培养基成分与配制讲稿.ppt
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1、培养基成分与配制第一页,讲稿共四十一页哦l 实质上,对于整株植物生长有重要作用的这实质上,对于整株植物生长有重要作用的这1515种元素,种元素,对于组织培养来说也是必需的。各种常用培养基之间对于组织培养来说也是必需的。各种常用培养基之间在组分上的主要差别,即在于各种盐或离子数量上的在组分上的主要差别,即在于各种盐或离子数量上的不同。由质上来看,各种植物组织所需要的无机营养不同。由质上来看,各种植物组织所需要的无机营养是相当一致的。是相当一致的。l 当无机盐在水中溶解的时候,它们发生解离,形当无机盐在水中溶解的时候,它们发生解离,形成离子。培养基中的活性因子即是这些离子,而不是成离子。培养基中的
2、活性因子即是这些离子,而不是它们的化合物。一种类型的离子可由一种以上的盐提它们的化合物。一种类型的离子可由一种以上的盐提供。供。l 第二页,讲稿共四十一页哦l WhiteWhite培养基是最早的植物组织培养基之一,其中包含了所培养基是最早的植物组织培养基之一,其中包含了所有必需的营养成分,被广泛用于根的培养。不过,很多研究者的有必需的营养成分,被广泛用于根的培养。不过,很多研究者的经验表明,要想使愈伤组织能令人满意地生长,这个培养基中的经验表明,要想使愈伤组织能令人满意地生长,这个培养基中的无机成分在数量上是不足的。早期采用的克服这种缺陷的办法是无机成分在数量上是不足的。早期采用的克服这种缺陷
3、的办法是在培养基中加入某些复杂的混合物,如酵母浸出物、水解酪蛋白、在培养基中加入某些复杂的混合物,如酵母浸出物、水解酪蛋白、椰子汁和氨基酸等。为了改进合成培养基,后来的研究者通过增椰子汁和氨基酸等。为了改进合成培养基,后来的研究者通过增加各种无机盐的浓度,特别是钾和氮的浓度,成功地取代了那些加各种无机盐的浓度,特别是钾和氮的浓度,成功地取代了那些复杂的混合物。和复杂的混合物。和WhiteWhite培养基比较,在现在广泛应用的各种培培养基比较,在现在广泛应用的各种培养基中,多数都含有浓度较高的无机盐。养基中,多数都含有浓度较高的无机盐。HellerHeller(19531953)在其培)在其培养
4、基中加入了铝和镍,但这两种元素的必要性并未得到证明,因养基中加入了铝和镍,但这两种元素的必要性并未得到证明,因此已被后来的研究者所省略。钠、氯化物和碘化物的必要性迄今此已被后来的研究者所省略。钠、氯化物和碘化物的必要性迄今也还没有得到证明。也还没有得到证明。第三页,讲稿共四十一页哦l 在在WhiteWhite(19431943)原来的培养基中,铁是以)原来的培养基中,铁是以FeFe(SO(SO)的形式加的形式加入的,但入的,但StreetStreet及其合作者在根培养中以及其合作者在根培养中以FeCIFeCI代替了代替了FeFe(SO(SO),这是因为在,这是因为在FeFe(SO(SO)中含有
5、中含有MnMn和某些其他金属离子杂质。然而,和某些其他金属离子杂质。然而,FeCIFeCI看来也并不是一个完全令人满意的铁盐。以这种形式存在的铁只看来也并不是一个完全令人满意的铁盐。以这种形式存在的铁只有在有在PH5.2PH5.2左右时才能被组织所利用。已知在根培养中,接种后一周左右时才能被组织所利用。已知在根培养中,接种后一周之内培养基的之内培养基的PHPH值即会由原来的值即会由原来的4.94.95.05.0上升到上升到5 58 86.06.0,于是根,于是根开始表现缺铁症状。为了解决这个问题,现在在多数培养基中铁是以开始表现缺铁症状。为了解决这个问题,现在在多数培养基中铁是以一种螫合形式,
6、即一种螫合形式,即 FeFe EDTA EDTA(EDTAEDTA乙二胺四乙酸)的形式提供的。乙二胺四乙酸)的形式提供的。以这种形式提供的铁直到以这种形式提供的铁直到PH7.6PH7.68.08.0仍然可以被植物组织所利用。仍然可以被植物组织所利用。附带说一下,与根不同,愈伤组织培养物直到附带说一下,与根不同,愈伤组织培养物直到PHPH为为6.06.0时仍可利时仍可利用用FeCIFeCI ,这是因为愈伤组织能分泌自然的鳌合剂,而螫合剂可,这是因为愈伤组织能分泌自然的鳌合剂,而螫合剂可与铁相结合。与铁相结合。Fe EDTAFe EDTA可使用可使用FeSOFeSO7H7H2 2O O对和对和Na
7、Na2 2EDTAEDTA进行制备,或者,进行制备,或者,如果可能的话,从市场上直接购买如果可能的话,从市场上直接购买NaFeNaFeEDTAEDTA。l 第四页,讲稿共四十一页哦l 在培养基中无机氮的供应可以有两种形式,在培养基中无机氮的供应可以有两种形式,一种是硝酸盐;另一种是铵盐。当做为唯一的氮一种是硝酸盐;另一种是铵盐。当做为唯一的氮源时,硝酸盐的作用要比铵盐好得多,但在单独源时,硝酸盐的作用要比铵盐好得多,但在单独使用硝酸盐时,培养基的使用硝酸盐时,培养基的PHPH会向碱性方向漂移。会向碱性方向漂移。若与硝酸盐一起加入少量铵盐,则会阻止这种漂若与硝酸盐一起加入少量铵盐,则会阻止这种漂
8、移。因此,有好几种培养基都既含有硝酸盐,也移。因此,有好几种培养基都既含有硝酸盐,也含有铵盐。含有铵盐。l 第五页,讲稿共四十一页哦l 当某些营养元素的供应不足时,愈伤组织所表现出当某些营养元素的供应不足时,愈伤组织所表现出来的症状如下:来的症状如下:l 氮氮某些组织(五叶地锦)表现出一种很引人注某些组织(五叶地锦)表现出一种很引人注目的花色素苷的颜色;不能形成导管;目的花色素苷的颜色;不能形成导管;l 氮、钾或磷氮、钾或磷细胞过度生长,形成层组织减退;细胞过度生长,形成层组织减退;l 硫硫非常明显地褪绿;非常明显地褪绿;l 铁铁细胞分裂停止;细胞分裂停止;l 硼硼细胞分裂停滞,细胞伸长;细胞
9、分裂停滞,细胞伸长;l 锰或钼锰或钼影响细胞伸长。影响细胞伸长。第六页,讲稿共四十一页哦l2.2.有机营养成分有机营养成分l(1)(1)含氮物质含氮物质l 大多数培养的细胞都能合成所有必需的维生素,只大多数培养的细胞都能合成所有必需的维生素,只是数量上显然不足。为了能使组织很好地生长,在培养是数量上显然不足。为了能使组织很好地生长,在培养基中常常必须补加一种或一种以上的维生素和氨基酸。基中常常必须补加一种或一种以上的维生素和氨基酸。其中硫胺素(维生素其中硫胺素(维生素B B)一般认为是一种必需的成分。)一般认为是一种必需的成分。在其他各种维生素中,已知尤其是吡哆醇(维生素在其他各种维生素中,已
10、知尤其是吡哆醇(维生素B6B6),),烟酸(维生素烟酸(维生素B B),泛酸钙(维生素),泛酸钙(维生素B B)和肌醇也都)和肌醇也都能改善培养的植物组织的生长状况。各种维生素皆溶于能改善培养的植物组织的生长状况。各种维生素皆溶于水,唯叶酸例外,先要用少量稀氨水溶解,然后加蒸馏水,唯叶酸例外,先要用少量稀氨水溶解,然后加蒸馏水定容水定容。l 第七页,讲稿共四十一页哦l 为了促进某些愈伤组织和器官的生长,还常为了促进某些愈伤组织和器官的生长,还常使用很多种化学成分不明的复杂的营养混合物,使用很多种化学成分不明的复杂的营养混合物,如如水解酪蛋白(水解酪蛋白(CHCH),椰子汁(),椰子汁(CMCM
11、),玉米胚乳,),玉米胚乳,麦芽浸出物(麦芽浸出物(MEME),番茄汁(),番茄汁(TJTJ)和酵母浸出物)和酵母浸出物(YEYE)等。不过,只要可能,应尽量避免使用这等。不过,只要可能,应尽量避免使用这些天然物质。这些物质(特别是果实提取物)在些天然物质。这些物质(特别是果实提取物)在样品间的差异将会影响实验结果的可重复性。这样品间的差异将会影响实验结果的可重复性。这是因为,这类提取物所含的生长促进成分的质和是因为,这类提取物所含的生长促进成分的质和量常因组织的年龄和供体植株的品种而变化。此量常因组织的年龄和供体植株的品种而变化。此外,只用一种氨基酸也可能有效地取代这些天然外,只用一种氨基酸
12、也可能有效地取代这些天然物质。物质。第八页,讲稿共四十一页哦l(2)(2)碳源碳源l Haberlandt(1902)曾试图培养绿色的叶肉细胞,这可能是出自绿色细胞对营养的要求比较简单的想法,但这种想法在实验中并未得到证实。现在我们知道,作为一个规律,起初是绿色的组织在培养中会逐渐失去它们的叶绿素,而只依赖于外界碳源生活。即使是那些在培养期间由于某些突然变化或被置于特殊条件之下而获得了色素的组织,也不是碳素自养的。如果在培养基中加入一种合适的碳源,就是在培养中已经充分分化了的绿色幼茎也会生长得更好。由此看来,在培养基中加入一种可被利用的碳源是十分必要的。l 第九页,讲稿共四十一页哦l 最常用的
13、碳源是蔗糖,浓度一般为最常用的碳源是蔗糖,浓度一般为2 25 5。已知葡萄糖和果。已知葡萄糖和果糖也能使某些组织生长得很好,糖也能使某些组织生长得很好,BallBall(19531953,19551955)证实,对)证实,对于红杉属植物(于红杉属植物(SequoiaSequoia)愈伤组织的生长来说,经过高压灭)愈伤组织的生长来说,经过高压灭菌的蔗糖优于过滤灭菌的蔗糖,看来高压灭菌能使蔗糖水解菌的蔗糖优于过滤灭菌的蔗糖,看来高压灭菌能使蔗糖水解成为更能被有效利用的糖,如果糖。成为更能被有效利用的糖,如果糖。l 一般来说,以蔗糖做碳源时,离体的双子叶植物的根生一般来说,以蔗糖做碳源时,离体的双子
14、叶植物的根生长得最好。而以右旋糖(葡萄糖)做碳源时,单子叶植物的长得最好。而以右旋糖(葡萄糖)做碳源时,单子叶植物的根生长得最好。矮生苹果(根生长得最好。矮生苹果(Mains pumilaMains pumila,品种,品种MclntoshMclntosh)的)的组织培养物在以山梨醇做碳源和以蔗糖或葡萄糖做碳源时都长得很组织培养物在以山梨醇做碳源和以蔗糖或葡萄糖做碳源时都长得很好。好。l 已知植物能够利用的某些其他形式的碳源有麦芽糖、半乳糖、已知植物能够利用的某些其他形式的碳源有麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖。红杉属植物和玉米胚乳的组织培养物甚至可以代谢甘露糖和乳糖。红杉属植物和玉米胚乳的组织培
15、养物甚至可以代谢作为唯一碳源的淀粉。作为唯一碳源的淀粉。第十页,讲稿共四十一页哦l3.3.植物生长物质植物生长物质l 除了营养物质以外,为了促进组织和器除了营养物质以外,为了促进组织和器官的生长,通常还有必要在培养基中加入一官的生长,通常还有必要在培养基中加入一种或一种以上的生长调节物质。如生长素、种或一种以上的生长调节物质。如生长素、细胞分裂素或赤霉素。细胞分裂素或赤霉素。第十一页,讲稿共四十一页哦l(1)(1)生长素生长素l 在自然界中,生长素影响到茎和节间的伸长、向性、在自然界中,生长素影响到茎和节间的伸长、向性、顶端优势、叶片脱落和生根等现象。在组织培养中,生顶端优势、叶片脱落和生根等
16、现象。在组织培养中,生长素被用于诱导细胞的分裂和根的分化。在组织培养中长素被用于诱导细胞的分裂和根的分化。在组织培养中常用的生长素有:常用的生长素有:IAAIAA、IBAIBA、NAA.NAA.、NOANOA(萘氧乙酸)、(萘氧乙酸)、P PCPACPA(对氯苯氧乙酸)、(对氯苯氧乙酸)、2,4-D2,4-D(二氯苯氧乙酸)和(二氯苯氧乙酸)和2,4,52,4,5T T(三氯苯氧乙酸)。其中(三氯苯氧乙酸)。其中IBAIBA和和NAANAA广泛用于广泛用于生根,并能与细胞分裂素互作促进茎的增殖。生根,并能与细胞分裂素互作促进茎的增殖。2,4-D2,4-D和和2,42,4,5 5T T对于愈伤组
17、织的诱导和生长非常有效。生长对于愈伤组织的诱导和生长非常有效。生长素一般溶于素一般溶于9595酒精或酒精或0.lmol0.lmolL L的的aOHaOH中,以后中,以后者的溶解效果更好。者的溶解效果更好。第十二页,讲稿共四十一页哦l生长素活性:2,4-DNAAIAA2,4-D的活性经IAA高8-12倍,2,4-D在植物体内比较稳定,而IAA极不稳定。第十三页,讲稿共四十一页哦l(2)(2)细胞分裂素细胞分裂素l 细胞分裂素影响细胞分裂、顶端优势的变化细胞分裂素影响细胞分裂、顶端优势的变化和茎的分化等。在培养基中加入细胞分裂素的目和茎的分化等。在培养基中加入细胞分裂素的目的,主要是为促进细胞分裂
18、和由愈伤组织或器官的,主要是为促进细胞分裂和由愈伤组织或器官上分化不定芽。由于这类化合物有助于使腋芽由上分化不定芽。由于这类化合物有助于使腋芽由顶端优势的抑制下解放出来,因此也可用于茎的顶端优势的抑制下解放出来,因此也可用于茎的增殖。比较常用的细胞分裂素有:增殖。比较常用的细胞分裂素有:BAPBAP(苄氨基瞟(苄氨基瞟呤),呤),6 6BABA(苄基腺瞟呤),(苄基腺瞟呤),2 2iPiP(异戊烯氨基(异戊烯氨基膘呤)和膘呤)和(KT)(KT)激动素(呋喃氨基嘌呤)。细胞分裂激动素(呋喃氨基嘌呤)。细胞分裂素一般溶于素一般溶于0.50.5或或lmollmolL L的的HCIHCI或稀的或稀的N
19、aOHNaOH中。中。第十四页,讲稿共四十一页哦l细胞分裂素的活性:ZTBAKT腺嘌呤.ZT的活性比KT高10倍,KT的活性比腺嘌呤3万倍.第十五页,讲稿共四十一页哦(3)(3)赤霉素赤霉素 赤霉素有赤霉素有2020多种,其中在组织培养中所用的多种,其中在组织培养中所用的是是GAGA。与生长素和细胞分裂素相比,赤霉素。与生长素和细胞分裂素相比,赤霉素不常使用。据报道,赤霉素能刺激在培养中形不常使用。据报道,赤霉素能刺激在培养中形成的不定胚正常发育成小植株。赤霉素易溶于成的不定胚正常发育成小植株。赤霉素易溶于冷水,每升水最多可溶解冷水,每升水最多可溶解1 1mgmg。GAGA溶于溶于水后不稳定,
20、容易分解,故最好以水后不稳定,容易分解,故最好以9595酒精配酒精配成母液在冰箱中保存。成母液在冰箱中保存。l 第十六页,讲稿共四十一页哦l4.4.琼脂琼脂l如果使用液体培养基进行静止培养,组织将会沉没并因如果使用液体培养基进行静止培养,组织将会沉没并因缺氧而死亡。为了避免这种情况,可用琼脂使培养基凝胶化,缺氧而死亡。为了避免这种情况,可用琼脂使培养基凝胶化,然后把组织置于培养基表面。琼脂是一种由海藻得来的多糖然后把组织置于培养基表面。琼脂是一种由海藻得来的多糖类物质,一般的使用浓度是类物质,一般的使用浓度是0.70.71 1,若浓度太高,培养基就,若浓度太高,培养基就会变得很硬,营养物质就难
21、于扩散到培养的组织中去。由于在这种半会变得很硬,营养物质就难于扩散到培养的组织中去。由于在这种半固体培养基上所建立的培养物便于保存,而且对于多种目的的实验来固体培养基上所建立的培养物便于保存,而且对于多种目的的实验来说都能得到令人满意的结果,因此琼脂固化培养基得到了广泛的应用。说都能得到令人满意的结果,因此琼脂固化培养基得到了广泛的应用。但琼脂并非是培养基中的一种必需成分。但琼脂并非是培养基中的一种必需成分。l 单细胞和细胞聚合体可以在含有无机和有机营养以及激素的液体单细胞和细胞聚合体可以在含有无机和有机营养以及激素的液体培养基中进行悬浮培养。不过,在悬浮培养中必须定时通气,其方法培养基中进行
22、悬浮培养。不过,在悬浮培养中必须定时通气,其方法或是由培养基底部鼓入无菌空气,或是不断轻轻摇动。在原生质体培或是由培养基底部鼓入无菌空气,或是不断轻轻摇动。在原生质体培养中,如果采用浅层液体培养基或小滴液体培养基进行培养,则可保养中,如果采用浅层液体培养基或小滴液体培养基进行培养,则可保持静止,不必通气。持静止,不必通气。第十七页,讲稿共四十一页哦 5.5.P H 值值在灭菌之前PH值一般都是调节到5.0-6.0之间,一般来说,当PH值高于6时,培养基会变硬,低于5时,琼脂不能很好地凝固。6.其他成分其他成分(1)活性炭:在培养基中加入活性炭(AC)主主要是为了吸附植物的有害分泌物,但活性炭对
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