动物细胞培养实验内容.pdf

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1、细胞工程实验技术（动物细胞培养部分）目 录 实验一 实验器材清洗、包装和消毒.1 实验二 常用仪器设备介绍.2 实验三 常用动物细胞培养用液配制.2 实验四 组织块原代培养、传代培养及生物学检测.4 实验五 心肌细胞原代培养、传代培养及培养细胞常规检查.5 实验一 实验器材清洗、包装和消毒 一、实验目 1、掌握细胞培养常用实验器材清洗要领、清洗步骤和注意事项。2、掌握细胞培养常用器材包装要领和要求。3、掌握正压滤器安装、使用和拆除方法及操作注意事项。二、实验用品 以组为单位包装物品 1、量筒（100mL、500mL）2、大、小烧杯 3 个 3、1000mL 容量瓶1 4、移液管 1mL3(灭菌

2、)5、（100mL、250mL、500mL）盐水瓶、（500mL）广口瓶各 4(灭菌)6、眼科剪刀、眼科镊子各 2 把(灭菌)7、细胞培养瓶3(灭菌)其它：饭盒、青霉素瓶、牛皮纸、离心管、滴管、注射器、磁棒、绳、标签纸等杂干。三、实验内容（一）清洗 1、要领：浸泡、刷洗、酸泡。2、步骤：洗衣粉浸泡 12h刷洗流水震荡冲洗 1520 遍漓水蒸馏水洗荡 2 次37烘干待包装。3、注意事项：(1)使用后器材要立即投入水中。(2)器皿内要充满液体，不得有气泡。(3)器材要用流水震荡干净。（二）包装 1、大器材如：量筒、广口瓶、培养皿、吸管等要包装。2、小器材如：注射器、剪刀、镊子放入饭盒。3、注意事项

3、：(1)包装时手指和器材接触面积要小，手指不能触及器材使用端。(2)封闭器材使用端，标记器材手持端。(3)小包装(4)玻璃管道口加棉花。（三）湿热消毒：高压灭菌锅消毒 四、作业 1、清洗要求为何较高？你认为该如何保证器皿中无杂质？2、器材包装有何要求？实验二 常用仪器设备介绍 一、实验目 了解动物细胞培养中常用仪器设备使用方法、注意事项和保养方法 二、实验用品 1）超净工作台 2）自动双重纯水蒸馏器 3）高压蒸气灭菌器 4）过滤器 5）电热恒温干燥箱 6）二氧化碳培养箱 7）冰箱 8）倒置显微镜 三、实验内容 1、了解超净工作台工作原理 2、自动双重纯水蒸馏器结构、使用注意事项。3、高压蒸气灭

4、菌器工作原理 4、正压过滤器使用方法 5、二氧化碳培养箱使用方法 四、作业 1、叙述超净工作台工作原理 2、正压过滤器为何会除菌 实验三 常用动物细胞培养用液配制 一、实验目 掌握常用动物细胞培养用液组成及配制方法。二、实验用品和仪器 量筒、烧杯、广口瓶、天平、各种无机盐、三、实验内容（一）平衡盐溶液配制 1、平衡盐溶液配方如下：NaCl KCl CaCl2 MgSO47H2O Na2HPO42H2O KH2PO4 NaHCO3 葡萄糖 苯酚红 Hanks 8.00 0.40 0.14 0.20 0.06 0.06 0.35 1.00 0.02 D-Hanks 8.00 0.40 0.06 0

5、.06 0.35 0.02 I 组配 Hanks（1000mL），V 组配 D-Hanks（1000mL），其他各组不配平衡盐溶液。2、配制方法：（以 Hanks 液为例）(1)甲液：用约 100mL 蒸馏水溶解 CaCl2，(2)乙液：用约 750mL 蒸馏水溶解 Na2HPO42H2O、KH2PO4、MgSO47H2O、葡萄糖、NaCl、KCl。(3)将甲液徐徐加入乙液中。(4)将 0.35gNaHCO4溶解在 100mL 蒸馏水中(5)用数滴 NaHCO4液溶解 0.02 克酚红。(6)将 4、5 液移入 3 液中。(7)用双蒸水定容至 1000mL，充分混匀，调节 PH 为 7.4。4

6、冰箱过夜。(8)滤过消毒，小瓶分装（500mL、250mL2），冷藏。3、配制要求(1)配制后液体呈桃红色，PH7.4 左右，没有混浊和沉淀。(2)含 Ca、Mg 物质要单独溶解。(3)用于分离细胞消化液宜用无 Ca、Mg 离子 D-Hanks 液或 PBS 液配制。（二）200mmol/l，L-谷氨酰胺（10mL）(II 组配)方法：称取 0.292g（M146.12）+双蒸水 10mL滤过除菌-20保存。使用：每 100mL 培养基加 1mL L-谷氨酰胺。（三）抗菌素液（青霉素、链霉素）(III 组配)1、方法：10mL Hangks 液或双蒸水溶解 100 万链霉素，再用 8mL 链霉

7、素溶解 80 万 u 青霉素，成每毫升青霉素、链霉素各 10 万单位母液。2、使用：100mL 培养液加青、链霉素母液 0.1mL。（四）RPMI-1640 基础培养液配制(IV 组配)甲液：RPMI-1640 10.4g Hepes 2.7g 双蒸水 700mL 搅拌至颗粒完全溶解（橙红色）乙液：NaHCO3 2.2g 双蒸水 30mL 30min 颗粒完全溶解 将甲、乙两液混合，加水至终 1000mL 定容，4冰箱静止 23h，滤过除菌，分装（250mL、250mL、500mL）无菌试验，写好组号，-20保存。注意：用三天内制备蒸馏水配制，培养基各成分是否完全溶解判断方法：将培养液置室温或

8、 4冰箱静止30min，观察瓶底有无颗粒产生。（五）5.6%NaHCO4液（100mL）(V 组配)方法：用双蒸水 100mL 配制，滤过除菌，分装于广口瓶，4冰箱保存，使用时，NaHCO4液要逐滴加入，并不时搅动培养液，以防 PH 过高。（六）0.25%胰蛋白酶溶液（400mL）(VI 组配)1：250 胰蛋白酶(Trypsin)粉 1.0g D-Hanks 400mL 先用少量 D-Hanks 溶解胰蛋白酶，再将剩下液体加入混合，置 37水浴中 1h 左右(待彻底溶解，液体呈透明为止)，用 5.6NaHCO4调整 pH 至 7.67.8，用 0.22 微型滤膜抽滤，分装置 4冰箱中保存。（

9、七）0.02%EDTA（乙二胺四乙酸二钠）溶液（200mL）(VI 组配)方法：称取 EDTA 4g+200mL D-Hanks 液 0.02%，滤过除菌，备用。四、思考题：1、配制后液体呈黄色意味着液体 PH 发生了什么变化？2、用于分离细胞消化液为什么宜用无Ca、Mg 离子 D-Hanks 液或 PBS 液配制 3、L-谷氨酰胺在营养液中有何作用？4、营养液制备后为什么要小剂量分装？实验四 组织块原代培养、传代培养及生物学检测 一、实验目 掌握组织块原代培养、传代培养基本方法和操作特点及生物学检测基本方法和操作要点。二、实验器材和用品 1、肝组织 2、平衡盐（BSS）液（各组自己配）100

10、mL 3、细胞培养皿 4、完全培养液 5、灭菌培养皿1 个/人 6、眼科剪、镊子、吸管等 7、0.4%台盼蓝 8、血球计数板和盖玻片 三、实验步骤（一）组织块原代培养 1、将一小块肝组织置于灭菌培养皿中，用 Hanks 或 D-Hanks 液漂洗表面，吸净 Hanks 或 D-Hanks，用眼科剪反复剪成 12mm3大小（约需 2030min）。2、吸管吸取 12mL Hanks 或 D-Hanks 液吹下剪刀中碎块，然后，反复吹打，静置片刻，吸除上清 BSS。3、用吸管吸取小块肝组织于培养瓶底部，均匀，间距离 0.5cm 为宜，加少量培养液（维持湿润即可）。4、次日，组织贴壁后，再补加营养液

11、。5、37温箱培养，2448 后观察。（二）组织块传代培养 1、将长成单层原代培养组织块从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内培养液，加入少许消化液0.25%胰蛋白酶溶液。（以液面盖住细胞为宜），静置 510 分钟。2、在倒置镜下观察被消化细胞，如果细胞变园，相互之间不再连接成片，这时应立即在超净工作台中将消化液倒掉，加入 35mL 新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液。3、将细胞悬液吸出 2mL 左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加 3mL 左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养。（三）组织培养细胞常规检查 1、营养液 PH 值检查(1)新鲜培养液呈橙红色。(2)细

12、胞生长旺盛，代谢酸性产物增多，营养液酸性变黄。(3)培养瓶若刷洗不洁，残留碱性物质，致营养液 PH 增高，呈紫红色。一般情况下，每周换液 2 次，每次换半量或 1/3 量。2、微生物污染和排除（1）细菌污染对培养细胞影响及污染物检测 污染细菌量比较大，增殖细菌就可以导致培养液外观浑浊，肉眼就可以判断。细菌污染大多数可以改变培养液 pH，使培养液变浑浊、变色。用相差显微镜观察，可见满视野都是点状细菌颗粒。原来清晰培养背景变得模糊，大量细菌甚至可以覆盖细胞，对细胞生存构成威胁。用青霉素、链霉素可以预防细菌污染有效。（2）真菌污染对细胞影响及污染物检测 大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可

13、见；有散在生长，镜下可见呈丝状、管状、树枝状，纵横交错穿行于细胞之间。（3）支原体污染对细胞影响及污染物检测 支原体污染后，因为它们不会使细胞死亡可以和细胞长期共存，培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞受到多方面潜在影响，如引起细胞变形，影响 DNA 合成，抑制细胞生长等。四、思考题 1、你认为该如何操作才能保证培养过程中无微生物污染？2、你认为组织块培养成功需哪些条件？3、原代细胞和传代细胞培养有哪些区别?实验五 心肌细胞原代培养、传代培养及培养细胞常规检查 一、实验目 掌握心肌细胞培养基本方法和操作特点，为传代培养作好准备。二、实验器材和用品 1、鹌鹑心脏

14、2、平衡盐（BSS）液（各组自己配）100mL 3、细胞培养瓶（每人一个）4、完全培养液 5、灭菌培养皿1 个/人 6、眼科剪、镊子、吸管等 7、0.25%胰蛋白酶液 8、0.02%EDTA 液 9、无菌离心管 10、100 目铜筛 三、实验内容（一）原代培养实验步骤 1、取材(1)取一只鹌鹑，断颈处死，用 75%酒精浸泡消毒。(2)（在超净工作台中操作）剪开胸壁，取出心脏，放入 Hanks 或 D-Hanks 液中。(3)用 Hanks 或 D-Hanks 液冲洗心脏后，剪去心房，取心室肌，然后，用 Hanks 或 D-Hanks 液冲洗 3 次。2、漂洗和剪切(1)将心室肌置于无菌培养皿中

15、，剪成 10 块左右小块，用 Hanks 或 D-Hanks 清洗 2 次，吸去多余液体。(2)用眼科剪反复剪切成 1 mm3左右大小，约需 2030min。3、消化(1)无菌培养皿中小组织块用 Hanks 或 D-Hanks 液冲洗，移入离心管中（盖好盖子，请注意无菌操作），低速离心（500800r/min）7min。(2)用吸管去除上清液，加入沉淀量 58 倍 0.25%胰蛋白酶液，37水浴摇晃 20min，用吸管吹打组织块，以分离细胞，然后，加入完全培养液约 5mL，终止消化。4、制备单细胞悬液(1)将上述悬液 500800r/min7min，吸除上清液。(2)用 BSS 液漂吸 23m

16、in（用吸管反复轻打松散组织），离心去上清液，共两次。(3)去上清液后加 15mL 细胞培养液，混匀计数约 5105个/mL。5、接种(1)25mL 培养瓶中先加入 1.5mL 培养液，再接种 1mL 细胞悬液。(2)持瓶左右、上下轻轻摇晃，移入 37、5%CO2恒温箱培养，根据细胞生长情况，每隔 23 天换液 1 次。（二）传代培养实验步骤 1、取原代培养物，吸除原瓶内旧培养液，轻轻摇晃培养瓶，将细胞振入培养液内，将悬浮在培养液中细胞移入离心管中。2、消化（1）向瓶内加入胰蛋白酶（0.5mL）和 EDTA 液（0.5mL）约 58min，需终止消化（加基础培养液 1mL）。（2）收集消化下来

17、细胞，归入前离心管中，500800r/min5min，去除上清液。3、分瓶培养：沉淀物加少量完全培养液，摇匀，分别接种到两个新培养瓶内，每瓶再补加 2.0mL 培养液，十字形混匀细胞，、5%CO2恒温箱培养。（三）细胞培养生物学检查 1、处理贴壁生长细胞时，吸出培养液，每瓶加入消化液各 0.5mL，在 37下消化 12min 后，加入约 10mL培养液，用吸管冲洗细胞，制成细胞悬液。取 0.5mL 台盼蓝溶液、0.3 mL Hanks 或 D-Hanks 液和 0.2 mL 细胞悬液，充分混匀，然后，将混合液放置 515min。2、用吸管吸取少量混合液，注入血细胞计数板小室。将盖玻片放在计数板

18、上，用吸管吸取少量细胞悬液，充满间隙。在显微镜 100 倍放大用计数器计数 4 个大方格中细胞。3、至少计数 500 个细胞，并计数其中着色细胞。用双蒸水和 75%酒精清洗计数板和盖玻片，然后，用檫镜纸檫干。4、结果分析：(1)细胞密度（个/mL）=（四大格细胞数4）104。每个方格积为 110-4mL。(2)细胞总数（个）=细胞浓度细胞悬液量。(3)正常细胞不被染色。细胞死亡后，细胞膜通透性增大，台盼蓝进入细胞内，故细胞呈兰色。(4)细胞活力（%）=（总细胞数 着色细胞数）总细胞数100%四、思考题：1、你认为心肌细胞培养基本操作要点是什么？2、培养瓶移入 CO2恒温箱培养时，瓶盖为何要稍松？3、如何初步判断胰蛋白酶消化时间？4、细胞培养到一定时间为何要进行传代？