预习放免方法设计课件.ppt

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1、预习放免方法设计预习放免方法设计 Page 1第1页，此课件共48页哦前前 言言原理原理第2页，此课件共48页哦前前 言言 放射免疫方法的建立原则放射免疫方法的建立原则 根据分析根据分析目的目的和和要求要求，通过对标记物、抗体、，通过对标记物、抗体、标准品（校准品）的合理匹配，以及对反应条件、标准品（校准品）的合理匹配，以及对反应条件、分离方法的选择，达到最满意的效果分离方法的选择，达到最满意的效果第3页，此课件共48页哦前前 言言 放射免疫设计的目标放射免疫设计的目标 根据要求使试剂的根据要求使试剂的剂量反应曲线剂量反应曲线在满足在满足灵灵敏度敏度的情况下，是多数样品得到较高的的情况下，是多

2、数样品得到较高的精密度精密度。第4页，此课件共48页哦目录目录灵敏度的设计灵敏度的设计反应条件的选择反应条件的选择反应方式的选择反应方式的选择分离方法的选择分离方法的选择方法学鉴定方法学鉴定第5页，此课件共48页哦灵敏度的设计灵敏度的设计第6页，此课件共48页哦灵敏度的设计灵敏度的设计放射免疫分析的灵敏度放射免疫分析的灵敏度 Sensitivity指能指能测测出的具有出的具有统计统计学意学意义义的最小的最小值值，通，通常指常指“0”标标准管准管结结合率减两个合率减两个标标准差的相准差的相应应剂剂量。量。第7页，此课件共48页哦灵敏度的设计灵敏度的设计放射免疫分析的灵敏度放射免疫分析的灵敏度 S

3、ensitivity若以能若以能测测出的具有一定精密度出的具有一定精密度的最小的最小值为值为灵敏度的定灵敏度的定义义，则则应应根据根据剂剂量反量反应应曲曲线线的精密度的精密度图图（PDP），以），以CV%-10%的最的最小小剂剂量量为为有效地可有效地可测测量的最小量的最小剂剂量，即灵敏度。量，即灵敏度。第8页，此课件共48页哦灵敏度的设计灵敏度的设计放射免疫分析的灵敏度放射免疫分析的灵敏度 Sensitivity影响因素影响因素-标记标记物的比活性物的比活性-抗体的抗体的亲亲和力和用量和力和用量-剂剂量反量反应应曲曲线浓线浓度范度范围围第9页，此课件共48页哦标记物的用量标记物的用量标记物的用

4、量标记物的用量 计数率计数率计数误差计数误差灵敏度灵敏度统计涨落统计涨落样品保持样品保持一定的计数率一定的计数率减少样品减少样品化学量化学量适当比活性、稳定的标记物适当比活性、稳定的标记物第10页，此课件共48页哦标记物的用量标记物的用量最佳标记抗原的选择方法最佳标记抗原的选择方法 用不同浓度的标记抗原作一系列的抗血清实验，用不同浓度的标记抗原作一系列的抗血清实验，直到标记物减少不再使曲线再右移，此时标记物浓直到标记物减少不再使曲线再右移，此时标记物浓度称度称“减弱浓度减弱浓度”，即为加入标记抗原化学量的最低浓，即为加入标记抗原化学量的最低浓度。度。第11页，此课件共48页哦抗血清的用量抗血清

5、的用量放射免疫分析抗血清的鉴定指标放射免疫分析抗血清的鉴定指标高亲和力高亲和力高滴度高滴度高特异性高特异性 选用亲和常数大，滴度高的抗血清第12页，此课件共48页哦抗血清的用量抗血清的用量确定抗血清用量的方法确定抗血清用量的方法第13页，此课件共48页哦抗血清的用量抗血清的用量确定抗血清用量的方法确定抗血清用量的方法-抗血清滴度曲线抗血清滴度曲线 B/T01020304050607080 结合率为结合率为30%-30%-50%50%的抗血清稀释的抗血清稀释度度 第14页，此课件共48页哦抗血清的用量抗血清的用量确定抗血清用量的方法确定抗血清用量的方法-做两条抗体稀释度曲线做两条抗体稀释度曲线

6、A.A.单纯标记抗原单纯标记抗原 B.B.标记抗原中加入微量非标记抗原标记抗原中加入微量非标记抗原 两条曲线分离度最大时抗体稀释度，即为最佳稀释度。两条曲线分离度最大时抗体稀释度，即为最佳稀释度。考虑了标记抗原与抗原免疫活性是否一致考虑了标记抗原与抗原免疫活性是否一致第15页，此课件共48页哦剂量反应曲线剂量反应曲线剂量反应曲线的浓度范围剂量反应曲线的浓度范围-可影响反应曲线的斜率可影响反应曲线的斜率-根据实验体系的要求以及稀释曲线确定根据实验体系的要求以及稀释曲线确定第16页，此课件共48页哦剂量反应曲线剂量反应曲线剂量反应曲线的浓度范围剂量反应曲线的浓度范围-可影响反应曲线的斜率可影响反应

7、曲线的斜率-根据实验体系的要求以及稀释曲线确定根据实验体系的要求以及稀释曲线确定-最低标准品的浓度应与标记物的用量接近，最低标准品的浓度应与标记物的用量接近，B/BB/B0 0=80-=80-90%90%-最大浓度剂量点的结合率为最大浓度剂量点的结合率为10-20%10-20%-待测物的正常浓度范围应在剂量反应曲线的直线部待测物的正常浓度范围应在剂量反应曲线的直线部分分第17页，此课件共48页哦剂量反应曲线剂量反应曲线剂量反应曲线的浓度范围剂量反应曲线的浓度范围第18页，此课件共48页哦剂量反应曲线剂量反应曲线剂剂量反量反应应曲曲线线的工作范的工作范围围-工作范工作范围围由由PDP图图确定确定

8、-工作范工作范围围与与剂剂量反量反应应曲曲线线的的浓浓度范度范围围是两个是两个不同不同的概念的概念第19页，此课件共48页哦剂量反应曲线剂量反应曲线剂剂量反量反应应曲曲线线的工作范的工作范围围-工作范工作范围围确定方法：确定方法：A.CV%10%的的剂剂量区段量区段为为有效工作范有效工作范围围第20页，此课件共48页哦剂量反应曲线剂量反应曲线剂剂量反量反应应曲曲线线的工作范的工作范围围-工作范工作范围围确定方法：确定方法：B.结结合率（合率（B/B0%）在）在20-80%之之间间的区段的区段为为工作范工作范围围 为剂量反应曲线接近直为剂量反应曲线接近直线的部分，待测物的正常范线的部分，待测物的

9、正常范围应在该区段以内。围应在该区段以内。第21页，此课件共48页哦反应试剂剂量关系反应试剂剂量关系第22页，此课件共48页哦反应试剂剂量关系反应试剂剂量关系一般规律一般规律灵敏度灵敏度增加增加工工作作范范围围减减小小第23页，此课件共48页哦反应试剂剂量关系反应试剂剂量关系一般规律一般规律灵敏度灵敏度下降下降工工作作范范围围较较大大第24页，此课件共48页哦反应试剂剂量关系反应试剂剂量关系比比较较抗原抗原浓浓度和抗体度和抗体浓浓度的最佳匹配度的最佳匹配-数学模型推倒数学模型推倒最适抗体最适抗体浓浓度度 q=3/K 最适最适标记标记抗原抗原浓浓度度 *Ag=4/K-经验经验确定（常用于确定（常

10、用于实际实际工作）工作）通通过过一定量的一定量的标记标记抗原作抗体滴度抗原作抗体滴度试验试验，确定抗血清稀，确定抗血清稀释释度度 通通过剂过剂量反量反应应曲曲线线的制作的制作进进行逐步行逐步调调整，最后达其最佳整，最后达其最佳相互关系相互关系第25页，此课件共48页哦标准品标准品标准配的制备标准配的制备-标准品介质系统应与待测样品一致或近似标准品介质系统应与待测样品一致或近似 如，待测为血清样本，最好用零值血清制备标准品如，待测为血清样本，最好用零值血清制备标准品-若用缓冲液制备标准品，应加入一定量的蛋白质（若用缓冲液制备标准品，应加入一定量的蛋白质（1-1-2%2%的的BSABSA）或明胶）

11、或明胶第26页，此课件共48页哦反应条件的选择反应条件的选择第27页，此课件共48页哦反应条件的选择反应条件的选择缓缓冲体系冲体系添加添加剂剂反反应应体体积积温育条件温育条件样样品品处处理理第28页，此课件共48页哦缓冲体系缓冲体系特异性特异性结结合反合反应应的的亲亲和常数受反和常数受反应应介介质质的的pH和和离子离子强强度度的影响的影响第29页，此课件共48页哦缓冲体系缓冲体系常常见见的的缓缓冲体系冲体系-磷酸磷酸盐缓盐缓冲液（冲液（PBS）-巴比妥巴比妥缓缓冲液冲液-乙酸乙酸盐缓盐缓冲液冲液-硼酸硼酸盐缓盐缓冲液冲液-Tris-HCl缓缓冲液冲液第30页，此课件共48页哦添加剂添加剂目的：

12、改善目的：改善试剂试剂的的稳稳定性定性/特殊需要特殊需要要求：要求：对对特异性特异性结结合无影响合无影响常常见见添加添加剂剂-EDTA-Na2-ANS-BSA/明胶明胶-抑抑肽肽酶酶-叠氮叠氮钠钠/硫柳汞硫柳汞第31页，此课件共48页哦反应体积反应体积抗原抗体反抗原抗体反应应反反应应物物浓浓度度-减小反减小反应应体体积积，利于提高反，利于提高反应浓应浓度，提高度，提高实验实验灵敏度灵敏度-体体积过积过小，易出小，易出现现加加样误样误差，形成放射性复合物的量亦减少，差，形成放射性复合物的量亦减少，测测量量误误差增加差增加常常规选规选用反用反应应体体积为积为：0.3ml-1.2ml第32页，此课件

13、共48页哦温育条件温育条件反反应应的平衡常数与温度相关的平衡常数与温度相关-严严格控制反格控制反应应温度，包括整个分析至离心温度，包括整个分析至离心过过程程-测测定指定指标标不同，其不同，其对对温度的依温度的依赖赖程度亦不同程度亦不同温度与反温度与反应应速度相关速度相关-提高反提高反应应温度，可加速反温度，可加速反应应，但，但亲亲和力下降和力下降-4抗体抗体亲亲和力最大，但反和力最大，但反应时间较长应时间较长目前多采用较短时间目前多采用较短时间37或室温孵育或室温孵育第33页，此课件共48页哦样品处理样品处理 样品中可能存在各种干扰物质，或影样品中可能存在各种干扰物质，或影响特异性反应的物质。

14、故许多分析系统需响特异性反应的物质。故许多分析系统需要对分析样品进行预处理，常用的预处理要对分析样品进行预处理，常用的预处理方法是方法是稀释稀释或或提取提取。第34页，此课件共48页哦反应方式的选择反应方式的选择第35页，此课件共48页哦反应方式反应方式平衡法平衡法顺序饱和法顺序饱和法即时法即时法第36页，此课件共48页哦反应方式反应方式平衡法平衡法AbAgAg*加入加入分离剂分离剂Ag*AbAg*方法学评价方法学评价 稳定、重复性好、剂量反应曲线具有竞稳定、重复性好、剂量反应曲线具有竞争性分析的典型特征，灵敏度相对较低争性分析的典型特征，灵敏度相对较低 第37页，此课件共48页哦反应方式反应

15、方式顺序饱和法顺序饱和法(非平衡竞争体系非平衡竞争体系)AbAg平平衡衡Ag*AbAg*AgAg*Ab终止终止反应反应方法学评价方法学评价 灵敏度较高，但因第二次孵育时间较短，要求标记抗原的灵敏度较高，但因第二次孵育时间较短，要求标记抗原的比活性较高，并且要求分离方法更为精细。比活性较高，并且要求分离方法更为精细。因存在两次温育，曲线偏离典型特征，且反应稳定性因存在两次温育，曲线偏离典型特征，且反应稳定性较差。较差。第38页，此课件共48页哦反应方式反应方式即时法即时法 在反应尚未达完全平衡时终止反应，并进行分离在反应尚未达完全平衡时终止反应，并进行分离测定。测定。要求：需严格控制反应时间。要

16、求：需严格控制反应时间。第39页，此课件共48页哦分离方法的选择分离方法的选择第40页，此课件共48页哦分离系统分离系统 分离系分离系统应统应依据依据实验实验要求要求选择选择。其。其对对放射免放射免疫分析的疫分析的结结果影响果影响较较大，分离不全或大，分离不全或错错分都可造分都可造成成剂剂量反量反应应曲曲线线异常。异常。不同分离方法不同分离方法NSB差异差异较较大，亦可影响反大，亦可影响反应应的灵敏度，因此，的灵敏度，因此，选择选择适宜的分离系适宜的分离系统统更是建立更是建立放射免疫系放射免疫系统统的重要步的重要步骤骤之一。之一。第41页，此课件共48页哦分离系统分离系统常用的分离体系常用的分

17、离体系125I3H双抗体双抗体-PEG/固相分离法固相分离法活性炭吸附法活性炭吸附法第42页，此课件共48页哦方法学鉴定方法学鉴定第43页，此课件共48页哦方法学鉴定方法学鉴定剂量反应曲线稳定性检查剂量反应曲线稳定性检查灵敏度检查灵敏度检查精密度检查精密度检查健全性检查健全性检查正常参考范围确定正常参考范围确定临床有效性检查临床有效性检查第44页，此课件共48页哦方法学鉴定方法学鉴定剂量反应曲线稳定性检查剂量反应曲线稳定性检查NSB/TB0/T截距截距/斜率斜率EDPDP图图第45页，此课件共48页哦方法学鉴定方法学鉴定剂量反应曲线稳定性检查剂量反应曲线稳定性检查灵敏度检查灵敏度检查精密度检查

18、精密度检查健全性检查健全性检查正常参考范围确定正常参考范围确定临床有效性检查临床有效性检查第46页，此课件共48页哦QC X SD 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 L3.310.253.203.523.563.113.282.503.03.403.523.0 M10.51.2511.710.611.511.110.39.6010.69.807.908.70 H30.82.7129.826.232.134.231.532.128.731.624.926.2样品 4.58.815.354.115.66.90.311.221.920.610.018.2下面是某实验室10批内部质量控制的测量结果,根据这些数据绘制质控图并说明哪些不精密整批实验结果应舍弃,根据是什么?第47页，此课件共48页哦第48页，此课件共48页哦