常见微生物培养检测技术.ppt

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1、常见微生物培养检测技术现在学习的是第1页，共38页细菌培养方式菌培养方式 用人工方法用人工方法,将将细菌从自然界、菌从自然界、动物体或病物体或病料中分离出来料中分离出来,研究研究细菌的形菌的形态、生理特性、生理特性、生物学特性或制取生物学特性或制取细菌的某种代菌的某种代谢产物等物等,这对于于传染病的染病的诊断和防治具有重要意断和防治具有重要意义。根据不同根据不同标本及不同培养目的本及不同培养目的,可可选用不用不同的接种和培养方法。常用的有分离培养和同的接种和培养方法。常用的有分离培养和纯培养两种方法。培养两种方法。现在学习的是第2页，共38页(一一)培养基的种培养基的种类和常用培养基和常用培养

2、基F培养基的概念：培养基的概念：将将细菌所需的各种菌所需的各种营养养物物质按一定比例混合在按一定比例混合在一起一起,并并调节到适宜的到适宜的PH,这种人工配制的适种人工配制的适合合细菌生菌生长繁殖的繁殖的细菌菌营养物养物,称称为培养基。培养基。培养基配制原培养基配制原则：培养基培养基组分分应适合适合细菌菌的的营养特点养特点营养养营养养协调理化条件适宜理化条件适宜经济节约无菌无菌现在学习的是第3页，共38页1.培养基的种培养基的种类按培养基的按培养基的组成成分分成成分分类合成培养基、天然培养基合成培养基、天然培养基按培养基的物理状按培养基的物理状态分分类液体培养基、半固体培养基、固体培养基液体培

3、养基、半固体培养基、固体培养基按培养基的功能分按培养基的功能分类基基础培养基、培养基、营养培养基、养培养基、鉴别培养基、培养基、选择培培养基、养基、厌氧培养基。氧培养基。现在学习的是第4页，共38页(1)基基础培养基培养基含有培养一般含有培养一般细菌的最基本成分。菌的最基本成分。又分又分为:液体培养基、固体培养基和液体培养基、固体培养基和半固体培养基三种。在液体半固体培养基三种。在液体(肉肉汤)培养基中培养基中,加入加入2%-3%琼脂即脂即为固固体培养基体培养基,加入加入0.2%-0.5%琼脂即脂即为半固体培养基。半固体培养基。现在学习的是第5页，共38页(2)营养培养基养培养基于基于基础培养

4、基中加入高培养基中加入高营养物养物质如葡萄糖、如葡萄糖、血液、血清、腹水、生血液、血清、腹水、生长因子等因子等,以以满足足营养要养要求求较高的高的细菌生菌生长需要需要有的有的细菌菌还需加入特殊物需加入特殊物质,如如结核杆菌需加核杆菌需加入入鸡蛋清、蛋清、马铃薯、甘油等才能良好生薯、甘油等才能良好生长现在学习的是第6页，共38页(3)选择培养基培养基利用利用细菌菌对某种物某种物质敏感程度的不同敏感程度的不同,可在培可在培养基中加入抑制某些养基中加入抑制某些细菌生菌生长的的药物物,而而选择性性地地让欲分离的欲分离的细菌旺盛生菌旺盛生长的培养基的培养基,如胆如胆盐和和蔷薇色酸可以薇色酸可以选择性地抑

5、制性地抑制G+菌的生菌的生长,而不影而不影响响G菌的生菌的生长。在培养基中加入二在培养基中加入二药后可后可选择性地分离出性地分离出肠道道杆菌。杆菌。现在学习的是第7页，共38页(4)鉴别培养基培养基利用利用细菌分解底物及其代菌分解底物及其代谢产物的不同物的不同,可可在培养基中加入某种物在培养基中加入某种物质和指示和指示剂,即制即制为鉴别培养基培养基,以以测定不同定不同细菌的生化反菌的生化反应。紫黑色,具有金属光泽的菌落麦康凯平板：红色菌落现在学习的是第8页，共38页(5)厌气培养基气培养基将培养基与空气及氧隔离将培养基与空气及氧隔离,或降低培养基中的或降低培养基中的氧化氧化还原原电势,供供厌氧

6、菌生氧菌生长。除去培养基中氧的方法：除去培养基中氧的方法：降低培养基中氧化降低培养基中氧化还原原电势：如肝如肝汤或加入谷胱或加入谷胱甘甘肽、硫基醋酸、硫基醋酸盐等。等。化合去氧法：如焦性没石子酸、好氧化合去氧法：如焦性没石子酸、好氧厌氧菌混氧菌混合、种子合、种子发芽等。芽等。隔隔绝阻氧法：如液体石腊等。阻氧法：如液体石腊等。现在学习的是第9页，共38页(二二)细菌在培养基上的生菌在培养基上的生长特征特征有关概念有关概念菌落菌落:在固体培养基上在固体培养基上,由由单个个细胞繁殖形成的胞繁殖形成的肉眼可肉眼可见的的细菌集落菌集落,称称为菌落。菌落。菌苔菌苔:在固体培养基上在固体培养基上,大量菌落密

7、集生大量菌落密集生长,融融合成一片合成一片,称称为菌苔。菌苔。纯培养培养:挑取一个菌落到另一培养基桑培养挑取一个菌落到另一培养基桑培养,称称为纯培养。培养。不同的微生物种不同的微生物种类,其菌落特征不同。同一种其菌落特征不同。同一种菌在不同培养条件下菌落特征也不尽相同菌在不同培养条件下菌落特征也不尽相同,细菌的生菌的生长特征有助于特征有助于细菌的菌的鉴定。定。现在学习的是第10页，共38页细菌分离培养形式及培养菌分离培养形式及培养结果果现在学习的是第11页，共38页细菌细胞壁的主要成分是:肽聚糖(peptidoglycan),(peptidoglycan),又称为粘肽(mucopeptide)

8、(mucopeptide)或胞壁质(murein)(murein)。丹麦病理学家革兰(Hans Christian Gram)(Hans Christian Gram)为证实病组织切片中有细菌存在,在18841884年介绍了脱色后再进行复染的鉴别染色法,后来被称为革兰染色法革兰阳性菌G(Gram positive bacteria)革兰阴性菌G(Gram negative bacteria)涂片结晶紫 染色碘液媒染酒精脱色复红复染通过革兰氏染色法可将细菌分为通过革兰氏染色法可将细菌分为通过革兰氏染色法可将细菌分为通过革兰氏染色法可将细菌分为G G G G菌菌菌菌(蓝紫色蓝紫色蓝紫色蓝紫色)和和

9、和和G G G G菌菌菌菌(红红红红色色色色)两大类型。主要区别在于细胞壁结构不同。两大类型。主要区别在于细胞壁结构不同。两大类型。主要区别在于细胞壁结构不同。两大类型。主要区别在于细胞壁结构不同。现在学习的是第12页，共38页致病菌的致病菌的检验程序程序标本标本直接涂直接涂片检查片检查分离分离培养培养分子生物学分子生物学技术技术(核酸核酸杂交、杂交、PCRPCR)生化生化试验试验血清学血清学试验试验动物动物试验试验药敏药敏试验试验其它其它(HPLC)(HPLC)现在学习的是第13页，共38页细菌药敏试验结果同一细菌对不同抗同一细菌对不同抗生素的敏感性生素的敏感性不同细菌对相同不同细菌对相同抗

10、生素的敏感性抗生素的敏感性现在学习的是第14页，共38页病毒病毒 病毒(Virus)：是形体微小、结构简单、仅含有一种核酸（DNA或RNA），能够通过细菌滤器,具有超级寄生性（严格的细胞内寄生），且必须在电子显微镜下才能观察到的一类非细胞形微生物。1892年，伊万诺夫斯基和贝杰林克，烟草花叶病毒，开创了病毒学独立发展的历程。现在学习的是第15页，共38页没有没有细胞胞结构构可以透可以透过细菌菌滤器器只含一种核酸（只含一种核酸（DNA或或RNA）严格格细胞内寄生胞内寄生增殖方式增殖方式为核酸复制核酸复制对干干扰素敏感，素敏感，对抗生素不敏感抗生素不敏感病毒的基本特征病毒的基本特征现在学习的是第1

11、6页，共38页（一）病毒的感染（一）病毒的感染病毒与病毒与细胞相互作用称胞相互作用称为病毒的感染。病毒的感染。1.溶解性相互作用：病毒增殖溶解性相互作用：病毒增殖,宿主宿主细胞被破坏胞被破坏或溶解或溶解,也可不破坏也可不破坏细胞胞,形成形成稳定状定状态感染。感染。2.转化性相互作用：病毒基因化性相互作用：病毒基因组与宿主与宿主细胞基胞基因因组整合整合,引起宿主引起宿主细胞胞发生生转化。有些非但抑化。有些非但抑制宿主制宿主细胞的生物合成胞的生物合成,反而促反而促进细胞分裂增生胞分裂增生,导致致肿瘤或瘤或细胞癌胞癌变。病毒的增殖病毒的增殖现在学习的是第17页，共38页（二）病毒的增殖二）病毒的增殖

12、病毒自身无完整的病毒自身无完整的酶系系统,不能不能进行独立的行独立的物物质代代谢,必必须在活的宿主在活的宿主细胞内才能胞内才能进行生活、行生活、复制和增殖复制和增殖由宿主由宿主细胞供胞供应原料、能量和生物合成原料、能量和生物合成场所所,在病毒核酸在病毒核酸遗传密密码的控制下的控制下,于宿主于宿主细胞内复胞内复制出病毒的核酸和合成病毒的蛋白制出病毒的核酸和合成病毒的蛋白质,进一步装一步装配成大量的子代病毒配成大量的子代病毒,并将他并将他们释放到放到细胞外胞外,这种增殖方式称种增殖方式称为复制复制现在学习的是第18页，共38页病毒的复制周期病毒的复制周期（Replicative Circle）定定

13、义：自病毒吸附于：自病毒吸附于细胞开始，到子代病毒胞开始，到子代病毒从感染从感染细胞胞释放到放到细胞外的病毒复制胞外的病毒复制过程称程称为病毒的复制周期。病毒的复制周期。病毒的复制增殖病毒的复制增殖过程程,大致包括吸附、穿入、大致包括吸附、穿入、脱壳、生物合成、装配和脱壳、生物合成、装配和释放六个步放六个步骤。现在学习的是第19页，共38页现在学习的是第20页，共38页现在学习的是第21页，共38页现在学习的是第22页，共38页 Replication of virulent phage现在学习的是第23页，共38页Lysogenic infectionLysogenic infection现

14、在学习的是第24页，共38页1、吸附l需要病毒表面特异性的吸附蛋白(VAP)与细胞表面受体(也称为病毒受体)相互作用,是决定感染成功与否的关键环节。l细胞膜受体有脂蛋白受体和粘蛋白受体两种,除具有病毒吸附部位外,尚有促进病毒感染的作用。l病毒的病毒的细胞受体具有种系和胞受体具有种系和组织特异性特异性,决定了决定了病毒的宿主病毒的宿主谱。现在学习的是第25页，共38页2、穿入、穿入(侵入侵入)l病毒吸附于细胞膜后,细胞膜受体和邻近部位的膜发生折叠,将病毒吞陷,吞饮于泡内(牛痘病毒);或通过病毒与宿主细胞膜的融合进入细胞浆中(疱疹病毒);无包膜病毒则直接穿过细胞膜而入细胞(呼肠孤病毒);现在学习的

15、是第26页，共38页直接进入(裸露病毒)膜融合(包膜病毒)胞饮(包膜病毒)现在学习的是第27页，共38页3、脱壳、脱壳 感染性核酸从衣壳内释放出来的过程。有包膜病毒脱壳包括脱包膜和脱衣壳两步,无包膜病毒只需脱衣壳,方式随不同病毒而异。病毒衣壳的脱落和病毒衣壳的脱落和核酸的逸出核酸的逸出,主要主要在在细胞胞浆(RNA病病毒毒)或或细胞核胞核(DNA病毒病毒)内完成。内完成。现在学习的是第28页，共38页4、生物合成 病毒病毒进入宿主入宿主细胞后生物合成胞后生物合成阶段段,胞胞浆中无病毒中无病毒颗粒粒,称称为隐蔽期蔽期(eclipse)。病毒的生物合成病毒的生物合成过程分早期和晚期两个程分早期和晚

16、期两个阶段：段：1.早期早期:主要是由核酸主要是由核酸(DNA或或RNA)通通过mRNA制造制造酶类蛋白蛋白质代代谢工具和核酸基因工具和核酸基因组需要的核苷酸原料；需要的核苷酸原料；2.晚期晚期:主要是通主要是通过晚期晚期mRNA合成病毒合成病毒结构蛋白构蛋白质。现在学习的是第29页，共38页5、装配多数多数DNA病毒在病毒在细胞核内胞核内合成装配合成装配,RNA病毒在病毒在细胞胞浆内合成装配。内合成装配。现在学习的是第30页，共38页6、释放有的病毒聚有的病毒聚积在在细胞空泡胞空泡内后通内后通过细胞通道向外溢胞通道向外溢出出;有的依靠有的依靠细胞膨胞膨胀破破裂放出裂放出;有的有的则因因细胞感

17、染胞感染病毒后死亡裂解或自溶而病毒后死亡裂解或自溶而释出。有囊膜的病毒多数出。有囊膜的病毒多数借出芽而穿出借出芽而穿出细胞游离。胞游离。现在学习的是第31页，共38页一、一、动物接种物接种动物物选择标准准:对病毒的易感性高病毒的易感性高;动物健康物健康,体体重、年重、年龄尽可能一致尽可能一致,最好使用相最好使用相应的等的等级实验动物物,并符合所要培养病毒的要求并符合所要培养病毒的要求;尽量使用尽量使用遗传特性相似特性相似,个体差异个体差异较小小,生物学反生物学反应比比较一一致的致的动物物;外外购动物物,接种前要接种前要经过健康健康观察察,以以免免误用用带有病原体有病原体动物。物。可根据病毒性可

18、根据病毒性质、材料性、材料性质和目的不同和目的不同,采取采取皮下接种法、皮内接种、肌肉接种、静脉接种、皮下接种法、皮内接种、肌肉接种、静脉接种、腹腔接种法、腹腔接种法、脑内接种法。内接种法。现在学习的是第32页，共38页二、禽胚培养二、禽胚培养理想的禽胚理想的禽胚为SPF鸡胚。常用非免疫胚。常用非免疫鸡胚加以胚加以补充充,这种蛋种蛋应无特定病原的母源抗体无特定病原的母源抗体,否否则会影会影响病毒在胚内增殖。此外响病毒在胚内增殖。此外,不同病原不同病原对禽胚的适禽胚的适应性也不同性也不同,如狂犬病和减蛋如狂犬病和减蛋综合征病毒在合征病毒在鸭胚胚中比中比鸡胚中更易增殖胚中更易增殖,鸡传染性喉气管炎

19、病毒只染性喉气管炎病毒只能在能在鸡和火和火鸡胚内增殖胚内增殖,实际应用用时而加以而加以严格格选择。常用的接种途径有常用的接种途径有绒毛尿囊膜法、尿囊腔法、毛尿囊膜法、尿囊腔法、羊膜腔法和卵黄囊法四种羊膜腔法和卵黄囊法四种,根据不同的病毒和不根据不同的病毒和不同的目的采用适宜的接种途径。同的目的采用适宜的接种途径。现在学习的是第33页，共38页绒毛尿囊膜接种毛尿囊膜接种(10-13日日龄胚胚)尿囊腔接种尿囊腔接种(9-11日日龄胚胚)羊膜腔接种羊膜腔接种(10-12日日龄胚胚)卵黄囊接种卵黄囊接种(5-8日日龄胚胚)禽胚接种禽胚接种术式式现在学习的是第34页，共38页鸡胚不同接种途径与收获比较鸡

20、胚不同接种途径与收获比较接种途径接种途径日龄日龄方法方法破壳部位破壳部位接种量接种量(ml)(ml)收获收获 尿囊膜尿囊膜10-1310-13开蛋窗及人工开蛋窗及人工气室或钻孔气室或钻孔绒毛尿囊膜发绒毛尿囊膜发育中心及气室育中心及气室0.05-0.10.05-0.1扩大蛋窗、收扩大蛋窗、收集接种部绒毛集接种部绒毛尿囊膜尿囊膜尿囊腔尿囊腔9-119-11钻孔钻孔胚胎面与气室胚胎面与气室交界边缘上、交界边缘上、下约下约1mm1mm处处 0.1-0.20.1-0.2破气室破气室,收集尿收集尿囊液囊液(5-8ml)(5-8ml)羊膜腔羊膜腔10-1210-12开蛋窗开蛋窗气室端靠近胚气室端靠近胚胎侧胎

21、侧0.1-0.20.1-0.2扩大蛋窗扩大蛋窗,收集收集尿囊液及羊水尿囊液及羊水卵黄囊卵黄囊5-85-8钻孔钻孔气室中心气室中心0.2-0.50.2-0.5破气室破气室,收集去收集去卵黄的卵黄囊卵黄的卵黄囊或鸡胚体或鸡胚体 现在学习的是第35页，共38页影响禽胚病毒增殖的因素影响禽胚病毒增殖的因素1.种蛋种蛋质量量:SPF种蛋最理想种蛋最理想,其次是非免蛋其次是非免蛋,普普通种蛋不能用。通种蛋不能用。病原微生物病原微生物:家禽有很多疫病可家禽有很多疫病可经垂直垂直传递于于鸡胚胚,这些病原体既可些病原体既可污染制品本身染制品本身,又可影响接种又可影响接种病毒在病毒在鸡胚内增殖胚内增殖母源抗体母源

22、抗体:种蛋种蛋带有母源抗体有母源抗体,影响病毒在影响病毒在鸡胚内胚内增殖增殖抗生素抗生素:家禽混合家禽混合饲料中常含有一定的抗生素料中常含有一定的抗生素,这种微量的抗生素可以种微量的抗生素可以传递给蛋胚残留蛋胚残留现在学习的是第36页，共38页2.孵化技孵化技术:适宜的孵化条件有利于病毒增殖适宜的孵化条件有利于病毒增殖温度温度:通常适宜温度通常适宜温度为37-39.5。宁低勿高。宁低勿高。湿度湿度:鸡胚孵化胚孵化标准准为53%-57%,水禽胚孵化比水禽胚孵化比鸡胚高胚高5%-10%。通通风:发育育过程中吸入氧气排出二氧化碳程中吸入氧气排出二氧化碳,随胚随胚龄增增长需更需更换孵化机内空气。孵化机

23、内空气。转蛋蛋:大大头向上垂直放置入孵向上垂直放置入孵,在孵化在孵化过程中定期程中定期转蛋蛋,使胚胎受使胚胎受热均匀均匀,防止胚胎与蛋壳粘防止胚胎与蛋壳粘连3.接种技接种技术:不同病毒的增殖有不同的接种途不同病毒的增殖有不同的接种途径径,同一种病毒接种不同日同一种病毒接种不同日龄禽胚禽胚获得的病毒量得的病毒量也不同。同也不同。同时,接种操作接种操作应严格按照格按照规定定,不不应伤及胚体和血管及胚体和血管,以免影响其以免影响其发育育,使病毒增殖使病毒增殖速度降低或停止。速度降低或停止。现在学习的是第37页，共38页细胞培养从广胞培养从广义上上讲是体外培养之一。体外是体外培养之一。体外培养包括器官

24、培养、培养包括器官培养、组织培养和培养和细胞培养。胞培养。器官培养常指器官培养常指对未分散未分散组织进行培养行培养,可保留部分可保留部分或全部或全部组织在机体中的在机体中的组织形形态。组织培养是指从体内取出培养是指从体内取出组织,模模拟体内生理体内生理环境境,在无菌、适当温度和一定在无菌、适当温度和一定营养条件下养条件下,使之生存和使之生存和生生长,并并维持其持其结构和功能的方法。构和功能的方法。细胞培养是指利用机械、胞培养是指利用机械、酶或化学方法使或化学方法使动物物组织或或传代代细胞分散成胞分散成单个乃至个乃至24个个细胞胞团悬液液进行培养。行培养。根据培养根据培养细胞的染色体和繁殖特性胞的染色体和繁殖特性,细胞可分胞可分为三三类,即原代即原代细胞、胞、细胞株和胞株和细胞系。胞系。三、三、组织培养培养现在学习的是第38页，共38页