动物细胞培养生物反应器及专用微载体优秀讲稿.ppt

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1、动物细胞培养生物反应器及专用微载体第一页，讲稿共七十七页哦动物细胞培养生物反应器及专用微载体广州大学生命科学学院 柯德森第二页，讲稿共七十七页哦为什么要进行动物细胞培养?动物细胞的特点、培养条件及存在问题动物细胞培养方式动物细胞培养的操作方式动物细胞培养生物反应器动物细胞反应器的控制动物细胞培养专用微载体内容提要内容提要第三页，讲稿共七十七页哦动物细胞培养 细胞培养是指离体细胞在无菌条件下分裂、生长，在整个培养过程中不出现分化，不再形成组织。第四页，讲稿共七十七页哦动物细胞培养的意义动物细胞培养对生产生物工程产品,特别是功能蛋白质方面具有明显的优势:1)同源性:直接进行翻译后加工,蛋白质可直接

2、折叠成正确的构象翻译后修饰糖基化，与天然产品一致。2)有利于产品的分离纯化:分泌胞外、纯化方便第五页，讲稿共七十七页哦动物细胞培养的意义医药卫生领域生物工程生物制药领域第六页，讲稿共七十七页哦羊水细胞培养羊水细胞培养 羊水细胞培养是培养羊水内脱落的胎儿细胞，做成染色体核型分析，用于诊断胎儿染色体病及胎儿畸形，是一种科学的、结果可靠的、安全的产前诊断法。第七页，讲稿共七十七页哦常用于生物工程及制药行业的动常用于生物工程及制药行业的动物细胞体系物细胞体系 W1-38W1-38W1-38W1-38：正常胚肺组织人二倍体正常胚肺组织人二倍体正常胚肺组织人二倍体正常胚肺组织人二倍体 细胞系。细胞系。细胞

3、系。细胞系。核型为核型为核型为核型为2n=462n=46。成纤维细胞，。成纤维细胞，。成纤维细胞，。成纤维细胞，能产生胶原，培养基用能产生胶原，培养基用能产生胶原，培养基用能产生胶原，培养基用BME BME （Eagle Basal mediumEagle Basal medium）。）。）。）。第八页，讲稿共七十七页哦10%小牛血清，小牛血清，pH7.2,同工酶为同工酶为G6PD B型。型。倍增时间为倍增时间为24h，有限寿命有限寿命50代。代。安全，安全，用于制备疫苗。用于制备疫苗。第九页，讲稿共七十七页哦 MRC-5MRC-5MRC-5MRC-5：从正常男性肺组织从正常男性肺组织从正常男

4、性肺组织从正常男性肺组织 中获得的人二倍体细胞系。中获得的人二倍体细胞系。中获得的人二倍体细胞系。中获得的人二倍体细胞系。核型为核型为核型为核型为2n=462n=46。属成纤维细胞。属成纤维细胞。属成纤维细胞。属成纤维细胞。培养基用加小牛血清。培养基用加小牛血清。培养基用加小牛血清。培养基用加小牛血清。同工酶同工酶同工酶同工酶G6PD BG6PD B型。型。型。型。第十页，讲稿共七十七页哦 有限寿命有限寿命4246代。增殖代。增殖 速度较速度较W1-38快，对不良快，对不良 环境敏感性较环境敏感性较W1-38低。低。对人的病毒敏感。对人的病毒敏感。用于生产疫苗。用于生产疫苗。第十一页，讲稿共七

5、十七页哦 BHK-21:BHK-21:BHK-21:BHK-21:从从从从5 5 5 5只无性别的生长只无性别的生长只无性别的生长只无性别的生长1 1 1 1天的地鼠幼天的地鼠幼天的地鼠幼天的地鼠幼鼠肾脏中分离的鼠肾脏中分离的鼠肾脏中分离的鼠肾脏中分离的;成纤维样细胞成纤维样细胞成纤维样细胞成纤维样细胞,核型为核型为核型为核型为2n=44;2n=44;2n=44;2n=44;培养基为培养基为培养基为培养基为DMEMDMEMDMEMDMEM加加加加7%7%7%7%胎牛血清。胎牛血清。胎牛血清。胎牛血清。用用用用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病于增殖病毒，包括多

6、瘤病毒、口蹄疫病于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，现已用于毒、狂犬病毒等并制作疫苗，现已用于毒、狂犬病毒等并制作疫苗，现已用于毒、狂犬病毒等并制作疫苗，现已用于工程细胞构建。工程细胞构建。工程细胞构建。工程细胞构建。第十二页，讲稿共七十七页哦 VeroVeroVeroVero：从正常成年非洲绿猴从正常成年非洲绿猴从正常成年非洲绿猴从正常成年非洲绿猴 肾脏分离的。肾脏分离的。肾脏分离的。肾脏分离的。为贴壁依赖的成纤维细胞，为贴壁依赖的成纤维细胞，为贴壁依赖的成纤维细胞，为贴壁依赖的成纤维细胞，核型核型核型核型2n=602n=602n=602n=60；第十三页，讲稿共七十

7、七页哦 培养基为培养基为199199培养基，培养基，加加5%5%胎牛血清；胎牛血清；用于增殖病毒，用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰质炎、包括多瘤病毒、脊髓灰质炎、狂犬病毒。狂犬病毒。第十四页，讲稿共七十七页哦 NamalwaNamalwaNamalwaNamalwa：从肯尼亚患有淋巴瘤病从肯尼亚患有淋巴瘤病从肯尼亚患有淋巴瘤病从肯尼亚患有淋巴瘤病 人获取，建成的人的类淋巴母细胞。人获取，建成的人的类淋巴母细胞。人获取，建成的人的类淋巴母细胞。人获取，建成的人的类淋巴母细胞。2.8%2.8%2.8%2.8%的高倍体率，的高倍体率，的高倍体率，的高倍体率，1212121214141414条标记染

8、条标记染条标记染条标记染 色体。单条色体。单条色体。单条色体。单条X X X X，无，无，无，无Y Y Y Y。培养基为。培养基为。培养基为。培养基为RPMI 1640RPMI 1640RPMI 1640RPMI 1640，添加，添加，添加，添加7%7%7%7%胎牛血清。胎牛血清。胎牛血清。胎牛血清。用于生产用于生产用于生产用于生产 干扰素。干扰素。干扰素。干扰素。第十五页，讲稿共七十七页哦 SP2/0-Ag14SP2/0-Ag14SP2/0-Ag14SP2/0-Ag14：通过融合的方法，通过融合的方法，通过融合的方法，通过融合的方法，从有羊抗红细胞活性的从有羊抗红细胞活性的从有羊抗红细胞活性

9、的从有羊抗红细胞活性的BALB/cBALB/cBALB/cBALB/c 小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系 P3X63Ag8P3X63Ag8P3X63Ag8P3X63Ag8融合杂交瘤融合杂交瘤融合杂交瘤融合杂交瘤SP2/NL-Ag SP2/NL-Ag SP2/NL-Ag SP2/NL-Ag 亚克隆中分离获得，亚克隆中分离获得，亚克隆中分离获得，亚克隆中分离获得，第十六页，讲稿共七十七页哦 能耐受能耐受8 8氮鸟嘌呤氮鸟嘌呤 20g/ml20g/ml但但 在含在含HAT HAT 选择培养基中不能存活。选择培养基中不能存活。通常

10、用培养基为通常用培养基为DMEMDMEM，添加，添加10%10%胎胎 牛血清。牛血清。用于生产单抗杂交瘤细胞用于生产单抗杂交瘤细胞 和抗体。和抗体。第十七页，讲稿共七十七页哦 Sf-9 Sf-9 Sf-9 Sf-9 1983198319831983年从亲代年从亲代年从亲代年从亲代IPLBIPLBIPLBIPLBSF21AESF21AESF21AESF21AE 中克隆形成。亲代细胞从秋粘虫的中克隆形成。亲代细胞从秋粘虫的中克隆形成。亲代细胞从秋粘虫的中克隆形成。亲代细胞从秋粘虫的 蛹卵组织中分离获得。它对苜宿尺蛹卵组织中分离获得。它对苜宿尺蛹卵组织中分离获得。它对苜宿尺蛹卵组织中分离获得。它对苜

11、宿尺 蠖核型多角体病毒和其它杆状病毒蠖核型多角体病毒和其它杆状病毒蠖核型多角体病毒和其它杆状病毒蠖核型多角体病毒和其它杆状病毒 高度敏感。高度敏感。高度敏感。高度敏感。第十八页，讲稿共七十七页哦通常用的培养基为通常用的培养基为GraceGrace培养基，培养基，添加添加3.3g/L 3.3g/L 水解乳蛋白和水解乳蛋白和3.3g/L3.3g/L酵母浸液酵母浸液,10%,10%胎牛血清。胎牛血清。用于高用于高效表达外来蛋白制品。效表达外来蛋白制品。第十九页，讲稿共七十七页哦动物细胞的生理特点1.动物细胞有两种类型:1）非贴壁依赖性细胞(血液、淋巴组织、肿瘤组织）2）贴壁依赖性细胞（大多数动物细胞

12、，包括非淋巴组织的细胞和许多异倍体细胞）培养方法1、贴壁培养2、悬浮培养3、固定化培养第二十页，讲稿共七十七页哦贴壁培养:贴壁依赖性细胞在培养中要贴附于壁上才能迅速铺展,开始有丝分裂并迅速进入对数生长期,这种培养方式就叫贴壁培养.多数动物细胞的培养都采取这种方式.第二十一页，讲稿共七十七页哦2.动物细胞对周围环境十分动物细胞对周围环境十分 敏感敏感:对理化因素敏感，如：对理化因素敏感，如：渗透压、渗透压、pH、离子浓度、剪切、离子浓度、剪切 力、微量元素等。力、微量元素等。第二十二页，讲稿共七十七页哦3.动物细胞对培养基要求高动物细胞对培养基要求高:必需氨基酸、维生素、无机盐、必需氨基酸、维生

13、素、无机盐、微量元素、葡萄糖、细胞生微量元素、葡萄糖、细胞生 长因子、贴壁因子等。长因子、贴壁因子等。第二十三页，讲稿共七十七页哦1、培养基组成：血清是目前细胞培养基中不可缺少的成分，向细胞提供生长所需要的激素、转移蛋白和其他营养成分，已成为细胞培养达到最优化和降低成本的主要障碍。降低血清用量和采用无细胞培养基是目前研究的热点。六大限制细胞生长的因素：六大限制细胞生长的因素：第二十四页，讲稿共七十七页哦血清培养基的主要缺点及其原因：血清中含有细胞生长必须的微量组分，但这些组分的成分及其作用至今未清楚，因此无法取代；血清的存在是产物纯化的主要障碍；血清是病毒污染及其他未知因素影响的主要来源，增加

14、了细胞培养产品潜在的使用危险；血清是培养基成本的主要部分；血清同时也有生长抑制的作用；血清使用使实验和生产过程标准化变得困难。第二十五页，讲稿共七十七页哦2、限制细胞生长的因素：动物细胞培养系统能达到的细胞密度较低的主要原因是培养条件和最优化控制的困难，包括：细胞代谢产物的毒害：乳酸、氨等；营养物的耗竭可利用的表面积的限制；接种的细胞最小密度；解决问题的方法是通过过程调控来实现：灌注系统、换液、流加等，其中灌注是最好的方法。同时采用合理的培养系统以增加表面积并提供最佳的物理化学环境。细胞凋亡细胞凋亡第二十六页，讲稿共七十七页哦3、污染的控制：污染来源包括细胞种子、血清、试剂、实验环境和操作人员

15、。污染控制起始于细胞种子及其保存；除菌方法的改进是关键-血清？可高温灭菌的培养基的研究；设备的合理设计及操作人员的培训必不可少。第二十七页，讲稿共七十七页哦4、产物表达的控制：问题：细胞生长的最优化条件并不一定是表达的产物的最优化条件？问题的解决在于上游分子生物学的研究第二十八页，讲稿共七十七页哦5、硬件和过程设计参数：硬件设计中的主要问题：细胞培养条件的控制（温度、溶解氧、二氧化碳、pH、渗透压），其中充分的氧传递是所有生物反应器中的共同问题；而其他条件对动物细胞来说可以接受的范围都比较窄。污染的排除；遏制潜在生物毒害物的扩散；足够表面积的提供；培养过程中剪切力的控制（搅拌、通气、收获）第二

16、十九页，讲稿共七十七页哦6、产物收获目前细胞培养产物的收率很低，不及总蛋白的1%，主要原因在于：血清蛋白质的污染；细胞表达产物浓度低；产物在培养条件下不稳定；解决方法：使用无血清培养基；开发在无血清培养基中稳定蛋白质产物的方法；开发筛选技术以得到产量高的细胞克隆；开发产物分离技术：亲和柱、中空纤维、微囊等第三十页，讲稿共七十七页哦动物细胞培养的方式1、贴壁培养2、悬浮培养3、固定化培养第三十一页，讲稿共七十七页哦一.贴壁培养概念:贴壁依赖性细胞在培养中要贴附于壁上才能迅速铺展,开始有丝分裂并迅速进入对数生长期,这种培养方式就叫贴壁培养.多数动物细胞的培养都采取这种方式.第三十二页，讲稿共七十七

17、页哦1.单层静置贴壁培养第三十三页，讲稿共七十七页哦2.多层固定培养法玻璃圆柱钛碟装置第三十四页，讲稿共七十七页哦3.微载体培养微载体培养优点优点:表面积/体积比大;微载体悬浮于培养基中,细胞生长环境均一,便于监测和控制;培养基利用率高;采样重演性好;收获过程不复杂;放大较容易;劳动强度小,占用空间小.第三十五页，讲稿共七十七页哦第三十六页，讲稿共七十七页哦第三十七页，讲稿共七十七页哦第三十八页，讲稿共七十七页哦第三十九页，讲稿共七十七页哦4.中空纤维培养法中空纤维培养法:模拟脉管在细胞间分布扩散的原理,采用合成的中空纤维制成类似脉管的分布扩散系统.细胞接种于中空纤维外表面与反应器内表面之间,

18、培养液自入口进入储罐,进行再生处理,循环使用.第四十页，讲稿共七十七页哦第四十一页，讲稿共七十七页哦6.玻璃珠床反应器玻璃珠床反应器第四十二页，讲稿共七十七页哦第四十三页，讲稿共七十七页哦二.悬浮培养概念:是指细胞在培养器中自由悬浮生长的过程.主要用于非贴壁依赖性细胞培养,如杂交瘤细胞等.是在微生物发酵的基础上发展起来的;可以借鉴微生物发酵的经验;由于动物细胞比较脆弱,所以在搅拌通气等方式上必须比微生物培养更加温和.第四十四页，讲稿共七十七页哦第四十五页，讲稿共七十七页哦第四十六页，讲稿共七十七页哦三.固定化培养概念:利用吸附或包埋等固定化的方式将细胞限制在一定的空间内,然后以固定化的颗粒进行

19、悬浮培养.该方法对贴壁性和非贴壁依赖性细胞都是适合的.常用的包埋培养方法:对非贴壁依赖性细胞常用海藻酸钙包埋;对贴壁依赖性细胞常用胶原包埋.第四十七页，讲稿共七十七页哦动物细胞培养的操作方式分为5种:分批式、流加式、半连续式、连续式、灌注式第四十八页，讲稿共七十七页哦一、分批式操作：概念：是将细胞和培养液一次性装入反应器内，进行培养，细胞不断生长，产物也不断形成，经过一段时间后，将整个反应系取出。培养过程：滞后期、对数生长期、减速期、稳定期、衰退期优点：操作简便，容易掌握，是最常用的方式；缺点：不能使细胞自始至终处于最优条件下。第四十九页，讲稿共七十七页哦二、流加式操作：概念：先将一定量的培养

20、液装入反应器，在培养过程中随着细胞对营养物质的不断消耗，新的营养成分不断补充至反应器内，使细胞进一步代谢，到反应终止时取出整个反应系。特点：1）能够调节培养环境中的营养物质浓度；2）整个过程中反应体积是变化的。第五十页，讲稿共七十七页哦存在二种流加方式：无反馈控制流加：反馈控制流加：最常见的流加物质：葡萄糖、谷氨酰胺等能源和碳源第五十一页，讲稿共七十七页哦三、半连续式操作（反复分批式、换液培养）：概念：在分批培养操作的基础上，不全部取出反应系，剩余部分重新补充新的营养成分，再按分批式操作方式进行培养，反应器内培养液的总体积保持不变。优点：可反复收获培养液，对培养基因工程动物细胞分泌有用产物或病

21、毒培养过程比较实用。第五十二页，讲稿共七十七页哦四、连续操作：概念：在培养过程中一方面新鲜培养液不断加入反应器内，另一方面又将反应液连续不断地取出，使反应条件处于一种恒定状态。优点：维持细胞一直处于优化状态下，促进细胞生长和产物的形成；对细胞生理和代谢规律的研究是一种重要的手段。第五十三页，讲稿共七十七页哦第五十四页，讲稿共七十七页哦五、灌注式操作培养：概念：细胞培养过程中一方面不断加入新鲜培养基，另一方面又将反应液连续不断地取出，但细胞留在反应器内，使细胞处于一种不断的营养状态。优点：可以把培养过程保持在稳定的、废代谢物低于抑制水平下的状态。第五十五页，讲稿共七十七页哦第五十六页，讲稿共七十

22、七页哦第四节 动物细胞培养生物反应器生物反应器设计必须满足的条件：生物因素；化学因素；传质因素；传热因素；安全因素；操作因素；反应器类型；操作方式；控制方式；搅拌方式归结到第五十七页，讲稿共七十七页哦一、生物反应器的种类：悬浮培养用反应器空气提升式；搅拌槽；中空纤维管；陶质矩形通道蜂窝状生物反应器贴壁培养用搅拌槽（微载体系统）中空纤维管陶质矩形通道蜂窝状生物反应器包埋培养用流化床固定床第五十八页，讲稿共七十七页哦气升式细胞培养生物反应器：优点：产物的湍流温和而均匀，剪切力相当小，对细胞损伤小，氧传递速率高；液体循环量大，细胞和营养分布均匀。一般产生泡沫不多。第五十九页，讲稿共七十七页哦中空纤维

23、管生物反应器：特点：纤维一般是横放的；优点：用途广，可用于悬浮培养和贴壁依赖性细胞培养，细胞密度高，培养基和细胞分布均匀，能长期运转第六十页，讲稿共七十七页哦通气搅拌生物反应器无泡搅拌反应器第六十一页，讲稿共七十七页哦第六十二页，讲稿共七十七页哦第六十三页，讲稿共七十七页哦动物细胞反应器的控制溶氧控制：针对动物培养的合适搅拌，加入 少量溶氧量大的不相溶溶济，改变通入气体的氮氧比；pH控制：采用通入CO2/NaOH缓冲液系统来控制，可避免局部的极端pH出现；温度和搅拌转速的控制比较简单第六十四页，讲稿共七十七页哦采用微载体培养贴壁依赖性细胞是当前最有发展前途的一种培养模式微载体:指直径在6025

24、0m、能够适用于贴壁细胞生长的微珠。应用微载体于细胞培养的优点：表面积/体积（S/V）大；采用均匀悬浮培养，将悬浮培养和贴壁培养的优点融合，简化了环境因素的检测和控制；培养基利用率高；收获细胞过程不复杂；放大容易；劳动强度小；培养系统占用空间小第六十五页，讲稿共七十七页哦动物细胞贴壁的可能性取决于：细胞与微载体接触的机率；细胞与微载体的相融性；微载体表面的物理化学物性，主要是与电荷极性的电荷密度，以及培养基或微载体上吸附的媒介有关；与细胞生长环境有关，合适的生长环境有利于吸附。第六十六页，讲稿共七十七页哦优良的微载体应具有的特性不含能毒害细胞的成分；微载体须与细胞有良好的相容性；第六十七页，讲

25、稿共七十七页哦优良的微载体应具有的特性密度应略大于培养基；粒径在40120m范围，生理盐水溶胀后增大到60250 m，粒度分布均匀，径差不大于2025 m；第六十八页，讲稿共七十七页哦优良的微载体应具有的特性良好的光学透明性；能在PBS中耐120125C、2030min高温灭菌；第六十九页，讲稿共七十七页哦优良的微载体应具有的特性应是非刚性材料；不吸收培养中的营养成分；第七十页，讲稿共七十七页哦优良的微载体应具有的特性收获细胞或细胞制品容易，不影响蛋白质分离纯化；价廉，能重复使用。第七十一页，讲稿共七十七页哦微载体主要类型一、交联葡萄糖为基质的微载体：DEAE-交联葡聚糖：Cytodex1微载

26、体Cytodex 2微载体：Cytodex 3微载体：（最优良的微载体）第七十二页，讲稿共七十七页哦二、纤维素为基质的微载体：三、蛋白质为基质的微载体-变性胶原微载体：四、高分子合成材料为基质的微载体：聚苯乙烯微载体：带负电荷，透明，适应细胞型广泛，不摄取培养基中的营养成分，能制备高纯度的生物制品，可重复使用。缺点是带负电荷，细胞贴壁速度慢；材质刚性易损伤细胞；需较高转速才能悬浮。第七十三页，讲稿共七十七页哦苯乙烯-二乙烯苯共聚微载体：聚甲基丙烯酸羟乙基酯微载体：聚乙烯吡啶微载体：聚瑞烯酰胺微载体：硅橡胶微载体：第七十四页，讲稿共七十七页哦五、无机材料玻璃为基质的微载体：中空玻璃微载体：是一种

27、优良的微载体，但相对密度太大，需经过特殊工艺处理加工成合适密度的中空玻璃微珠；第七十五页，讲稿共七十七页哦明胶涂覆的多孔微载体：多孔玻璃用明胶涂覆后再用戊二醛交联，或采用偶联剂将明胶偶联在玻璃珠表层，所得的微载体。其优点为：适应于一切的细胞系；容易将细胞从微载体上剥脱下来；在搅拌情况下稳定性高；玻璃不吸附培养基中血清，可重复使用；价廉第七十六页，讲稿共七十七页哦六、液膜微载体：利用动物细胞能贴附于微液珠表面生长和扩展的原理，将氟碳化合物分散形成形成100500m的微液珠，在与动物细胞在乳化状态下搅拌混合时，动物细胞即贴附于微液珠表面生长和扩展，停止搅拌时，细胞游离地悬浮于二相之间，方便移出。此种方法可避免固体微载体的对血清的吸附作用及利用胰蛋白酶所带来的对细胞的损伤及分离的困难。第七十七页，讲稿共七十七页哦