胰蛋白酶活性测定788.pdf

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1、1 胰蛋白酶，pH 8.0 BAEE on6 t H I H 3 N)Nfc)i-ro k H=H H H=HSA N-owo-000 B/I+C2HQH 乙醇 实验一 胰蛋白酶活性测定 实验目的：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。实验原理：胰蛋白酶相对分子量 23.7 KD，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的 肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的 N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester,BAEE）水解为 H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）。胰蛋白酶所催化的上述反应中，产物BA对253 nm的光吸收远大于 B

2、AEE,因此可以在实验起 始点把253 nm的消光值调为零，然后记录反应体系对 253 nm的消光值的增量，并把这个增量 作为测定胰蛋白酶的活性指标。酶活单位定义：在底物BAEE浓度1m mol/L，光程1 cm,波长253nm,温度25 C,测量体积 3mL,.条件下吸光值每分钟递增 0.001 C A/min=0.001）为1个BAEE酶活单位。胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义：胰蛋白酶含量一般 E1%表达。这个值的含义是：浓度为1%酶蛋白，在1cm光径下，对紫外280nm 的消光值。不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。E1%值越高，表明酶制剂中酶蛋白含量越 高。由于酶制剂中蛋白质含量各不

3、相同，所以用酶制剂配制 E1%的蛋白质溶液时，按照厂家对产品 的E1%的测定值配制溶液。在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采用 SIGMA公司生产的产品，生产公司对展品的描述是对 280nm紫外吸收值15.3，配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器。试剂：标准胰蛋白酶，N-苯甲 酰-L-精氨酸乙酯，HCI,Tris。1.胰蛋白酶活性测定：1）配制E1%的胰蛋白酶溶液 每组取E1%=15.3的 胰蛋白酶样品10mg放到1ml去离子水中，充分溶解后，放入冰中保存。2 騰蛍白酶活力虽位（BAEE曲）031酶液加入体积（加1）稀释倍數 弋稀釋倍数

4、2）按照表1的要求配制试验体系所需其它各种溶液 3）按照表1的顺序进行测定标准胰蛋白酶的活性。表1胰蛋白酶活性测定加样顺序 剂 步骤1:空白调零 步骤2:样品测定 0.1 mol/L Tris-HCI 缓冲液，pH 8.0,1.5 mL 1.5 mL 2.0 m mol/L BAEE 1.5 mL 1.5 mL 25C 预热 5min 25C 预热 5min 胰蛋白酶：10mg/mL 010 蒸馏水 10也 0 充分摇匀 充分摇匀 步骤 1：A253 nm/min 调 0 -步骤 2：=A253-nm/min -记录 在步骤2样品测定中，加入酶液后立即盖上盖迅速混匀计时，每半分钟读数一次，共读

5、34min。测得的结果要使 A253nm/min控制在0.050.100之间为宜，若偏离此范围则要适当增减酶量（5 L-20之间，空白试验相应增减等体积水）后重新测定，一直到 AA253nm/min值落在0.05 0.100之间为止。3分别求算：1）标准胰蛋白酶溶液（浓度 10mg/mL）的酶活和比活:计算方法：i）胰蛋白酶活性单位数计算:ii）胰蛋白酶比活计算：（用BAEE单位数/mg胰蛋白酶表示比活）_ 酶液活力酣EE单位 泌）酶液蛋白含量吨 加:以酶液加入体积（沁）廡蛋白離出活力（2 单位 3 4-M(p-Nitroaniline，4-NA)呈黄色,实验二胰蛋白酶动力学测定 实验目的：初

6、步掌握以下几个酶动力学参数测定与求算方法：米氏常数Km,最大反应速度 Vmax,转换数cat,特异性常数cat,/Km。实验原理：已知胰蛋白酶遵守米氏方程，可以通过测定底物浓度与反应速度间的关系测定与求 算这个酶的诸动力学参数。胰蛋白酶可以水解碱性氨基酸的羧基所生成的肽键、酰胺建和酯键。在本实验中，利用胰蛋白酶水解酰胺键活性的性质，以苯甲酰-L-精氨酰-对硝基苯胺（BAPA）作底物测定这个酶的动力学参数，反应式如下:反应最适pH8.1,最适温度25 C。反应产物之一：对硝基苯胺 对405nm波长光的摩尔吸光系数为 9870,但底物BAPA和另一个产物 BA对405nm波长的光 基本不吸收，因此

7、本实验测定光波的波长设在 405nm 上,把起始反应的吸光值调为 0,记录消 光值的变化。L-BAPA最大浓度低于5 104mol/L时这个酶促反应符合米氏方程，可用Hanes作图法求动力学参 数。Hanes作图法是单倒数作图法，把米氏方程变形为：xS ax 在实验中设定一系列底物浓度 Si，测定每一个底物浓度条件下的反应速度 vi,然后用Si/仍 对 Si作图，可以得到一条线段，线段在 y轴的截距是 Km/Vmax,线段的延长线在 x轴的截距是-Km，据此可以得到 Km和 Vmax值；cat=Vmax/Et。Et是酶的初始浓度，已在实验设定 为已知，因此cat可以得出；特异性常数 Km/-c

8、at可根据上述已知数计算出来。器材与试剂：4 器材：756紫外-可见分光光度计，恒温水浴锅，分析天平，秒表，容量瓶，移液器。试剂:1.O.1mol/L pH8.1 的 Tris-HCI 缓冲液（含 0.4%CaCI 2）:取 0.2mol/L Tris（Mr=121.14）100mL 与0.2mol/L HCI 52.4mL 混匀，加入 0.8gCaCb,蒸馏水定容到 200mL（pH值需用计pH校正）。2.1mmoI/L DL-BAPA（Mr=434.9）水溶液：称取 43.49mg BAPA，蒸馏水溶解并加热到 80 C 以上，完全溶解后置冰水中冷却，定容到 100mL。这个浓度为1mmo

9、l/L的DL-BAPA溶液命名 为第六组母液，按照逐步稀释原则配制下列溶液浓度系列：0.8m mol/L（第五组母液，25mL）;0.6m mol/L（25mL，第四组母液）；0.4m mol/L（25mL，第三组母液）；0.2 m mol/L（10 mL,第二组母液）;0.1 m mol/L（10mL，第一组母液）。3.60%（V/V）乙酸溶液 4.胰蛋白酶溶液，该酶的比活 1.0 104 BAEE单位/mg蛋白 实验步骤：1.计算胰蛋白酶加样体积：在本实验中加入胰蛋白酶的量是 60乜，实验1已经测到胰蛋白酶的 比活和浓度（Mg/ML）,根据这些值计算加入体系的酶液体积的 4L数。2.实验溶

10、液系统：本实验有 6组实验组成。实验顺序按照表 2的加样程序执行。表2.测定Km和Vmax值加样表 组 BAPA 母液浓度(m mol/L)加入BAPA(mL)母液 加入 Tris-HCI(mL)加入 胰蛋白酶（丄）加入 60%乙酸（mL）反应体系底物 BAPA浓度（m mol/L）V A405 1.0.1 样品1,2.0 1.5 n 0.4 S10.05 对照1,2.0 1.6 0 0.4 2 0.2 样品2,2.0 1.5 n 0.4 S20.1 对照2,2.0 1.6 0 0.4 3 0.4 样品3,2.0 1.5 n 0.4 S3 0.2 对照3,2.0 1.6 0 0.4 4 0.6

11、 样品4,2.0 1.5 n 0.4 S40.3 对照4,2.0 1.6 0 0.4 5 0.8 样品5,2.0 1.5 n 0.4 S50.4 对照5,2.0 1.6 0 0.4 5 6 1.0 样品6,2.0 1.5 n 0.4 S60.5 对照6,2.0 1.6 0 0.4 25 C保温5 min后，摇匀，秒表计时，准确反应 2min后加入0.4mL 60%的乙酸溶液，摇匀终 止反应。反应溶液总量应达到 4mL,不足部分可加蒸馏水补足。对照试管不加入胰蛋白酶，只加 入0.4mL 60%的乙酸溶液。最后分别记录样品和对照的 A405值，每组种两者的差值 厶A405代入6 v(mmol*L-

12、S1)=A4O5“E 9870 x10 2 下式即可得到对应于Si的j 表2列出的是6个实验，鉴于目前实验室尚没有 12个枪头的加样，所以每一个实验都可独立进 行。需要特别注意：1）比活大于1.0 104 BAEE u/mg protein的胰蛋白酶制剂，纯度范围是 90%-100%，般可达 到95%-97%。在计算动力学参数时，如无特殊精确要求，可按照胰蛋白酶 100%的近似值计算。在本试验中，可根据浓度胰蛋白酶浓度 10mg/ml，纯度100%,每个试管要求加入质量数 60g,计算出每个试管加入的胰蛋白酶溶液微升数。2）在进行动力学参数计算时，要进行胰蛋白酶质量-摩尔数转换，如无特殊要求，

13、也可以把胰 蛋白酶纯度近似为 100%.3）如果有求精确，但产品说明没有给出胰蛋白酶在固形物中的百分含量，就需配制一定浓度的 固形物溶液，首先测定蛋白质浓度，通过求算蛋白质总量，得到蛋白质在酶制剂中的重量比。然后通过双向电泳，图像扫描，把扫描结果输入计算软件，按照软件步骤，求算胰蛋白酶在全 部蛋白样品中的百分比。把实验设定的每一个Si和测定到的对应的 Vi换算成Si/Vi后,填入表3,作图求Km Vmax 表3.Hanes作图的数据 Si/v:Si/、.i S2/.2 S3/.3 S4/.4 S5/.5 S6/.6 Si:Si S2 S3 S4 S5 S6 用S/-.对S作图可得到一条线段，线段与轴的截距是 Km/Vmax，线段延长线与x轴的截距是 根据方程-Km,7 23,7 可以得到Km,Vmax 根据cat=Vmax/Et,求算cat 和 Km/-cat 注意：上式的酶浓度单位是 mol/L,已知酶浓度是10mg/ml,需要根据胰蛋白酶相对分子量 KD，纯度100%进行换算。实验完成后报告胰蛋白酶的动力参数：Km,Vmax，-cat,Km/cat