生物化学蛋白质精选PPT.ppt

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1、关于生物化学蛋白质第1页，讲稿共72张，创作于星期二一一.蛋白质的酸碱性质蛋白质的酸碱性质 各个解离基团的各个解离基团的pKpK值与游离氨基酸的值与游离氨基酸的不完全相同。短肽的等电点和净电荷量可不完全相同。短肽的等电点和净电荷量可以根据以根据pKpK值计算，值计算，蛋白质的等电点蛋白质的等电点要用等电要用等电聚焦等方法测定。聚焦等方法测定。第2页，讲稿共72张，创作于星期二二二.蛋白质分子的大小与形状蛋白质分子的大小与形状 （一）根据化学组成测定最低相对分子质量（一）根据化学组成测定最低相对分子质量 假定某种微量成分只有一个，测出其百分含假定某种微量成分只有一个，测出其百分含量后，可用比例式

2、算出最低相对分子质量。量后，可用比例式算出最低相对分子质量。若测出两种微量成分的百分含量，分别用若测出两种微量成分的百分含量，分别用比例式算出的最低相对分子质量不相同时，可比例式算出的最低相对分子质量不相同时，可计算两个最低相对分子质量近似的最小公倍数。计算两个最低相对分子质量近似的最小公倍数。第3页，讲稿共72张，创作于星期二 例题：一种纯酶含亮氨酸（例题：一种纯酶含亮氨酸（Mr 131Mr 131）1.65%1.65%，含异亮氨酸（，含异亮氨酸（Mr131Mr131）2.48%2.48%，求最低相对分子质量。，求最低相对分子质量。解：按照解：按照LeuLeu的百分含量计算，最低的百分含量计

3、算，最低Mr XMr X1 1：X X1 1=(100=(100 131)/1.65=7939.4131)/1.65=7939.4 按照按照IleIle的百分含量计算最低的百分含量计算最低Mr XMr X2 2：X X2 2=(100=(100 131)/2.48=5282.3131)/2.48=5282.3 由于由于X X1 1和和X X2 2数字差异较大，提示这种酶含数字差异较大，提示这种酶含LeuLeu和和IleIle不止不止1 1个，为个，为了估算了估算LeuLeu和和IleIle的个数，首先计算：的个数，首先计算：X X1 1/X/X2 2=7939.4/5282.31.5=7939

4、.4/5282.31.5 这种酶含任何氨基酸的个数均应是整数，说明该酶至少含有这种酶含任何氨基酸的个数均应是整数，说明该酶至少含有2 2个个LeuLeu，3 3个个IleIle，其最低相对分子质量为：，其最低相对分子质量为：7939.4 7939.4 2 2=15878.8 =15878.8 或或 5282.35282.33=15846.93=15846.9第4页，讲稿共72张，创作于星期二（二）渗（二）渗透压法测透压法测定相对分定相对分子质量子质量 第5页，讲稿共72张，创作于星期二（三（三 ）沉降）沉降分析法分析法测定相测定相对分子对分子质量质量 第6页，讲稿共72张，创作于星期二基本原理

5、：基本原理：离心力离心力（centrifugal forcecentrifugal force，FcFc）：）：当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力旋转下受到离心力作用时，此离心力“Fc”Fc”由下由下式定义：式定义：F=m*a=m*2 r F=m*a=m*2 r a a 粒子旋转的加速度，粒子旋转的加速度，m m 沉降粒子的沉降粒子的有效质量，有效质量，粒子旋转的角速度，粒子旋转的角速度，rr粒子的粒子的旋转半径旋转半径(cm)(cm)。第7页，讲稿共72张，创作于星期二 相对离心力（相对离心力（relative cen

6、trifugal relative centrifugal forceforce，RCFRCF）:由于各种离心机转子的半径或者离心管由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，因此在文献中常用因此在文献中常用“相对离心力相对离心力”或或“数字数字g”g”表示离心力表示离心力，只要，只要RCFRCF值不变，一个样品值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。可以在不同的离心机上获得相同的结果。第8页，讲稿共72张，创作于星期二G G1.11(101.11(10-5-5)Rrpm)Rrpm离心半径为离心半径为1010厘米

7、，转速为厘米，转速为80008000，其离心力为：，其离心力为：G G1.111.11*1010-5-5*1010*（80008000）7104 7104 即离心力为即离心力为7104g.7104g.而当离心力为而当离心力为8000g 8000g 时，其转速应为：时，其转速应为：84898489即约为即约为8500rpm8500rpm第9页，讲稿共72张，创作于星期二 沉降系数（沉降系数（sedimentation coefficientsedimentation coefficient，s s）：）：1924 1924年年SvedbergSvedberg对沉降系数下的定义为颗粒在单位离对沉降

8、系数下的定义为颗粒在单位离心力场中移动的速度。心力场中移动的速度。S S：沉降系数，时常在：沉降系数，时常在1010-13-13秒左右，故把沉降系数秒左右，故把沉降系数1010-13-13秒称秒称为一个为一个SvedbergSvedberg单位，简写单位，简写S S，量纲为秒。，量纲为秒。例如，动物原生质核糖体的沉降系数等于例如，动物原生质核糖体的沉降系数等于80S80S，它，它的含义就是：的含义就是：80801010-13-13s s。细胞及细胞的各组分的沉降系数。细胞及细胞的各组分的沉降系数有很大的差异，所以可以利用生物样品沉降系数的差异采用有很大的差异，所以可以利用生物样品沉降系数的差异

9、采用离心技术将他们彼此分开。离心技术将他们彼此分开。第10页，讲稿共72张，创作于星期二第11页，讲稿共72张，创作于星期二沉降法沉降法沉降法沉降法:又称超速离心法。基本原理：蛋白质分子在溶液又称超速离心法。基本原理：蛋白质分子在溶液又称超速离心法。基本原理：蛋白质分子在溶液又称超速离心法。基本原理：蛋白质分子在溶液中受到强大离心力的作用时，其密度大于溶剂而沉降。中受到强大离心力的作用时，其密度大于溶剂而沉降。中受到强大离心力的作用时，其密度大于溶剂而沉降。中受到强大离心力的作用时，其密度大于溶剂而沉降。在沉降过程中，分子量相同的蛋白质颗粒以相同的速度在沉降过程中，分子量相同的蛋白质颗粒以相同

10、的速度在沉降过程中，分子量相同的蛋白质颗粒以相同的速度在沉降过程中，分子量相同的蛋白质颗粒以相同的速度沉降，在介质中会形成一条清晰的条带，用特制的光学沉降，在介质中会形成一条清晰的条带，用特制的光学沉降，在介质中会形成一条清晰的条带，用特制的光学沉降，在介质中会形成一条清晰的条带，用特制的光学仪器扫描记录，可以显示出所有蛋白质条带位置及沉降仪器扫描记录，可以显示出所有蛋白质条带位置及沉降仪器扫描记录，可以显示出所有蛋白质条带位置及沉降仪器扫描记录，可以显示出所有蛋白质条带位置及沉降速度。物质颗粒在单位离心力场中的沉降速度为恒定值，速度。物质颗粒在单位离心力场中的沉降速度为恒定值，速度。物质颗粒

11、在单位离心力场中的沉降速度为恒定值，速度。物质颗粒在单位离心力场中的沉降速度为恒定值，称沉降系数，用称沉降系数，用称沉降系数，用称沉降系数，用S S S S表示，一个表示，一个表示，一个表示，一个S S S S单位为单位为单位为单位为11011011011013s13s13s13s。蛋白质的沉降系数蛋白质的沉降系数蛋白质的沉降系数蛋白质的沉降系数S S S S（20202020水中）大约为水中）大约为水中）大约为水中）大约为11011011011013-2001013-2001013-2001013-2001013s13s13s13s即即即即1S-200S1S-200S1S-200S1S-20

12、0S。用沉降法求出。用沉降法求出。用沉降法求出。用沉降法求出S S S S值并计算出分子量。注意。值并计算出分子量。注意。值并计算出分子量。注意。值并计算出分子量。注意。文献中经常出现以文献中经常出现以文献中经常出现以文献中经常出现以S S S S为单位描述蛋白质。为单位描述蛋白质。为单位描述蛋白质。为单位描述蛋白质。第12页，讲稿共72张，创作于星期二（四）凝胶过滤法测定相对分子质量（四）凝胶过滤法测定相对分子质量 当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒大分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔，沿凝胶颗粒

13、的间隙以较快的速度流过凝的微孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，胶柱。而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移动的速度较慢，从而使样品中各组分按相向下移动的速度较慢，从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。达到分离的目的。第13页，讲稿共72张，创作于星期二第14页，讲稿共72张，创作于星期二n n 若以组分的洗脱体积若以组分的洗脱体积若以组分的洗脱体积若以组分的洗脱体积(Ve)(Ve)(Ve)(Ve)对组分相对分子质量的对数对组分相对分子质量的对数对组分相对分子

14、质量的对数对组分相对分子质量的对数(lgMr)(lgMr)(lgMr)(lgMr)作图，可得一曲线，其中主要部分成直线关系。作图，可得一曲线，其中主要部分成直线关系。作图，可得一曲线，其中主要部分成直线关系。作图，可得一曲线，其中主要部分成直线关系。以此为标准曲线，可以通过测定某一未知组分的洗以此为标准曲线，可以通过测定某一未知组分的洗以此为标准曲线，可以通过测定某一未知组分的洗以此为标准曲线，可以通过测定某一未知组分的洗脱体积，而从标准曲线中查得其相对分子质量。脱体积，而从标准曲线中查得其相对分子质量。脱体积，而从标准曲线中查得其相对分子质量。脱体积，而从标准曲线中查得其相对分子质量。n n

15、在实际应用中多以相对洗脱体积在实际应用中多以相对洗脱体积在实际应用中多以相对洗脱体积在实际应用中多以相对洗脱体积Kav(Kav=Ve/Vt)Kav(Kav=Ve/Vt)Kav(Kav=Ve/Vt)Kav(Kav=Ve/Vt)对对对对lgMrlgMrlgMrlgMr作曲线，称为选择曲线，曲线的斜率说明凝胶的特性。作曲线，称为选择曲线，曲线的斜率说明凝胶的特性。作曲线，称为选择曲线，曲线的斜率说明凝胶的特性。作曲线，称为选择曲线，曲线的斜率说明凝胶的特性。每一类型的化合物，如球蛋白类、右旋糖酐类、酶与清蛋每一类型的化合物，如球蛋白类、右旋糖酐类、酶与清蛋每一类型的化合物，如球蛋白类、右旋糖酐类、酶

16、与清蛋每一类型的化合物，如球蛋白类、右旋糖酐类、酶与清蛋白类等都有各自特定的选择曲线。测定时，未知相对分子白类等都有各自特定的选择曲线。测定时，未知相对分子白类等都有各自特定的选择曲线。测定时，未知相对分子白类等都有各自特定的选择曲线。测定时，未知相对分子质量的组分应位于直线部分为宜。若不在直线部分，可选质量的组分应位于直线部分为宜。若不在直线部分，可选质量的组分应位于直线部分为宜。若不在直线部分，可选质量的组分应位于直线部分为宜。若不在直线部分，可选用另一种凝胶重新试验。用另一种凝胶重新试验。用另一种凝胶重新试验。用另一种凝胶重新试验。第15页，讲稿共72张，创作于星期二第16页，讲稿共72

17、张，创作于星期二（五）五）SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量 SDSSDS即十二烷基硫酸钠是阴离子去污剂即十二烷基硫酸钠是阴离子去污剂，在水溶，在水溶液中，以单体和分子团的混合形式存在，单体和分子团液中，以单体和分子团的混合形式存在，单体和分子团的浓度与的浓度与SDSSDS总浓度、离子强度及温度有关，为了使单体总浓度、离子强度及温度有关，为了使单体和蛋白质结合生成和蛋白质结合生成蛋白质蛋白质-SDS-SDS复合物复合物，需要采取低离，需要采取低离子强度，使单体浓度有所升高。在单体浓度为子强度，使单体浓度有所升高。在单体浓度为0.5m mol/L

18、0.5m mol/L以上时，蛋白质和以上时，蛋白质和SDSSDS就能结合成复合物；当就能结合成复合物；当SDSSDS单体浓度单体浓度大于大于1m mol/L1m mol/L时，与大多数蛋白质平均结合比为时，与大多数蛋白质平均结合比为1.4g SDS/g1.4g SDS/g蛋白质；在低于蛋白质；在低于0.5m mol/L0.5m mol/L浓度时，其结合比一般为浓度时，其结合比一般为0.4gSDS/g0.4gSDS/g蛋白质。蛋白质。第17页，讲稿共72张，创作于星期二n n由于由于由于由于SDSSDSSDSSDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带

19、的带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而

20、可利用MrMrMrMr差异将各种蛋白质分开。差异将各种蛋白质分开。差异将各种蛋白质分开。差异将各种蛋白质分开。n n在蛋白质溶解液中，加入在蛋白质溶解液中，加入在蛋白质溶解液中，加入在蛋白质溶解液中，加入SDSSDSSDSSDS和疏基乙醇，和疏基乙醇，和疏基乙醇，和疏基乙醇，巯基乙醇巯基乙醇巯基乙醇巯基乙醇可使可使可使可使蛋白质分子中的二硫键还原，使多肽分成单个亚单位。蛋白质分子中的二硫键还原，使多肽分成单个亚单位。蛋白质分子中的二硫键还原，使多肽分成单个亚单位。蛋白质分子中的二硫键还原，使多肽分成单个亚单位。SDSSDSSDSSDS可使蛋白质的氢键、疏水键打开，还引起蛋白质构象可使蛋白质的氢

21、键、疏水键打开，还引起蛋白质构象可使蛋白质的氢键、疏水键打开，还引起蛋白质构象可使蛋白质的氢键、疏水键打开，还引起蛋白质构象的改变。的改变。的改变。的改变。n n此复合物的流体力学和光学性质均表明，它们在水溶液此复合物的流体力学和光学性质均表明，它们在水溶液此复合物的流体力学和光学性质均表明，它们在水溶液此复合物的流体力学和光学性质均表明，它们在水溶液中的形状近似雪茄形的中的形状近似雪茄形的中的形状近似雪茄形的中的形状近似雪茄形的长椭圆棒长椭圆棒长椭圆棒长椭圆棒。不同蛋白质。不同蛋白质。不同蛋白质。不同蛋白质-SDS-SDS-SDS-SDS复合复合复合复合物的短轴相同，约物的短轴相同，约物的短

22、轴相同，约物的短轴相同，约1.8nm1.8nm1.8nm1.8nm，而长轴则与蛋白质的，而长轴则与蛋白质的，而长轴则与蛋白质的，而长轴则与蛋白质的MrMrMrMr成正成正成正成正比。比。比。比。第18页，讲稿共72张，创作于星期二 测定未知蛋白质测定未知蛋白质MrMr时，可选用相应的一组标准蛋白及时，可选用相应的一组标准蛋白及适宜的凝胶浓度，同时进行适宜的凝胶浓度，同时进行SDS-PAGESDS-PAGE，则可根据已知，则可根据已知MrMr蛋白质的蛋白质的电泳迁移率电泳迁移率和和MrMr的对数的对数作出标准曲线，再根据作出标准曲线，再根据未知蛋白质的电泳迁移率求得未知蛋白质的电泳迁移率求得Mr

23、Mr。它不仅用于蛋白质它不仅用于蛋白质MrMr测定，还可用于测定，还可用于蛋白混合组分的蛋白混合组分的分离和亚组分的分析分离和亚组分的分析，当蛋白质经，当蛋白质经SDS-PAGESDS-PAGE分离后，设分离后，设法将各种蛋白质从凝胶上洗脱下来，除去法将各种蛋白质从凝胶上洗脱下来，除去SDSSDS，还可进行，还可进行氨基酸顺序、酶解图谱及抗原性质等方面的研究。氨基酸顺序、酶解图谱及抗原性质等方面的研究。第19页，讲稿共72张，创作于星期二第20页，讲稿共72张，创作于星期二第21页，讲稿共72张，创作于星期二第22页，讲稿共72张，创作于星期二三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀三、蛋白质的胶体

24、性质与蛋白质的沉淀 （一）（一）蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质 大小在大小在1-1001-100nmnm范围内；范围内；同种电荷互相排斥；同种电荷互相排斥；质点外围有水化层。质点外围有水化层。（二）（二）蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀 1.1.盐析法盐析法 2.2.有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 3.3.重金属盐沉淀法重金属盐沉淀法 4.4.生物碱试剂和某些酸类沉淀法生物碱试剂和某些酸类沉淀法 5.5.加热变性沉淀法加热变性沉淀法第23页，讲稿共72张，创作于星期二四、蛋白质分离纯化的一般原则四、蛋白质分离纯化的一般原则 1.1.前处理前处理 要选择合适的材料要选择合适的材料;合适的破碎方法合适的破

25、碎方法;合适的提取液。合适的提取液。2.2.粗分级分离粗分级分离 要方法简便，处理量大。常用盐析、等电点沉淀要方法简便，处理量大。常用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法，有时可用超过滤或凝胶和有机溶剂分级分离等方法，有时可用超过滤或凝胶过滤等方法。过滤等方法。3.3.细分级分离细分级分离 主要使用各种层析、电泳，方法要精心选择，巧妙配主要使用各种层析、电泳，方法要精心选择，巧妙配合。后期可用结晶法。合。后期可用结晶法。第24页，讲稿共72张，创作于星期二五、蛋白质的分离纯化方法五、蛋白质的分离纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法（一）根据分子大小不同的纯化方法1.1.透析和超滤透析和

26、超滤(1)(1)透析透析 透析是把待纯化的蛋白质溶液装在透析是把待纯化的蛋白质溶液装在半透膜半透膜的透的透析袋里，放入透析液（蒸馏水或缓冲液）中进行的，析袋里，放入透析液（蒸馏水或缓冲液）中进行的，透析液可以更换，直至透析袋内无机盐等小分子物质透析液可以更换，直至透析袋内无机盐等小分子物质降到最小值为止。降到最小值为止。原理：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋原理：利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。第25页，讲稿共72张，创作于星期二第26页，讲稿共72张，创作于星期二(2).(2).超滤：超滤：利

27、用压力或离心力，强行使水和其他小利用压力或离心力，强行使水和其他小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐的目的。上，以达到浓缩和脱盐的目的。超滤是一种膜分离技术超滤是一种膜分离技术第27页，讲稿共72张，创作于星期二第28页，讲稿共72张，创作于星期二2 2.密度梯度离密度梯度离心心第29页，讲稿共72张，创作于星期二第30页，讲稿共72张，创作于星期二3.3.凝胶过滤凝胶过滤 第31页，讲稿共72张，创作于星期二(二二)利用溶解度差别的纯化方法利用溶解度差别的纯化方法1.1.等电点沉淀和等电点沉淀和pHpH控制控制 利用蛋白质在等电点

28、时溶解度最利用蛋白质在等电点时溶解度最低以及不同的蛋白质具有不同等电点低以及不同的蛋白质具有不同等电点一这特性，对蛋白质进行分离纯化的一这特性，对蛋白质进行分离纯化的方法称为方法称为等电点沉淀法等电点沉淀法。第32页，讲稿共72张，创作于星期二n n在等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，在等电点时，蛋白质分子的净电荷为零，消除了分子间的静电斥力，但由于水膜的消除了分子间的静电斥力，但由于水膜的存在，蛋白质仍有一定的溶解度而沉淀不存在，蛋白质仍有一定的溶解度而沉淀不完全，所以完全，所以等电沉淀法经常与盐析法或有等电沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用机溶剂沉淀法联合使用。n n 单独使用等电

29、点法主要是用于去除等单独使用等电点法主要是用于去除等电点相距较大的杂蛋白。在加酸或加碱调电点相距较大的杂蛋白。在加酸或加碱调节节pHpH的过程中，要的过程中，要一边搅拌一边慢慢加入一边搅拌一边慢慢加入，以防止局部过酸或过碱以防止局部过酸或过碱 。第33页，讲稿共72张，创作于星期二2.2.蛋白质的盐溶和盐析蛋白质的盐溶和盐析 定义：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度定义：一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐溶盐溶；而当盐；而当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度又随着盐浓

30、度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为称为盐析盐析作用。在同一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的作用。在同一浓度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度不同，借此可达到彼此分离的目的。溶解度不同，借此可达到彼此分离的目的。原理：盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，水原理：盐浓度增高到一定数值后，水活性降低，水化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚积并从化膜相继被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚积并从溶液中析出。溶液中析出。第34页，讲稿共72张，创作于星期二第35页，讲稿共72张，创作于星期二盐的选择：盐的选择：蛋白质的盐析通常采用中性盐，如硫酸铵

31、、硫蛋白质的盐析通常采用中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等，其中应用最广酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等，其中应用最广的是的是硫酸铵硫酸铵。硫酸铵是一中性盐，对蛋白质有相当好稳定作用。硫酸铵是一中性盐，对蛋白质有相当好稳定作用。又因为其又因为其离子容积较大，吸走水分子的能力也大离子容积较大，吸走水分子的能力也大，成为有效的盐析工具。成为有效的盐析工具。第36页，讲稿共72张，创作于星期二硫酸铵浓度的计算与调整方法硫酸铵浓度的计算与调整方法 通常硫酸銨的添加以通常硫酸銨的添加以百分饱和度百分饱和度來表示來表示 (不是不是浓度百分比浓度百分比)，例如大部分蛋白质可在，例如大部分蛋白质

32、可在80%80%硫酸銨硫酸銨饱和度下沉淀。因为硫酸銨加入的体积很大，会饱和度下沉淀。因为硫酸銨加入的体积很大，会改变最后的总体积，很难由浓度百分比來计算，改变最后的总体积，很难由浓度百分比來计算，因此使用百分饱和度作为沉淀蛋白质的度量。因此使用百分饱和度作为沉淀蛋白质的度量。第37页，讲稿共72张，创作于星期二n n用硫酸铵进行盐析时，蛋白质溶液中硫酸铵浓度的调整方法主用硫酸铵进行盐析时，蛋白质溶液中硫酸铵浓度的调整方法主用硫酸铵进行盐析时，蛋白质溶液中硫酸铵浓度的调整方法主用硫酸铵进行盐析时，蛋白质溶液中硫酸铵浓度的调整方法主要有二种要有二种要有二种要有二种 ：n n （1 1 1 1）加入

33、饱和溶液法）加入饱和溶液法）加入饱和溶液法）加入饱和溶液法n n 要求：蛋白质溶液体积不大，所需调整的硫酸铵浓度不高要求：蛋白质溶液体积不大，所需调整的硫酸铵浓度不高要求：蛋白质溶液体积不大，所需调整的硫酸铵浓度不高要求：蛋白质溶液体积不大，所需调整的硫酸铵浓度不高 n n V=V0(S2-S1)/V=V0(S2-S1)/V=V0(S2-S1)/V=V0(S2-S1)/（1-S21-S21-S21-S2）n n V:V:V:V:所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；V0:V0:V0:V0:原溶液的体积；原

34、溶液的体积；原溶液的体积；原溶液的体积；S2S2S2S2：所需达到的硫酸铵饱和度；：所需达到的硫酸铵饱和度；：所需达到的硫酸铵饱和度；：所需达到的硫酸铵饱和度；S1:S1:S1:S1:原溶液的硫酸铵饱和度。原溶液的硫酸铵饱和度。原溶液的硫酸铵饱和度。原溶液的硫酸铵饱和度。n n 饱和硫酸铵的配制方法：在一定量的水中加入过量的硫酸饱和硫酸铵的配制方法：在一定量的水中加入过量的硫酸饱和硫酸铵的配制方法：在一定量的水中加入过量的硫酸饱和硫酸铵的配制方法：在一定量的水中加入过量的硫酸铵，加热至铵，加热至铵，加热至铵，加热至5050505060606060，趁热滤去沉淀，再在，趁热滤去沉淀，再在，趁热滤

35、去沉淀，再在，趁热滤去沉淀，再在0000或室温平衡或室温平衡或室温平衡或室温平衡1 1 1 12 2 2 2天，有固体析出时达天，有固体析出时达天，有固体析出时达天，有固体析出时达100100100100饱和度。饱和度。饱和度。饱和度。第38页，讲稿共72张，创作于星期二n(2)(2)加入固体盐法加入固体盐法n 要求：饱和度高，不增大溶液体积要求：饱和度高，不增大溶液体积n t=G(S2-S1)/t=G(S2-S1)/（1-AS21-AS2）n S2S2，S1:S1:分别代表所需达到的硫酸铵饱和度和原溶分别代表所需达到的硫酸铵饱和度和原溶液的硫酸铵饱和度；液的硫酸铵饱和度；t t：将：将1L

36、S11L S1饱和度的溶液提高到饱和度的溶液提高到S2S2饱和度时所需加进的硫酸铵克数；饱和度时所需加进的硫酸铵克数；G G和和A A为常数，与温为常数，与温度有关。度有关。n 实际使用时，实际使用时，t t可直接查表得到。（注意：可直接查表得到。（注意：00，2525两张表，室温用两张表，室温用2525）第39页，讲稿共72张，创作于星期二3.pH3.pH3.pH3.pH和温度对蛋白质溶解度的影响和温度对蛋白质溶解度的影响和温度对蛋白质溶解度的影响和温度对蛋白质溶解度的影响pHpHpHpH的影响的影响的影响的影响 大多数蛋白质在等点电时，在盐溶液中的溶解度最低。大多数蛋白质在等点电时，在盐溶

37、液中的溶解度最低。大多数蛋白质在等点电时，在盐溶液中的溶解度最低。大多数蛋白质在等点电时，在盐溶液中的溶解度最低。所以盐析时溶液所以盐析时溶液所以盐析时溶液所以盐析时溶液pHpHpHpH值调到等电点效果最好。值调到等电点效果最好。值调到等电点效果最好。值调到等电点效果最好。第40页，讲稿共72张，创作于星期二温度的影响温度的影响 a.a.在低离子强度或纯水中，温度升高，溶解度增加；在低离子强度或纯水中，温度升高，溶解度增加；b.b.在高盐溶液中，温度升高，溶解度降低。在高盐溶液中，温度升高，溶解度降低。一般在室温下进行盐析，温度敏感的蛋白质在低一般在室温下进行盐析，温度敏感的蛋白质在低温温44

38、进行，也有个别酶在低温时失活，高温有活性，进行，也有个别酶在低温时失活，高温有活性，如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在2525比比00时溶解时溶解度低，更容易盐析。度低，更容易盐析。第41页，讲稿共72张，创作于星期二4.4.有机溶剂分级分离法有机溶剂分级分离法（1 1）作用机理：）作用机理：a.a.降低水溶液的介电常数，使溶质溶解度降低；降低水溶液的介电常数，使溶质溶解度降低；b.b.破坏大分子周围水膜，使溶解度降低。破坏大分子周围水膜，使溶解度降低。利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而使蛋白质分离的方法，称为

39、有机溶剂沉淀度不同而使蛋白质分离的方法，称为有机溶剂沉淀法。经常使用的有机溶剂是法。经常使用的有机溶剂是乙醇乙醇和和丙酮丙酮。第42页，讲稿共72张，创作于星期二（2 2 2 2）优点：）优点：）优点：）优点：比盐析法析出的沉淀容易过滤或离心分离，分辨比盐析法析出的沉淀容易过滤或离心分离，分辨比盐析法析出的沉淀容易过滤或离心分离，分辨比盐析法析出的沉淀容易过滤或离心分离，分辨力比盐析法好，溶剂也容易除去。力比盐析法好，溶剂也容易除去。力比盐析法好，溶剂也容易除去。力比盐析法好，溶剂也容易除去。（3 3 3 3）缺点：）缺点：）缺点：）缺点：有机溶剂沉淀法易使蛋白质和酶变性，所以操作必有机溶剂沉

40、淀法易使蛋白质和酶变性，所以操作必有机溶剂沉淀法易使蛋白质和酶变性，所以操作必有机溶剂沉淀法易使蛋白质和酶变性，所以操作必须在须在须在须在低温条件低温条件下进行。蛋白质和酶沉淀分离后，应立即下进行。蛋白质和酶沉淀分离后，应立即下进行。蛋白质和酶沉淀分离后，应立即下进行。蛋白质和酶沉淀分离后，应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度，避免变性。用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度，避免变性。用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度，避免变性。用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度，避免变性。有机溶剂沉淀法一般与等电点沉淀法联合使用。即操有机溶剂沉淀法一般与等电点沉淀法联合使用。即操有机溶剂沉淀法一般

41、与等电点沉淀法联合使用。即操有机溶剂沉淀法一般与等电点沉淀法联合使用。即操作时作时作时作时溶液的溶液的溶液的溶液的pHpHpHpH值应控制在欲分离蛋白质的等电点附近值应控制在欲分离蛋白质的等电点附近值应控制在欲分离蛋白质的等电点附近值应控制在欲分离蛋白质的等电点附近。第43页，讲稿共72张，创作于星期二第44页，讲稿共72张，创作于星期二注意：注意：注意：注意：（1)1)1)1)低温操作低温操作低温操作低温操作 （2 2 2 2）样品浓度过大，易变性，共沉淀作用大，分离效果）样品浓度过大，易变性，共沉淀作用大，分离效果）样品浓度过大，易变性，共沉淀作用大，分离效果）样品浓度过大，易变性，共沉淀

42、作用大，分离效果差；过小，易产生变性，回收率低。差；过小，易产生变性，回收率低。差；过小，易产生变性，回收率低。差；过小，易产生变性，回收率低。（3 3 3 3）样品稳定结构范围内，选择溶解度最低处的）样品稳定结构范围内，选择溶解度最低处的）样品稳定结构范围内，选择溶解度最低处的）样品稳定结构范围内，选择溶解度最低处的pHpHpHpH，即与等电点共沉淀结合使用。，即与等电点共沉淀结合使用。，即与等电点共沉淀结合使用。，即与等电点共沉淀结合使用。（4)4)4)4)注意离子强度，离子种类的影响。注意离子强度，离子种类的影响。注意离子强度，离子种类的影响。注意离子强度，离子种类的影响。第45页，讲稿

43、共72张，创作于星期二(三三)根据电荷不同的纯化方法根据电荷不同的纯化方法1.1.电泳电泳 带电颗粒在电场中泳动的速度称迁移率或泳动度带电颗粒在电场中泳动的速度称迁移率或泳动度(mobility)(mobility)，可用下式表示：，可用下式表示：U=v/E=(d/l)/(V/l)=dl/Vt U=v/E=(d/l)/(V/l)=dl/Vt 式中，式中，U(U(也可以用也可以用m m表示表示)为泳动度为泳动度(cm2/Vs)(cm2/Vs)；v v为颗粒泳动速度为颗粒泳动速度(cm/s)(cm/s)；E E为电场强度为电场强度(V/cm)(V/cm)；d d为颗粒移动的距离；为颗粒移动的距离；

44、l l为支持物的有效长度为支持物的有效长度(cm)(cm)；V V为实际电压为实际电压(V)(V)；t t为通电时间为通电时间(s(s或或min)min)。电泳。电泳后通过侧量后通过侧量V,t,d,lV,t,d,l，即可计算出被分离物质的泳动度。，即可计算出被分离物质的泳动度。泳动度与带电颗粒所带净电荷的数量，颗粒大小和形状有关。一般说，泳动度与带电颗粒所带净电荷的数量，颗粒大小和形状有关。一般说，净电荷数量愈多，颗粒愈小，净电荷数量愈多，颗粒愈小，愈接近球形，泳动度愈大。愈接近球形，泳动度愈大。被分离的球形分子在电场中所受的力被分离的球形分子在电场中所受的力(F)(F)为：为：F=EQF=E

45、Q 式中，式中，E E为电场强度，即每厘米支持物的电位降，为电场强度，即每厘米支持物的电位降，Q Q为被分离物所带净电荷。为被分离物所带净电荷。根据根据StokeStoke定律，一球形分子在液体中泳动所受的阻力定律，一球形分子在液体中泳动所受的阻力(摩擦力摩擦力)F)F为：为：F=6rvF=6rv 式中，式中，为介质粘度，为介质粘度，r r为分子半径，为分子半径，v v为分子移动速度。为分子移动速度。当平衡时：当平衡时：F=FF=F，即，即 EQ=6rvEQ=6rv v=EQ/6r U=v/E U=Q/6r v=EQ/6r U=v/E U=Q/6r 由上式可见泳动度与球形分子半径、介质粘度、颗

46、粒所带电荷有关。由上式可见泳动度与球形分子半径、介质粘度、颗粒所带电荷有关。第46页，讲稿共72张，创作于星期二2.2.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)PAGE)聚丙烯酰胺凝胶是由单体聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺丙烯酰胺(acrylamide(acrylamide，简称，简称AcrAcr)和交和交联剂联剂N N，N-N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,(methylene-bisacrylamide,简称简称Bis)Bis)在加速在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构

47、的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel(polyacrylamide gel electrophoresiselectrophoresis，简称，简称PAGEPAGE)。凝胶的聚合常用凝胶的聚合常用过硫酸铵过硫酸铵(AP)(AP)为催化剂，四甲基乙二胺为催化剂，四甲基乙二胺(TEMED)(TEMED)为加速剂。为加速剂。TEMEDTEMED的碱基可催化的碱基可催化APAP水溶液产生游离氧原子，水溶液产生游离氧原子，激活激活AcrAcr单体，使其单体，使其聚合聚合成单体长链，在成单体长链，在BisBis作用下

48、，聚合成作用下，聚合成网状凝胶网状凝胶。碱性碱性条件下凝胶易聚合，室温下条件下凝胶易聚合，室温下7.5%7.5%的凝胶在的凝胶在pH8.8pH8.8时时30min30min聚合，在聚合，在pH4.3pH4.3时约需时约需90min90min。此外，此外，核黄素核黄素亦可为催化剂，聚合需光照，故使用不多。亦可为催化剂，聚合需光照，故使用不多。第47页，讲稿共72张，创作于星期二第48页，讲稿共72张，创作于星期二 聚丙烯酰胺凝胶有下列优点：聚丙烯酰胺凝胶有下列优点：(1)(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好。(2)(2)化学性能稳定，与被分

49、离物不发生化学反应。化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应。(3)(3)对对pHpH和温度变化较稳定。和温度变化较稳定。(4)(4)几乎无电渗作用，只要几乎无电渗作用，只要AcrAcr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好。纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好。(5)(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g10-6g。(6)(6)凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节。凝胶孔径可通过选择单体及交联剂的浓度调节。(7)(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，因而较分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子

50、筛和电荷效应为一体，因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。PAGE PAGE应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定应用范围广，可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量的制备，量及少量的制备，还可测定相对分子质量、等电点等。还可测定相对分子质量、等电点等。第49页，讲稿共72张，创作于星期二3.3.等电聚焦等电聚焦 蛋白质是两性电解质，当蛋白质是两性电解质，当pHpHpIpI时带负电荷，在电场中向正极移时带负电荷，在电场中向正极移动；当动；当pHpHpIpI时带正电荷，在电场中向负极移动；当时带正电