细胞重组与细胞融合PPT精选PPT.ppt

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1、关于细胞重组与细胞融合PPT第1页，讲稿共51张，创作于星期三细胞重组与细胞融合细胞重组与细胞融合细胞重组：细胞重组：从活细胞中分离出细胞器及其组份，在体外进行重新装配成为具有生物活性的细胞的一种技术。细胞融合：细胞融合：人工方法使2个或2个以上的细胞合并形成1个细胞的技术。第2页，讲稿共51张，创作于星期三核体与胞质体核体与胞质体核体：核体：与细胞质分离后得到的带有少量细胞质并包有质膜的细胞核，也成为小型细胞。核体能够重生其胞质部分，继续生长分裂。胞质体：胞质体：除去细胞核后由质膜包裹的无核细胞。细胞松弛素B处理细胞能诱发细胞排核反应，此时通过离心的方法可以将核体与胞质体分离。第3页，讲稿共

2、51张，创作于星期三微细胞微细胞微细胞：微细胞：又称微核体，含有一条或几条染色体，外有一薄层细胞质和一个完整质膜的核质体。秋水仙素和长春新碱等有丝分离阻断剂能干扰微管的合成与装配，导致细胞分裂后期染色体产生发散运动，发散开的染色体各自装配出自己的核膜，形成微细胞。秋水仙胺秋水仙胺细胞松弛素细胞松弛素B细胞松弛素细胞松弛素B离心离心第4页，讲稿共51张，创作于星期三胞质体与完整细胞的重组形成胞质杂种胞质杂种；微细胞与完整细胞的重组形成微细胞核异体微细胞核异体；胞质体与核体重新组合形成重组细胞重组细胞。细胞重组的方式细胞重组的方式第5页，讲稿共51张，创作于星期三细胞重组技术将细胞融合技术与细胞核

3、质分离技术相结合，为重新构建不同类型的杂种细胞提供可能；细胞重组技术可以人为的将染色体或者基因进行转移，使重组细胞产生新的性状和新的特性。细胞重组的意义细胞重组的意义第6页，讲稿共51张，创作于星期三细胞质工程细胞质工程细胞质工程：细胞质工程：是研究真核细胞的核-质关系以及细胞器、细胞质基因转移的技术。细胞质工程是进行细胞重组的重要基础。细胞质工程涉及的技术有：1、细胞破碎2、细胞器及细胞组分分离3、细胞器转移4、胞质杂种第7页，讲稿共51张，创作于星期三一、细胞破碎一、细胞破碎细胞破碎是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物释放出来的技术。细胞破碎方法包含：1、超声波破碎法2、反复冻融法

4、3、高速组织捣碎法4、化学裂解法5、生物酶解法第8页，讲稿共51张，创作于星期三超声波破碎法超声波破碎法 利用超声波振荡器发射的15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液，由发生器和换能器组成。反复冻融法反复冻融法 将细胞放在低温下冷冻，然后在室温中融化，反复多次而达到破壁作用。第9页，讲稿共51张，创作于星期三高速组织捣碎法高速组织捣碎法 借助高速组织捣碎机使细胞被高速旋转的叶片打碎。化学裂解法化学裂解法 通过化学药品改变细胞膜的通透性，使其裂解。生物酶解法生物酶解法 利用溶解细胞壁的酶处理细胞，破坏细胞壁，使细胞内含组分释放。第10页，讲稿共51张，创作于星期三二、细胞器及细胞组分分离二、

5、细胞器及细胞组分分离细胞内不同组份的密度和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不同，因此，常用不同转速的离心法将细胞内各种组份分级分离出来。细胞器及细胞组份分离过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步。细胞匀浆要在低温条件、等渗缓冲液（等渗匀浆介质，如0.25mol/L的蔗糖）中进行。细胞器及细胞组份分离方法包含：1、差速离心法2、密度梯度分离法第11页，讲稿共51张，创作于星期三第12页，讲稿共51张，创作于星期三沉降系数：沉降系数：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。沉降系数是以时间表示的。蛋白质，核酸等生物大分子的S实际上时常在10的-13次方秒左右，故把沉降系数10的-13次方秒称

6、为一个Svedberg单位，简写S，即10的-13方秒=1S。大多数蛋白质和核酸的沉降系数在4S和40S之间，核糖体及其亚基在30S和80S之间，多核糖体在100S以上。第13页，讲稿共51张，创作于星期三离心方式离心运动是指物体有远离中心运动的现象。离心运动是指物体有远离中心运动的现象。根据离心机的类型分为水平离心、角离心（偏水平）和垂直离心三种。根据离心机的类型分为水平离心、角离心（偏水平）和垂直离心三种。根据离心方式分为差速离心和密度梯度离心两种。根据离心方式分为差速离心和密度梯度离心两种。第14页，讲稿共51张，创作于星期三差速离心：差速离心：在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用

7、于分离不同大小的细胞和细胞器。速度逐渐提高，样品按大小先后沉降速度逐渐提高，样品按大小先后沉降第15页，讲稿共51张，创作于星期三在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：细胞核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复23次效果会好一些。差速离心只用于分离密度和大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。对于精细的分离，则是密度梯度离心效果更好。第16页，讲稿共51张，创作于星期三密度梯度离心：密度梯度离心：用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部

8、，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。第17页，讲稿共51张，创作于星期三密度梯度离心又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种密度梯度离心又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种1 1、速度沉降、速度沉降主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。这种沉降方法所采用的介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。生物颗粒（细胞或细胞器）在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。2 2、等密度沉降、等密度沉降适用于分离密度不等的颗粒。细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离心力和足够长时间则沉降或漂浮到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将

9、不同密度的细胞或细胞器分离。介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度，而且介质的梯度要求较高的陡度，不能太平缓。这种方法适于分离细胞器，而不太适于分离和纯化细胞。第18页，讲稿共51张，创作于星期三速度沉降等密度沉降第19页，讲稿共51张，创作于星期三三、细胞器转移三、细胞器转移细胞器转移是将一个物种的细胞器转移到另一个物种细胞中的技术。细胞器转移类似细胞核移植技术。不同的是操作对象为细胞器，不是细胞核。最常见的是线粒体和叶绿体的细胞器转移。细胞器转移方法有微注射、载体转移、胞吞胞饮等方式。第20页，讲稿共51张，创作于星期三四、胞质杂种四、胞质杂种概念一：将两种不同来源的核外遗传物质（线粒体

10、和叶绿体）与一个特定的细胞核组合在一起得到的细胞称为胞质杂种。概念二：来自两个原生质体融合产生的细胞，其中一个细胞的细胞核消失后，两个亲代原生质的细胞质杂交得到的个体成为胞质杂种。核心概念是细胞质的杂交，不是细胞核，其中细胞质中存在不同来源的细胞器，尤其是线粒体和叶绿体。第21页，讲稿共51张，创作于星期三细胞融合细胞融合细胞融合(Cell fusion)：又称体细胞杂交，是指使用人工方法使两个或两个以上的体细胞合并形成一个细胞，使之分化再生，形成新物种或新品种的技术。细胞融合方法包含人工方法和无性方法1、人工方法：人工方法：是指在外力使用诱导剂或促融剂、电场、磁场、超声波、重力、激光等因素的

11、作用。2、无性方式：无性方式：是区别于有性方式而言的，有自然条件下，生殖细胞卵子和精子相互接触会发生细胞融合的现象。第22页，讲稿共51张，创作于星期三1838-1875年：在血液组织中发现有多核细胞；20世纪50年代：日本科学家发现仙台病毒可以引起细胞的融合；1965年：英国的科学家海利斯成功得到了融合细胞；1964年：HAT（次黄嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidin)）选择培养基应用于融合细胞的选择；1974年：加拿大华裔科学家高国楠发现聚乙二醇（PEG）能够促使 植物的原生质体融合；1982年：出现了电融合技术；近20年：从

12、细胞融合的理论和实践两个方面进行了大量研究，细胞融合的方法不断更新和完善，融合率逐步提高。细胞融合技术的发展史细胞融合技术的发展史第23页，讲稿共51张，创作于星期三生物种类生物种类生物种类生物种类细胞来源细胞来源细胞来源细胞来源成功年代成功年代成功年代成功年代烟草两个种间烟草两个种间烟草两个种间烟草两个种间苷蓝苷蓝苷蓝苷蓝青菜青菜青菜青菜大豆大豆大豆大豆马唐草马唐草马唐草马唐草矮牵牛矮牵牛矮牵牛矮牵牛龙面花龙面花龙面花龙面花大麦大麦大麦大麦花生花生花生花生大麦大麦大麦大麦大豆大豆大豆大豆小麦小麦小麦小麦矮牵牛矮牵牛矮牵牛矮牵牛油菜油菜油菜油菜大豆大豆大豆大豆玉米玉米玉米玉米大豆大豆大豆大豆大

13、豆大豆大豆大豆野豌豆野豌豆野豌豆野豌豆大麦大麦大麦大麦蚕豆蚕豆蚕豆蚕豆大豆大豆大豆大豆草香木犀草香木犀草香木犀草香木犀酵母菌酵母菌酵母菌酵母菌鸡鸡鸡鸡大豆大豆大豆大豆烟草烟草烟草烟草大豆大豆大豆大豆秋水仙秋水仙秋水仙秋水仙人人人人胡萝卜胡萝卜胡萝卜胡萝卜番茄番茄番茄番茄马铃薯马铃薯马铃薯马铃薯人人人人小鼠小鼠小鼠小鼠叶叶叶叶叶叶叶叶叶叶叶叶根根根根愈伤组织愈伤组织愈伤组织愈伤组织叶叶叶叶叶叶叶叶花瓣花瓣花瓣花瓣种子种子种子种子种子种子种子种子叶叶叶叶悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞叶叶叶叶花瓣花瓣花瓣花瓣叶叶叶叶悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞叶叶叶叶悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬

14、浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞叶叶叶叶根根根根悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞叶叶叶叶原生质体原生质体原生质体原生质体血红细胞血红细胞血红细胞血红细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞叶叶叶叶悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞叶叶叶叶腹水癌细胞腹水癌细胞腹水癌细胞腹水癌细胞原生质体原生质体原生质体原生质体叶叶叶叶根尖根尖根尖根尖纤维肉瘤细胞纤维肉瘤细胞纤维肉瘤细胞纤维肉瘤细胞畸胎瘤细胞畸胎瘤细胞畸胎瘤细胞畸胎瘤细胞197219721972197219721972197319731974197419741974197419741974197419741974197419741

15、975197519761976197619761976197619761976197619761978197819781978几种细胞融合成功的例子几种细胞融合成功的例子第24页，讲稿共51张，创作于星期三细胞融合的类型异核体异核体：来自两个不同基因型的细胞融合成的融合细胞。同核体：同核体：基因型相同的细胞融合成的融合细胞。细胞融合包括对称融合和不对称融合。细胞融合包括对称融合和不对称融合。1、对称融合：两个完整的细胞间的融合。、对称融合：两个完整的细胞间的融合。2、不对称融合：其中一个细胞通过物理、化学或者生物的方法使、不对称融合：其中一个细胞通过物理、化学或者生物的方法使该细胞的细胞核或者

16、细胞质失活后再与另一个完整的细胞进行该细胞的细胞核或者细胞质失活后再与另一个完整的细胞进行的融合。的融合。第25页，讲稿共51张，创作于星期三细胞融合的过程1、两原生质体或者细胞彼此靠近；、两原生质体或者细胞彼此靠近；2、质膜融合形成细胞桥；、质膜融合形成细胞桥；3、胞质渗透；、胞质渗透；4、细胞核融合。、细胞核融合。第26页，讲稿共51张，创作于星期三细胞桥的形成过程细胞桥的形成过程第27页，讲稿共51张，创作于星期三植植物物细细胞胞融融合合过过程程人人造造小小鼠鼠培培育育过过程程示示意意图图第28页，讲稿共51张，创作于星期三细胞融合的意义改造细胞遗传物质 生产抗肿瘤疫苗 生产单克隆抗体

17、用于基因定位用于动物育种 有利于基础理论研究第29页，讲稿共51张，创作于星期三细胞融合基本原理1、细胞膜表面亲水性结构糖蛋白细胞融合的关键是要脂双层的接触，就是要去除糖蛋白，露出无糖蛋白覆盖的区域，使两个细胞的脂双层能紧密结合。第30页，讲稿共51张，创作于星期三2、病毒促进细胞融合 很多病毒都具有凝集细胞的能力，其原理大致如下：病毒的一边黏接在一个细胞表面，病毒的另一边黏接在另一个细胞表面，从而使两个细胞在病毒的作用下靠近发生凝结。仙台病毒促进细胞融合的有效部位在于它的膜，病毒被膜上的两种糖蛋白（HA、NA和F蛋白）可和细胞膜表面的糖蛋白发生作用，相互结合，在电镜下观察到在相接触的相邻细胞

18、表面之间产生一些微小的细胞质桥。第31页，讲稿共51张，创作于星期三3、化学诱导细胞融合（聚乙二醇PEG）PEG诱导细胞融合的两种方式：诱导细胞融合的两种方式：PEG含有醚键、带负电性可与细胞表面正的极性集团相连，引起细胞膜表面的蛋白起作用，使细胞相互凝集，膜蛋白质分子重排，脂类分子重排，打开质膜，细胞融合。PEG和水之间的氢键相结合，使溶液中的自由水消失，导致细胞脱水而发生膜结构的变化，使细胞相互凝集，膜蛋白质分子重排，脂类分子重排，打开质膜，细胞融合。第32页，讲稿共51张，创作于星期三4、电场诱导细胞融合 低压交流电场中，细胞聚集成串珠状紧密排列，相互接触的细胞膜之间会出现无蛋白颗粒的脂

19、质区，当受到电击时，这个区域就会被击穿，产生脂双层膜孔，导致细胞之间的细胞质连通，发生细胞融合。细胞置于非常高的电场中，细胞膜就变得具有通透性，能让外界的分子扩散进细胞内，这一现象称为电穿孔。第33页，讲稿共51张，创作于星期三动物细胞融合1、细胞种类和性质 细胞表面性质细胞表面性质 细胞种类2、环境条件的影响 温度：温度：pH：最适为7.4-7.8 氧气含量：氧气含量：耗氧量较大，一般大于20%3、离子强度及离子种类 细胞融合时需要Ca 2，最适为0.1mol/L细胞融合的影响因素第34页，讲稿共51张，创作于星期三植物或微生物细胞融合1、PEG诱导融合的时间2、PEG纯度3、融合密度 一般

20、为2x1048x104个/ml4、融合液中加入少量的CaCI25、其他添加组份第35页，讲稿共51张，创作于星期三互补作用：亲本细胞的性状同时在杂种细胞中表现。互补作用：亲本细胞的性状同时在杂种细胞中表现。激活作用：亲本细胞的不活动基因在杂种细胞表达。激活作用：亲本细胞的不活动基因在杂种细胞表达。如只能合成RNA而不能合成DNA的小鼠巨噬细胞，与Hela细胞融合，融合后的细胞则可以合成两种核酸。消失作用：亲本细胞的性状在杂种细胞中消失。消失作用：亲本细胞的性状在杂种细胞中消失。如金黄仓鼠的黑色素瘤细胞可产生黑色素，小鼠的成纤维细胞不能产生黑色素，它们的杂种细胞不能产生黑色素。同时具有激活和消失

21、作用同时具有激活和消失作用如小鼠的胸腺细胞具有t12抗原基因和h2抗原基因，在胚胎发育早期t12基因表达，h2基因不表达，在成年小鼠中h2基因表达，t12基因不表达，而在成年小鼠的胸腺细胞与小鼠胚胎性瘤细胞融合的杂种细胞中，h2基因不表达，却激活了t12基因，使其表达。融合细胞特性的表现形式第36页，讲稿共51张，创作于星期三融合细胞筛选有两大类：一类是根据遗传和生理生化特性的互补选择法；一类是根据可见标记形状的机械选择法。抗药性筛选系统 如亲本A对氨苄青霉素敏感，对卡那霉素不敏感，亲本B对氨苄青霉素不敏感，对卡那霉素敏感，融合后的细胞对两种抗生素都不敏感。营养互补筛选系统亲本A为色氨酸缺陷型

22、，亲本B为苏氨酸缺陷型，融合细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养平板上生长。温度敏感突变型融合细胞筛选亲本A具有卡那霉素抗性但只能在37度生长，亲本B为高温敏感突变型，不具备卡那霉素抗性，融合细胞能在高温和卡那霉素抗性平板生长。融合细胞的筛选第37页，讲稿共51张，创作于星期三物理特性筛选利用细胞在形态、大小、颜色上的差别可以在显微镜下用微管将融合细胞吸取挑选出来，也可以用离心的方式。荧光表记法利用发绿色荧光的异硫氰酸荧光素和发红色荧光的碱性芯香红荧光素分别标记两个亲本细胞，融合后的细胞内存在两种荧光标记物，利用流式细胞仪可进行分选。第38页，讲稿共51张，创作于星期三细胞融合的材料-原生质体原

23、生质体（protoplast）：去除细胞壁后裸露的球型细胞。原生质体主要是植物细胞，植物细胞壁主要成份为纤维素、半纤维素、果胶质和少量蛋白质。原生质体虽然没有细胞壁，但仍能进行基本的生命活动，在离体培养下可再生细胞壁。第39页，讲稿共51张，创作于星期三植物原生质体的植物原生质体的特点特点：1、吸收能力增强：、吸收能力增强：易于摄取外来遗传物质、细胞器、细菌、病毒等；易于吸收氧、养分；2、具有全能性：、具有全能性：具有全套的遗传物质，具有细胞壁再生并能进行人工培养分化发育成完整植株的能力；3、在一定条件下可诱导原生质体融合、在一定条件下可诱导原生质体融合，形成杂种细胞。4、分泌能力提高：、分泌

24、能力提高：去除了细胞壁的扩散障碍，使细胞膜的透过性增强，利于胞内产物的分泌。5、稳定性较差：、稳定性较差：失去了细胞壁的保护作用，稳定性较差，易于受到渗透压等条件变化的影响。第40页，讲稿共51张，创作于星期三原生质体原生质体用途用途信息传递、能量转换信息传递、能量转换细胞壁合成机理细胞壁合成机理 膜的结构与功能膜的结构与功能核质关系核质关系杂交或自交不亲和的机理杂交或自交不亲和的机理 细胞间的相互作用细胞间的相互作用植物激素的作用机理植物激素的作用机理融合产生体细胞杂种融合产生体细胞杂种分离各种细胞器分离各种细胞器引入各种细胞器引入各种细胞器导入外源基因导入外源基因诱发突变体诱发突变体第41

25、页，讲稿共51张，创作于星期三原生质体的制备原生质体的制备*植物叶片 取材容易 比较容易用酶解法分离 *植物根尖组织 可由各种植物的种子萌发后取得 *植物花粉 产生单倍体原生质体 *愈伤组织、悬浮培养的细胞 细胞壁容易解离材料来源材料来源第42页，讲稿共51张，创作于星期三原生质体制备的前提是去除细胞壁，通常使用机械法和生物酶原生质体制备的前提是去除细胞壁，通常使用机械法和生物酶法。法。机械法：机械法：细胞放入高渗糖溶液中，质壁分离，剪碎组织，在这个过程中，有些质壁细胞放入高渗糖溶液中，质壁分离，剪碎组织，在这个过程中，有些质壁分离的细胞只被切去了细胞壁，从而释放出完整的原生质体。产量低；方法

26、繁琐费力；分离的细胞只被切去了细胞壁，从而释放出完整的原生质体。产量低；方法繁琐费力；局限性大。分生组织和其他液泡化程度不高的细胞中分离原生质体时不能用此法。局限性大。分生组织和其他液泡化程度不高的细胞中分离原生质体时不能用此法。第43页，讲稿共51张，创作于星期三生物酶法：利用酶处理细胞壁，从而释放出原生质体。条件温和、原生物酶法：利用酶处理细胞壁，从而释放出原生质体。条件温和、原生质体完整性好、活力高、收率高。生质体完整性好、活力高、收率高。纤维素酶类（纤维素酶类（CellulaseCellulase）：从绿色木霉中提取。）：从绿色木霉中提取。果胶酶类（果胶酶类（PectolyasePec

27、tolyase）：也叫离析酶，从根霉、黑曲霉中提取。）：也叫离析酶，从根霉、黑曲霉中提取。半纤维素酶（半纤维素酶（HemicellulaseHemicellulase）：从黑曲霉中提取。常用于从愈伤）：从黑曲霉中提取。常用于从愈伤组织中分离原生质体。组织中分离原生质体。崩溃酶崩溃酶蜗牛酶蜗牛酶第44页，讲稿共51张，创作于星期三第45页，讲稿共51张，创作于星期三过滤、离心过滤、离心加果胶酶加果胶酶和纤维素酶和纤维素酶原生质体分离过程（以叶片为例）原生质体分离过程（以叶片为例）第46页，讲稿共51张，创作于星期三原生质体纯化的方法：原生质体纯化的方法：去除破碎的原生质体、未去壁的细胞、细胞器及

28、其他碎片等杂去除破碎的原生质体、未去壁的细胞、细胞器及其他碎片等杂质。质。(1)(1)沉降法：沉降法：利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行过滤（44-169m的筛网），然后低速离心（900-4500r/min)，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。比较简单，但不易除尽一些完整的细胞，或引起原生质的破碎。(2)(2)漂浮法漂浮法 ：采用比原生质体比重大的高渗溶液，使原生质体漂浮在溶液表面。可以得到较为纯净、完整的原生质体，但完好的原生质体数量较少。第47页，讲稿共51张，创作于星期三500mmol/L蔗糖蔗糖 140mmol/L蔗糖蔗糖+360mmol/L山梨醇山梨醇100mmol/L

29、CaCL2+300mmol/L山梨醇山梨醇+原生质体原生质体(3)(3)界面法：界面法：采用两种比重不同的溶液，使原生质体处于两液相的界面之中。可以收到数量较大的纯净原生质体，同时避免收集过程中原生质体因相互挤压而破碎。第48页，讲稿共51张，创作于星期三原生质体的培养原生质体的培养 液体培养 液体浅层培养 固体平板法 固液双层培养法 琼脂糖珠培养第49页，讲稿共51张，创作于星期三原生质体活力检测原生质体活力检测染色法染色法 FDAFDA法：法：FDA（二乙酸荧光素）能穿越细胞质膜，被活细胞内的酯酶裂解，在荧光显微镜下发荧光（荧光素）。伊凡蓝法：伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，但质膜受到严重损坏使细胞被染色。胞质环流法：胞质环流法：是否存在胞质环流胞质环流判断原生 质体活力；渗透压变化法渗透压变化法：活原生质体会随着外界渗透压的变化体积变化氧电极法氧电极法：活原生质体在光照下光合放氧，无光呼吸耗氧第50页，讲稿共51张，创作于星期三2023/4/4感谢大家观看第51页，讲稿共51张，创作于星期三