细胞重组与克隆技术精选PPT.ppt

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1、关于细胞重组与克隆技术第1页，讲稿共142张，创作于星期三 细胞重组细胞重组(又叫细胞拆合又叫细胞拆合)是指从活细胞中分离出细胞器及其组是指从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为装配成为具有生物活性具有生物活性的细胞或细胞器的的细胞或细胞器的一种实验技术。一种实验技术。定义定义第2页，讲稿共142张，创作于星期三 从原生动物等低等生物的去精细胞或互换细胞核的细胞，从原生动物等低等生物的去精细胞或互换细胞核的细胞，可以清楚看出真核细胞的细胞核可以清楚看出真

2、核细胞的细胞核与细胞质是相互配套、精确平衡的与细胞质是相互配套、精确平衡的。例如，将变形虫切成两个半，一半有核、一半无核；无核的一半虽然仍能消化已经吞噬例如，将变形虫切成两个半，一半有核、一半无核；无核的一半虽然仍能消化已经吞噬的食物但不能重新摄取食物、对外界刺激也不再发出反应。的食物但不能重新摄取食物、对外界刺激也不再发出反应。同位素示踪法证明，这同位素示踪法证明，这无核的一半无核的一半虽仍能吸收和结合无机磷，但其吸收和结合率均呈虽仍能吸收和结合无机磷，但其吸收和结合率均呈直线下降。直线下降。在用电镜观察时可发现其细胞内的膜结构如高尔基体、内质网系等会出现在用电镜观察时可发现其细胞内的膜结构

3、如高尔基体、内质网系等会出现退化。退化。而有而有核的那一半核的那一半照样能够摄食，对刺激也有反应，失去的收缩泡可被补偿，照样能够摄食，对刺激也有反应，失去的收缩泡可被补偿，还能生长并及时分裂。如果用一显微勾针将变形虫的细胞核钩出，这种变形还能生长并及时分裂。如果用一显微勾针将变形虫的细胞核钩出，这种变形虫的行为就会变得与无核变形虫一样，如在及时植入同种变形虫的另一个核，虫的行为就会变得与无核变形虫一样，如在及时植入同种变形虫的另一个核，上述各种生命活动又会重新恢复。上述各种生命活动又会重新恢复。第3页，讲稿共142张，创作于星期三 在探讨真核细胞的起源时。马吉利斯在探讨真核细胞的起源时。马吉利

4、斯(MaRdls)(MaRdls)曾于曾于19721972年年提出了内共生学说：真核细胞起源于原核细胞，是几个原核细提出了内共生学说：真核细胞起源于原核细胞，是几个原核细胞共生结合的结果。胞共生结合的结果。如蓝阴滴虫，细胞内含叶绿体，就是蓝藻在阴滴虫内共生的如蓝阴滴虫，细胞内含叶绿体，就是蓝藻在阴滴虫内共生的结果；结果；绿草履虫体内的绿色物体，就是与之共生的一种小球藻。绿草履虫体内的绿色物体，就是与之共生的一种小球藻。这种不同细胞的结合过程类似于细胞的自然装配。这种不同细胞的结合过程类似于细胞的自然装配。特点特点第4页，讲稿共142张，创作于星期三 细胞的生长过程包含着细胞器的自我装配，但这是

5、一种细胞的生长过程包含着细胞器的自我装配，但这是一种活体的自我装配，而活体的自我装配，而细胞重组细胞重组则是则是离体的装配过程离体的装配过程特点特点第5页，讲稿共142张，创作于星期三 1 1、将细胞融合技术与细胞核质分离等技术相结合，为将细胞融合技术与细胞核质分离等技术相结合，为重新构成不同类型的杂种细胞重新构成不同类型的杂种细胞提供了可能。提供了可能。2 2、结合基因转移技术结合基因转移技术可以人为地使细胞表达新的性状和可以人为地使细胞表达新的性状和产生新的产物。产生新的产物。因此细胞重组技术现巳成为现代生物工程中令因此细胞重组技术现巳成为现代生物工程中令人瞩目的热点课题之一。人瞩目的热点

6、课题之一。3 3、只有了解了生物合成和细胞装配的全过程，才能实现掌、只有了解了生物合成和细胞装配的全过程，才能实现掌握细胞、利用细胞、改造并进而创造出具有特定性状相功握细胞、利用细胞、改造并进而创造出具有特定性状相功能的工程细胞这一目标。从这点上讲，细胞器重组技术对能的工程细胞这一目标。从这点上讲，细胞器重组技术对于于揭示细胞活动规律揭示细胞活动规律具具有重要意义有重要意义。意义意义第6页，讲稿共142张，创作于星期三 一般而言，细胞重组的方式基本分为以下三种一般而言，细胞重组的方式基本分为以下三种（1 1）胞质体胞质体与与完整细胞完整细胞重组形成重组形成胞质杂种胞质杂种（2 2）微细胞微细胞

7、与与完整细胞完整细胞重组形成重组形成微细胞微细胞异核体异核体（3 3）胞质体胞质体与与核体核体重组形成重组细胞重组形成重组细胞812细胞重组技术细胞重组技术第7页，讲稿共142张，创作于星期三 胞质体胞质体是去除细胞核后由膜包裹的无核细胞。是去除细胞核后由膜包裹的无核细胞。微细胞微细胞又可称为微核体，含有一条或几条染色体，外有又可称为微核体，含有一条或几条染色体，外有一薄层细胞质和一个完整的质膜的核质体。一薄层细胞质和一个完整的质膜的核质体。胞质体和微细胞与完整细胞融合后就能产生相应的杂合体。胞质体和微细胞与完整细胞融合后就能产生相应的杂合体。胞质杂种细胞是不同种系之间形成的一种真正的新型细胞

8、质杂种细胞是不同种系之间形成的一种真正的新型细胞，在适宜条件下能成功的生存下去。胞，在适宜条件下能成功的生存下去。第8页，讲稿共142张，创作于星期三 显微操纵术 细胞分离技术细胞破碎方法 细胞器的分离胞质体、核质体和微细胞的制备第9页，讲稿共142张，创作于星期三 一般是在显微解剖镜下，把细胞放入消毒的培养液一般是在显微解剖镜下，把细胞放入消毒的培养液中，同时放入冷却系统中以减慢细胞发育，然后借助一中，同时放入冷却系统中以减慢细胞发育，然后借助一台专门的装置台专门的装置显微操作仪显微操作仪，用细微玻璃针或用微细管、微，用细微玻璃针或用微细管、微电极、微热电偶等斜插入细胞中去，可以挑取细胞核，

9、人工造就电极、微热电偶等斜插入细胞中去，可以挑取细胞核，人工造就去核细胞；也可以进一步作移核实验与电生理实验。去核细胞；也可以进一步作移核实验与电生理实验。8.1.2.1 显微操纵术第10页，讲稿共142张，创作于星期三8.1.2.1 显微操纵术第11页，讲稿共142张，创作于星期三 用这种仪器能够进行细胞各部分的解剖、细胞各部分物质的用这种仪器能够进行细胞各部分的解剖、细胞各部分物质的抽取和移植、各物质的注入、测量微电位的变化等等。抽取和移植、各物质的注入、测量微电位的变化等等。意义意义 1 1、实现细胞的拆合实现细胞的拆合 2 2、为研究细胞内的基因表达与调控和改良动物品种提供为研究细胞内

10、的基因表达与调控和改良动物品种提供了一种重要手段。了一种重要手段。第12页，讲稿共142张，创作于星期三 分离细胞主要是分离细胞主要是根据细胞本身的某些特殊性质根据细胞本身的某些特殊性质来选择合适来选择合适的分离技术来分离具有同一性状的细胞群、这些性质包括：的分离技术来分离具有同一性状的细胞群、这些性质包括：细胞大小、密度、表面电荷、表面标志、细胞大小、密度、表面电荷、表面标志、细胞中一个或细胞中一个或多个成分的荧光强弱、细胞对其他介质的吸附作用多个成分的荧光强弱、细胞对其他介质的吸附作用8.1.2.2细胞分离技术细胞分离技术第13页，讲稿共142张，创作于星期三 经常采用的细胞分离方法如下：

11、经常采用的细胞分离方法如下：（一）差速离心（一）差速离心（differentialcentrifugationdifferentialcentrifugation）在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器胞器 在差速离心中细胞器在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒由于各种细胞器在大小和密度上相互重

12、叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复2 23 3次效果会好一些。次效果会好一些。差速离心只用于差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞分离密度和大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。，更多用于分离细胞器。对于精细的分离，则是密度梯度离心效果更好。对于精细的分离，则是密度梯度离心效果更好。第14页，讲稿共142张，创作于星期三速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀 第15页，讲稿共142张，创作于星期三 经常采用的细胞分离方法如下：经常采用的细胞分离方法如下：（二）梯度沉降分离法（二）梯度沉降分离法 主要是根据主要是根据细胞大小细胞大小不同分离

13、细胞、细胞在单位重力作用不同分离细胞、细胞在单位重力作用下，通过下，通过密度介质密度介质、或在、或在低离心力作用下低离心力作用下通过通过梯度密度梯度密度溶溶液沉降，由于细胞大小不同，沉降速度不同。细胞大，沉降快。液沉降，由于细胞大小不同，沉降速度不同。细胞大，沉降快。常采用适当的分离介质形成一定的梯度密度溶液这此介常采用适当的分离介质形成一定的梯度密度溶液这此介质主要有：质主要有：血清、蔗糖血清、蔗糖等：等：第16页，讲稿共142张，创作于星期三 （三）等密度沉降分离法（三）等密度沉降分离法 主要是根据主要是根据细胞密度差异细胞密度差异来分离细胞。来分离细胞。细胞在连续密度梯度分离介质中、受强

14、离心力的作用，最后到达细胞在连续密度梯度分离介质中、受强离心力的作用，最后到达与其密度相同的分离介质层面，并保持平衡。与其密度相同的分离介质层面，并保持平衡。如果是非连续密度梯度介质中，细胞主要集中在介于其自身密度如果是非连续密度梯度介质中，细胞主要集中在介于其自身密度的两种密度介质交界面上，从而达到分离的目的。的两种密度介质交界面上，从而达到分离的目的。目前常采用的分离介质有目前常采用的分离介质有蛋白蛋白等。密度分离剂应该具有无刺激，对细等。密度分离剂应该具有无刺激，对细胞无吸附作用，产生的渗透压小等特点胞无吸附作用，产生的渗透压小等特点第17页，讲稿共142张，创作于星期三 (四四)流式细

15、胞仪分离法流式细胞仪分离法 这种方法是以这种方法是以免疫荧光法免疫荧光法使荧光抗体与细胞膜表面抗原结合，然后使荧光抗体与细胞膜表面抗原结合，然后用超声波处理使其分散成单个细胞，再将细胞悬浮液通过一个直径为用超声波处理使其分散成单个细胞，再将细胞悬浮液通过一个直径为50um50um的喷嘴变成极细小的微滴，每个微滴一般含有一个细胞，以的喷嘴变成极细小的微滴，每个微滴一般含有一个细胞，以l0m/sl0m/s的的速度喷出。经激光照射是细胞上所带荧光被激发而转换成脉冲通过测定脉速度喷出。经激光照射是细胞上所带荧光被激发而转换成脉冲通过测定脉冲数就可以换算出各种不同细胞表面抗原的情况。同时由于悬浮微滴中的

16、细冲数就可以换算出各种不同细胞表面抗原的情况。同时由于悬浮微滴中的细胞带有不同程度的负电荷，这样在施加电场后。移行偏斜的程度不同，而不胞带有不同程度的负电荷，这样在施加电场后。移行偏斜的程度不同，而不带电荷的细胞仍以直线流过、借此可以收集得到不带电荷或带电荷多少不同带电荷的细胞仍以直线流过、借此可以收集得到不带电荷或带电荷多少不同的各种细胞。的各种细胞。这种方法的优点是分离速度快，分离得到的细胞仍能保持其功能；缺这种方法的优点是分离速度快，分离得到的细胞仍能保持其功能；缺点是需要专门的设备。点是需要专门的设备。第18页，讲稿共142张，创作于星期三 细胞器的分离需要将组织细胞破碎，常用的方法包

17、括细胞器的分离需要将组织细胞破碎，常用的方法包括(一一)超声波破碎法超声波破碎法 原理是：超声波发生器产生高强度超声信号，经换能器传送原理是：超声波发生器产生高强度超声信号，经换能器传送至与其接触的细胞溶液中，由声波冲击和振动产生的剪切力使细至与其接触的细胞溶液中，由声波冲击和振动产生的剪切力使细胞破碎。胞破碎。缺点是破碎过程中会产热，应该注意冷却。有些生物大分子缺点是破碎过程中会产热，应该注意冷却。有些生物大分子不宜采用。不宜采用。8.1.2.3 细胞破碎方法第19页，讲稿共142张，创作于星期三第20页，讲稿共142张，创作于星期三第21页，讲稿共142张，创作于星期三 （二）反复冻融法（

18、二）反复冻融法 使细胞溶液或组织细胞浆在超低温冰箱或液氮罐内使细胞溶液或组织细胞浆在超低温冰箱或液氮罐内冻结后，在冻结后，在3737复温融化，重复复温融化，重复3-43-4次操作使细胞壁破碎。次操作使细胞壁破碎。(三三)化学裂解法化学裂解法 在细胞悬浮液中加入某些化学物质如在细胞悬浮液中加入某些化学物质如十二烷基硫酸十二烷基硫酸钠钠等使细胞膜裂解。在使用该方法的同时常要辅助以一些机等使细胞膜裂解。在使用该方法的同时常要辅助以一些机械的方法才能使细胞在短时间内完全破碎；由于化学裂解剂会械的方法才能使细胞在短时间内完全破碎；由于化学裂解剂会干扰分析，在细胞裂解后应注意清除化学裂解剂。干扰分析，在细

19、胞裂解后应注意清除化学裂解剂。第22页，讲稿共142张，创作于星期三 (四四)高速组织捣碎法高速组织捣碎法 主要借助高速组织捣碎机使细胞被高速旋转的叶片破主要借助高速组织捣碎机使细胞被高速旋转的叶片破碎。碎。由于也会发热，可能导致由于也会发热，可能导致分离物的降解分离物的降解，因此不能时间过，因此不能时间过长必要时可使用循环水冷却长必要时可使用循环水冷却第23页，讲稿共142张，创作于星期三 为了研究细胞内某种细胞器的生化组成、生理功能，为了研究细胞内某种细胞器的生化组成、生理功能，或用于细胞重组，常需大量采集细胞的某些组分。或用于细胞重组，常需大量采集细胞的某些组分。常用的方法有：常用的方法

20、有：研磨研磨、超声振荡超声振荡和和低渗低渗等将组织制成匀浆，等将组织制成匀浆，细胞中的一些亚组分就从细胞中释放出来。然后采用以上介绍的细胞中的一些亚组分就从细胞中释放出来。然后采用以上介绍的沉降分离法实现分级分离。沉降分离法实现分级分离。8.1.2.4细胞器的分离细胞器的分离第24页，讲稿共142张，创作于星期三实验实验 细胞器分离、制备与观察细胞器分离、制备与观察【目的】【目的】1 1掌握分离制备动物细胞线粒体的方法。掌握分离制备动物细胞线粒体的方法。2 2对分离得到的线粒体进行活性鉴定。对分离得到的线粒体进行活性鉴定。【原理】【原理】线粒体（线粒体（mitochondriamitochon

21、dria）是真核细胞特有的，司能量转换的重要）是真核细胞特有的，司能量转换的重要细胞器。细胞中的能源物质细胞器。细胞中的能源物质脂肪、糖、部分氨基酸在此进行脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过最终的氧化，并通过耦耦联磷酸化生成联磷酸化生成ATPATP，供给细胞生理活动，供给细胞生理活动之需。之需。第25页，讲稿共142张，创作于星期三 将动植物组织制成匀浆，在将动植物组织制成匀浆，在适当的悬浮介质适当的悬浮介质中用差速中用差速离心法可以分离细胞线粒体。在一定的离心场中离心法可以分离细胞线粒体。在一定的离心场中(选用离选用离心机的一定转速心机的一定转速)，球心颗粒的沉降速度取决于它的密

22、度、半径，球心颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀和悬浮介质的黏度。在一均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其他内含物浆中的各种细胞器及其他内含物由于沉降速度不同将停留在由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。批收集。细胞器沉降先后顺序是细胞器沉降先后顺序是细胞核细胞核、线粒体线粒体、溶酶体和其、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。他微体

23、、核糖体和大分子。第26页，讲稿共142张，创作于星期三 悬浮介质通常采用悬浮介质通常采用缓冲的蔗糖溶液缓冲的蔗糖溶液，它较接近细胞质的分，它较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性；散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性；pH7.2pH7.2的条件下的条件下；亚细胞组分不容易重新聚集成团，有利于；亚细胞组分不容易重新聚集成团，有利于分离。分离。整个操作过程样品要保持在整个操作过程样品要保持在0404，避免酶失活。，避免酶失活。第27页，讲稿共142张，创作于星期三 细胞器标记酶的测定是评价细胞器内膜组分和分离纯度的主细胞器标记酶的测定是评价细胞器内膜组分和分离纯

24、度的主要依据，如线粒体内膜上分布有要依据，如线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶细胞色素氧化酶，该酶使，该酶使詹詹纳斯绿纳斯绿B B染料染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。色，而胞质中的染料被还原成无色。第28页，讲稿共142张，创作于星期三鼠肝线粒体的分离鼠肝线粒体的分离【材料材料】鼠肝脏或猪肝脏。鼠肝脏或猪肝脏。【实验用品实验用品】1 1试剂：试剂：(1)0.25 mol(1)0.25 molL L蔗糖蔗糖+0.01 mol+0.01 molL L三羟甲基氨基甲烷三羟甲基氨基甲烷(Tris)(Tris)一盐酸缓冲液一盐

25、酸缓冲液(pH 7.4)(pH 7.4)：0.1 mol0.1 molL L三羟甲基氨基甲烷溶液三羟甲基氨基甲烷溶液 10 mL10 mL 0.1 mol 0.1 molL L盐酸盐酸 8.4 mL8.4 mL 加双蒸水到加双蒸水到100 mL100 mL，再加蔗糖使浓度为，再加蔗糖使浓度为0.25 mol0.25 molL L。(2)0.34 mol(2)0.34 molL L蔗糖蔗糖+0.01 mol+0.01 molL TrisL Tris一盐酸缓冲液一盐酸缓冲液(pH7.4)(pH7.4)，配法同上。，配法同上。第29页，讲稿共142张，创作于星期三(3)(3)1 1詹纳斯绿詹纳斯绿B

26、(Janus green B)B(Janus green B)染液染液 (4)(4)姬姆萨染液姬姆萨染液(Giemsa)(Giemsa)：2 2器具：器具：解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃匀浆器，尼龙织物，刻度离心解剖刀，剪刀，漏斗，玻璃匀浆器，尼龙织物，刻度离心管，显微镜，冷冻高速离心机。管，显微镜，冷冻高速离心机。第30页，讲稿共142张，创作于星期三【实验步骤实验步骤】1 1制备肝细胞匀浆：制备肝细胞匀浆：实验前将鼠空腹实验前将鼠空腹1212小时，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐小时，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血水，用滤纸吸干水，称取水洗净血水，用滤纸吸干水，称取肝组织肝组织2g2g

27、，剪碎；用预冷的，剪碎；用预冷的0.25 mol0.25 molL L蔗糖溶液洗涤数次。然后按每克肝加蔗糖溶液洗涤数次。然后按每克肝加4.5 mL4.5 mL预冷的预冷的0.25 mol0.25 molL L蔗糖溶液蔗糖溶液的量，分数次添加蔗糖溶液，在的量，分数次添加蔗糖溶液，在0404冰冰浴中用玻璃匀浆器将肝制成匀浆，用双层纱布过滤。浴中用玻璃匀浆器将肝制成匀浆，用双层纱布过滤。第31页，讲稿共142张，创作于星期三2 2差速离心：差速离心：将将0.34 mol0.34 molL L蔗糖溶液蔗糖溶液4.5mL4.5mL放入离心管，然后沿放入离心管，然后沿管壁小心地加入管壁小心地加入4.5mL

28、4.5mL鼠肝匀浆覆盖于上层。鼠肝匀浆覆盖于上层。用冷冻控温的高速离心按下图顺序进行差速离心。用冷冻控温的高速离心按下图顺序进行差速离心。第32页，讲稿共142张，创作于星期三分离细胞核：分离细胞核：沉淀沉淀(细胞核及质膜碎片细胞核及质膜碎片)鼠肝匀浆鼠肝匀浆1500r/min,1500r/min,离心离心10 min10 min 上清液上清液(1)(1)洗涤洗涤(0.25 mol(0.25 molL L预冷蔗糖溶液预冷蔗糖溶液5 mL5 mL洗涤洗涤2 2次，每次，每次次15001500r/min离心离心15 min15 min。沉淀沉淀(细胞核及质膜碎片细胞核及质膜碎片)上清液上清液(2)

29、(2)与上清与上清(1)(1)合并合并第33页，讲稿共142张，创作于星期三分离细胞核：分离细胞核：沉淀沉淀(线粒体线粒体)混合上清液混合上清液10000r/min10000r/min离心离心10 min10 min上清液上清液(弃去弃去)洗涤洗涤,加预冷的加预冷的0.25 mol0.25 molL L蔗糖溶液蔗糖溶液10 mL10 mL，1000010000r/min离离心心10 min10 min沉淀沉淀(纯化的线粒体纯化的线粒体)上清液上清液(弃去弃去)第34页，讲稿共142张，创作于星期三活性鉴定：活性鉴定：(1)(1)细胞核：细胞核：取核沉淀取核沉淀1 1滴涂于载玻片，加入滴涂于载玻

30、片，加入CarnoyCarnoy固定液固定液（甲醇：冰乙酸（甲醇：冰乙酸3:13:1）15 min15 min，晾干。，晾干。GiemsaGiemsa染液染染液染10 min10 min，蒸馏水漂洗数秒，用滤纸吸干水、用显微镜蒸馏水漂洗数秒，用滤纸吸干水、用显微镜(40)(40)检查，检查，细胞细胞核呈紫红色，混杂的胞质为浅蓝色碎片。核呈紫红色，混杂的胞质为浅蓝色碎片。(2)(2)线粒体：线粒体：取线粒体沉淀滴在载玻片上，勿太密。滴加取线粒体沉淀滴在载玻片上，勿太密。滴加1 1詹钠斯绿溶液染液，詹钠斯绿溶液染液，10 min10 min后用光学显微镜观察，后用光学显微镜观察，线线粒体蓝绿色，呈

31、小棒状或哑铃状粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。第35页，讲稿共142张，创作于星期三 这三种是细胞重组常用的几个原料，因此在此重点介绍这三种是细胞重组常用的几个原料，因此在此重点介绍(一一)胞质体胞质体 方法方法 细胞松弛素细胞松弛素B B处理体外培养细胞能诱发其排核，结合高速离心处理体外培养细胞能诱发其排核，结合高速离心得到了胞质体。得到了胞质体。影响制取胞质体的因素：影响制取胞质体的因素：容器容器，有玻璃片、塑料片、离心管、培养皿、培养瓶等，需在，有玻璃片、塑料片、离心管、培养皿、培养瓶等，需在灭菌恒温培养室中进行。灭菌恒温培养室中进行。适宜的温度适宜的温度、细胞松弛素、细胞松弛素B B的剂

32、量、培养液浓度及其血清的剂量、培养液浓度及其血清含量、离心速度、细胞密度等。含量、离心速度、细胞密度等。8.1.2.5胞质体、核体和微细胞的制备胞质体、核体和微细胞的制备第36页，讲稿共142张，创作于星期三 特点：特点：植物细胞的胞质体内的细胞器与完整细胞相同植物细胞的胞质体内的细胞器与完整细胞相同，具有内，具有内质网系、线粒体、溶酶体、高尔基体和中心粒及微粒、微管等质网系、线粒体、溶酶体、高尔基体和中心粒及微粒、微管等骨架系统，骨架系统，各细胞器仍占有固有的位置各细胞器仍占有固有的位置。线粒体的运动十分。线粒体的运动十分活跃，线粒体膜上各酶系的分布及氧化磷酸化过程都照样存活跃，线粒体膜上各

33、酶系的分布及氧化磷酸化过程都照样存在。在。胞质体内线粒体内胞质体内线粒体内自主性的自主性的DNADNA复制复制尚能有限地进行着。尚能有限地进行着。蛋白质的合成蛋白质的合成在去核后的一段时间内持续进行。在去核后的一段时间内持续进行。因此，去核细胞质体是深入研究细胞质作用的重要样品。因此，去核细胞质体是深入研究细胞质作用的重要样品。第37页，讲稿共142张，创作于星期三 （二）核体（二）核体 与胞质分离得到的细胞核，带有少量胞质并围有质与胞质分离得到的细胞核，带有少量胞质并围有质膜，称为膜，称为“核体核体”。核体能重新核体能重新再生其胞质部分再生其胞质部分，继续生长、分裂。，继续生长、分裂。为了生

34、产大量的核体，必须采用一系列的纯化技术，以防夹为了生产大量的核体，必须采用一系列的纯化技术，以防夹杂完整细胞和胞质体。杂完整细胞和胞质体。可在去核处理后可在去核处理后,从离心管底部收集样品从离心管底部收集样品,接种于培养皿内接种于培养皿内,温育温育1-2h1-2h，由于核体的贴壁率大大低于残留完整细胞的贴壁，由于核体的贴壁率大大低于残留完整细胞的贴壁率，可从上清液中收集得到较纯净的核体。如此重复率，可从上清液中收集得到较纯净的核体。如此重复1-21-2次次,可可使核体的纯度高达使核体的纯度高达9999。第38页，讲稿共142张，创作于星期三 (三三)微细胞微细胞 秋水仙素及其衍生物和长春新碱等

35、秋水仙素及其衍生物和长春新碱等有丝分裂阻断剂能干扰有丝分裂阻断剂能干扰微管的合成与装配微管的合成与装配，而使染色体停滞在有丝分裂中期。，而使染色体停滞在有丝分裂中期。经体外培养，经体外培养，在单个染色体或染色体周缘就会重现核膜而形在单个染色体或染色体周缘就会重现核膜而形成含有一个微核、一薄层细胞质和一个完整质膜的微细胞。成含有一个微核、一薄层细胞质和一个完整质膜的微细胞。这种这种微细胞仅含有一个或数个染色体的微细胞仅含有一个或数个染色体的DNADNA，也是细胞拆合工程的，也是细胞拆合工程的一种有用材料。一种有用材料。第39页，讲稿共142张，创作于星期三 用上述方法从活细胞中拆散出来的用上述方

36、法从活细胞中拆散出来的胞质体、核体、微细胞质体、核体、微细胞胞为材料，通过显微操纵术，在光学显微镜下用为材料，通过显微操纵术，在光学显微镜下用显微操纵器显微操纵器把材料重新组合把材料重新组合，加入病毒或化学物质如聚乙二醇等，加入病毒或化学物质如聚乙二醇等融合融合因子因子，经过一段时间的作用，可以把它们更新装配成新的，经过一段时间的作用，可以把它们更新装配成新的活细胞。活细胞。第40页，讲稿共142张，创作于星期三8 82 21 1 克隆的定义克隆的定义 “克隆克隆”“”“来源于希腊语。原意是用于扦插的枝条，来源于希腊语。原意是用于扦插的枝条，也就是也就是指无性繁殖指无性繁殖。本意是指遗传上完全

37、相同的分子、细胞。本意是指遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一祖先的生物个体的无性繁殖群体或来自同一祖先的生物个体的无性繁殖群体 克隆是指一种实现无性繁殖的操作克隆是指一种实现无性繁殖的操作，而不是一般意义上的无，而不是一般意义上的无性繁殖。性繁殖。82克隆技术克隆技术第41页，讲稿共142张，创作于星期三 8.2.2克隆的相关理论基础克隆的相关理论基础 克隆在植物界已有上千年的历史。但理论的上克隆在植物界已有上千年的历史。但理论的上的突破则是发生在的突破则是发生在2020世纪。世纪。19021902年德国植物学家哈伯兰德提出，年德国植物学家哈伯兰德提出，植物的体细胞植物的体细胞具有母体全部的

38、遗体信息，具有发育成为完整个体的潜具有母体全部的遗体信息，具有发育成为完整个体的潜能能。因而每个植物细胞都可像胚胎细胞那样，经离。因而每个植物细胞都可像胚胎细胞那样，经离体培养再生成为完整植株。这就是所谓的细胞全能体培养再生成为完整植株。这就是所谓的细胞全能性。性。第42页，讲稿共142张，创作于星期三 虽然，从理论上讲，任何一个细胞都含有其生物体系基因虽然，从理论上讲，任何一个细胞都含有其生物体系基因组的全部基因，因此都可以被克隆。但实际上，动植物细胞克组的全部基因，因此都可以被克隆。但实际上，动植物细胞克隆结果差别很大。克隆现象在植物界普遍存在。既可以是自然隆结果差别很大。克隆现象在植物界

39、普遍存在。既可以是自然的。也可以是人工的。的。也可以是人工的。第43页，讲稿共142张，创作于星期三 与植物细胞不同，与植物细胞不同，在动物发育过程中分化了的细胞不再在动物发育过程中分化了的细胞不再产生完整的充分分化的个体，产生完整的充分分化的个体，然而，动物胚胎的生长、分然而，动物胚胎的生长、分化和发育是否造成体细胞基因组的不可逆性修饰，化和发育是否造成体细胞基因组的不可逆性修饰，即在发育即在发育过程中分化了的细胞是否具有与受精卵相同的过程中分化了的细胞是否具有与受精卵相同的核等价性核等价性或基因或基因组连续性、一直是发育生物学要解决的问题组连续性、一直是发育生物学要解决的问题 第44页，讲

40、稿共142张，创作于星期三 早在早在2020世纪世纪3030年代，著名的胚胎学家斯佩尔曼就已经提出了年代，著名的胚胎学家斯佩尔曼就已经提出了分化了的细胞核移入卵子中能否指导胚胎发育这样的设想。用两分化了的细胞核移入卵子中能否指导胚胎发育这样的设想。用两栖类动物进行的一些克隆实验表明，早期胚胎细胞核经移植可产栖类动物进行的一些克隆实验表明，早期胚胎细胞核经移植可产生成熟的动物个体。生成熟的动物个体。也就是说尚未分化的胚胎细胞具有全能性。也就是说尚未分化的胚胎细胞具有全能性。基于这种认知、人们采用胚胎分割及胚胎细胞核移植技基于这种认知、人们采用胚胎分割及胚胎细胞核移植技术成功克隆出了许多动物。术成

41、功克隆出了许多动物。第45页，讲稿共142张，创作于星期三 这种对动物细胞全能性的认识自这种对动物细胞全能性的认识自19971997年后得到改变，体细年后得到改变，体细胞克隆动物胞克隆动物“多利多利”羊的成功证明羊的成功证明成熟的体细胞也具有全能成熟的体细胞也具有全能性；性；后来，体细胞克隆小鼠、牛及山羊的成功，更充分后来，体细胞克隆小鼠、牛及山羊的成功，更充分证明高证明高度分化的细胞核仍具有全能性。度分化的细胞核仍具有全能性。因此，人们对细胞全能性因此，人们对细胞全能性有了全新的认识。有了全新的认识。第46页，讲稿共142张，创作于星期三 目前，克隆技术最成功的应用体现在目前，克隆技术最成功

42、的应用体现在克隆动物的培育上。克隆动物的培育上。下面将重点介绍的克隆主要是指以下面将重点介绍的克隆主要是指以细细胞核移植为核心技术的无性繁殖胞核移植为核心技术的无性繁殖操作技操作技术：术：8.2.3克隆的技术方法克隆的技术方法第47页，讲稿共142张，创作于星期三 (一一)定义定义 细胞核移植技术细胞核移植技术 是一种利用显微操是一种利用显微操作技术将一种动物的细胞核移入同种或作技术将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的异种动物的去核成熟卵内去核成熟卵内的精细技术。的精细技术。8.2.3.1细胞核移植细胞核移植第48页，讲稿共142张，创作于星期三 由于主要的遗传物质存在于细胞核中，因此，由于

43、主要的遗传物质存在于细胞核中，因此，核核移植的受体将具有与核移植供体完全相同的遗传基础，移植的受体将具有与核移植供体完全相同的遗传基础，因此，细胞核移植技术在动物育种工作中具有十因此，细胞核移植技术在动物育种工作中具有十分重要的意义。分重要的意义。因为它像植物中的组织培养那样，可以利用一头优因为它像植物中的组织培养那样，可以利用一头优质的动物质的动物(例如高产的奶牛例如高产的奶牛)复制出与它生得完全一样复制出与它生得完全一样的成千上万的细胞核移植系动物。的成千上万的细胞核移植系动物。细胞核移植技术细胞核移植技术是克隆技术的关键。是克隆技术的关键。第49页，讲稿共142张，创作于星期三 细胞核移

44、植所得到的杂种称为核质杂种。细胞核移植所得到的杂种称为核质杂种。根据根据细胞核移植对象的不同细胞核移植对象的不同可分为可分为胚胎细胞核移植胚胎细胞核移植、体体细胞核移植细胞核移植等。等。开始时，进行细胞核移植主要是为了研究胚胎发育进程中细胞开始时，进行细胞核移植主要是为了研究胚胎发育进程中细胞核和细胞质功能及两者之间的关系，探索有关遗传、发育和细胞核和细胞质功能及两者之间的关系，探索有关遗传、发育和细胞分化等方面的理论问题。后来发现，这项技术可以实现不同细胞分化等方面的理论问题。后来发现，这项技术可以实现不同细胞核和细胞质的组配，从而培育出新物种。核和细胞质的组配，从而培育出新物种。第50页，

45、讲稿共142张，创作于星期三 (二二)发展历史发展历史 1 1、提出思想、提出思想 第一个提出对动物进行细胞核移植实验的人是诺贝尔奖第一个提出对动物进行细胞核移植实验的人是诺贝尔奖获得者德国胚胎学家汉斯获得者德国胚胎学家汉斯施佩曼博士，施佩曼博士，他构想了一个他构想了一个“奇异奇异的实验的实验”：把一个卵细胞的：把一个卵细胞的细胞核取出细胞核取出，然后把取自另一个发，然后把取自另一个发育到后期的胚胎的育到后期的胚胎的细胞核放入细胞核放入这个卵细胞中。这个卵细胞中。但由于技术等方面的原因使他但由于技术等方面的原因使他没能找到没能找到将细胞核导入卵将细胞核导入卵细胞的方法。细胞的方法。第51页，讲

46、稿共142张，创作于星期三 2 2、建立技术及低等动物试验、建立技术及低等动物试验 1952 1952年，美国人罗伯特年，美国人罗伯特.布里格斯和布里格斯和T TJ J金首先利用金首先利用两栖类卵细胞两栖类卵细胞建立了细胞核移植技术。建立了细胞核移植技术。第52页，讲稿共142张，创作于星期三3 3、高等动物试验、高等动物试验 经过大量低等动物实验成功之后，研究人员经过大量低等动物实验成功之后，研究人员开始进行哺乳开始进行哺乳动物的移核试验动物的移核试验。最早用来作移核试验的哺乳动物是。最早用来作移核试验的哺乳动物是小鼠小鼠。1977 1977年，美国的杰克逊实验室用年，美国的杰克逊实验室用“

47、亚无性繁殖亚无性繁殖”的方式，培育的方式，培育出出7 7只单亲小鼠。因为此种小鼠的体细胞中只有母体一方的染色只单亲小鼠。因为此种小鼠的体细胞中只有母体一方的染色体，故称之为单亲小鼠。体，故称之为单亲小鼠。第53页，讲稿共142张，创作于星期三 随着技术手段的发展和进步，随着技术手段的发展和进步，哺乳动物的细胞核移核实哺乳动物的细胞核移核实验验开始进入一个令人嘱目的新阶段。开始进入一个令人嘱目的新阶段。1981 1981年，瑞士日内瓦大学的卡尔年，瑞士日内瓦大学的卡尔伊尔门泽和美国杰伊尔门泽和美国杰克逊实验室的必得克逊实验室的必得霍普首次对霍普首次对小鼠卵进行移核试验获得成小鼠卵进行移核试验获得

48、成功功。他们将。他们将囊胚内细胞团细胞的核囊胚内细胞团细胞的核移入去核的受精卵中，经移入去核的受精卵中，经培养培养移核卵发育到囊胚期移核卵发育到囊胚期、再将此胚胎植入同步孕小鼠的子、再将此胚胎植入同步孕小鼠的子宫内，最后产下两雌一雄仔鼠，并发育成了可育的个体。宫内，最后产下两雌一雄仔鼠，并发育成了可育的个体。第54页，讲稿共142张，创作于星期三 我国的细胞核移植技术工作开始于我国的细胞核移植技术工作开始于2020世纪世纪5050年代，主要年代，主要是在是在两栖类两栖类和和鱼类鱼类上进行的。上进行的。1961 1961年开始，童第周等以年开始，童第周等以金鱼金鱼和和鳑被鱼鳑被鱼为材料，进行鱼为

49、材料，进行鱼类不同亚科间的细胞核移植获得成功，用以研究杂交细类不同亚科间的细胞核移植获得成功，用以研究杂交细胞核与纯种细胞核在发育功能上的差异以及细胞质对细胞核与纯种细胞核在发育功能上的差异以及细胞质对细胞核的影响。胞核的影响。第55页，讲稿共142张，创作于星期三 19801980年年4 4月，中国科学院武汉水生生物研究所利用鲫鱼月，中国科学院武汉水生生物研究所利用鲫鱼做移核试验，成功地培育出做移核试验，成功地培育出两尾无性繁殖的幼鱼两尾无性繁殖的幼鱼。之后的之后的19891989年，童第周、牛满江又将鲫鱼胚胎细胞核年，童第周、牛满江又将鲫鱼胚胎细胞核移入鲤鱼去核的未受精卵中，实现了不同种间

50、的核质杂移入鲤鱼去核的未受精卵中，实现了不同种间的核质杂交，交，成功地无性繁殖了成功地无性繁殖了“鲤鲫核鱼鲤鲫核鱼”新品种，新品种，这个新品种的这个新品种的“鲤鲫核鱼鲤鲫核鱼”既具有鲫鱼的鲜美味道，又具有鲤鱼的生长快速。既具有鲫鱼的鲜美味道，又具有鲤鱼的生长快速。第56页，讲稿共142张，创作于星期三 20082008年，鲤鲫移核鱼是采用无性杂交的细胞工程技术，年，鲤鲫移核鱼是采用无性杂交的细胞工程技术，将将荷包红鲤荷包红鲤的囊胚细胞核移植到的囊胚细胞核移植到鲫鱼的去核卵鲫鱼的去核卵中而发育形成的中而发育形成的后代。后代。其鱼体呈红色，外形特征与鲤鱼相似，但也同时具有一其鱼体呈红色，外形特征与