透膜内的固定化方法。前者又称为凝胶包埋法，酶被包埋成网格型；后者又称为微胶囊包埋法，酶被包埋成微胶囊型。第96页，此课件共127页哦（1）凝胶包埋法 凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等合成凝胶或树脂。（2）微胶囊包埋法 微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的半透膜微胶囊内的方法。它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外的环境

47、直接接触，从而增加了酶的稳定性。常用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋酸纤维素等。第97页，此课件共127页哦用微胶囊包埋法制得的微囊型固定化酶的直径通常为几微米到数百微米，胶囊孔径为几埃至数百埃，适合于小分子为底物和产物的酶的固定化。如脲酶、天冬酰胺酶、尿酸酶、过氧化氢酶等。其制造方法有界面聚合法、界面沉淀法、二级乳化法、液膜（脂质体）法等。第98页，此课件共127页哦4.3.3共价键结合法共价键结合法共价键结合法(covalent binding）是将酶与聚合物载体以共价键结合的固定化方法。酶蛋白上可供载体结合的功能基团有以下几种：第99页，此课件共127页哦（1）酶蛋白N末端的-氨基

48、或赖氨酸残基的-氨基。（2）酶蛋白C末端的-羧基、天门冬氨酸残基的-羧基以及谷氨酸残基的-羧基。（3）半胱氨酸残基的巯基。（4）丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基的羟基。（5）组氨酸残基的咪唑基。（6）色氨酸残基的吲哚基。（7）苯丙氨酸和酪氨酸残基的苯环。第100页，此课件共127页哦其中最普遍的共价键结合基团是氨基、羧基以及苯环。常用来和酶共价偶联的载体的功能基团有芳香氨基、羟基、羧基和羧甲基等。这种方法是固定化酶研究中最活跃的一大类方法，但必须注意，参加共价结合的氨基酸残基应当是酶催化活性非必需基团，如若共价结合包括了酶活性中心有关的基团，会导致酶的活力损失。第101页，此课件共127页哦使载体活

49、化的方法（1）重氮法 重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体的重氮基团通过共价键相连接而固定化的方法，是共价键法中使用最多的一种。常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸的共聚体和聚丙烯酰胺衍生物等。第102页，此课件共127页哦（2）叠氮法 即载体活化生成叠氮化合物，再与酶分子上的相应基团偶联成固定化酶。含有羟基、羧基、羧甲基等基团的载体都可用此法活化。如CMC、CM-sephadex（交联葡聚糖）、聚天冬氨酸、乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物等都可用此法来固定化酶，其中使用最多的是羧甲基纤维素叠氮法。第103页，此课件共127页哦（3）溴化氰法 即用溴化氰将含有羟基的载体，如纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝

50、胶等，活化生成亚氨基碳酸酯衍生物，然后再与酶分子上的氨基偶联，制成固定化酶。任何具有连位羟基的高聚物都可用溴化氰法来活化。由于该法可在非常缓和的条件下与酶蛋白的氨基发生反应，近年来已成为普遍使用的固定化方法。尤其是溴化氰活化的琼脂糖已在实验室广泛用于固定化酶以及亲和层析的固定化吸附剂。第104页，此课件共127页哦（4）烷化法和芳基化法 以卤素为功能团的载体可与酶蛋白分子上的氨基、巯基、酚基等发生烷基化或芳基化反应而使酶固定化。此法常用的载体有卤乙酰、三嗪基或卤异丁烯基的衍生物。第105页，此课件共127页哦从上面介绍的四种制备方法可看出，用共价键结合法制备的固定化酶，酶和载体之间都是通过化学