流式细胞术原理及应用(新)精选PPT.ppt
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1、关于流式细胞术原理及应用(新)第1页,讲稿共80张,创作于星期二第2页,讲稿共80张,创作于星期二FLOWCYTOMETRY流式细胞术流式细胞术FLOWCYTOMETOR流式细胞仪流式细胞仪第3页,讲稿共80张,创作于星期二FlowCytometryMeasuringpropertiesofcellsinflowFlowSortingSorting(separating)cellsbasedonpropertiesmeasuredinflowAlsocalledFluorescence-ActivatedCellSorting(FACS)第4页,讲稿共80张,创作于星期二分为三大类:第一类台式
2、机光路调节系统固定,自动化程度高,操作简便,易学易掌握光路调节系统固定,自动化程度高,操作简便,易学易掌握,适合适合用于临床用于临床第二类大型机科研型,分辨率高,可分选用于培养,可选配多种激光器,更灵活科研型,分辨率高,可分选用于培养,可选配多种激光器,更灵活第三类新型流式细胞仪装配有装配有24根激光管,同时检测根激光管,同时检测15个参数,高速分选达个参数,高速分选达50000个个/s第5页,讲稿共80张,创作于星期二第6页,讲稿共80张,创作于星期二第7页,讲稿共80张,创作于星期二第8页,讲稿共80张,创作于星期二第9页,讲稿共80张,创作于星期二流式细胞仪的主要组成部分:第10页,讲稿
3、共80张,创作于星期二流式细胞术是20世纪70年代发展起来的一种技术,有人将流式细胞仪比流式细胞仪比喻成高级的荧光显微镜喻成高级的荧光显微镜。目前,该技术以广泛用于生物及医学基础研究与临床检测,在分子生物学、免疫学、遗传学、血液学、肿瘤学等领域内发挥着重要作用。第11页,讲稿共80张,创作于星期二流式细胞仪流式细胞仪荧光显微镜荧光显微镜控制控制电脑电脑人脑人脑光源光源激光激光紫外光紫外光标本标本制制备备成成的的单单细细胞胞(或颗粒)(或颗粒)悬液悬液放放于于固固定定的的标标本本台台上上效率效率高高几几百百几几万万个个细细胞胞/秒秒低低几十个细胞几十个细胞/分分结果结果精确、客观精确、客观有主观
4、因素有主观因素功能功能可可同同时时测测多多个个参参数数、能进行分选能进行分选一一般般只只测测一一个个参参数数、不能分选不能分选第12页,讲稿共80张,创作于星期二鞘液系统鞘液系统流动室流动室第13页,讲稿共80张,创作于星期二第14页,讲稿共80张,创作于星期二光路系统检测区第15页,讲稿共80张,创作于星期二第16页,讲稿共80张,创作于星期二第17页,讲稿共80张,创作于星期二第18页,讲稿共80张,创作于星期二第19页,讲稿共80张,创作于星期二第20页,讲稿共80张,创作于星期二光学原理光学原理laser第21页,讲稿共80张,创作于星期二第22页,讲稿共80张,创作于星期二第23页,
5、讲稿共80张,创作于星期二第24页,讲稿共80张,创作于星期二抗体标记的方法抗体标记的方法第25页,讲稿共80张,创作于星期二抗体的选择抗体的选择首选直接标记抗体首选直接标记抗体荧光分子荧光分子PE最强,适用于弱表达抗原最强,适用于弱表达抗原FITC最便宜,适用于强表达抗原最便宜,适用于强表达抗原间接标记间接标记适用范围广适用范围广,biotin-avidin不适合不适合弱抗原的检测弱抗原的检测第26页,讲稿共80张,创作于星期二数据处理系统数据处理系统第27页,讲稿共80张,创作于星期二流式细胞分析的信息流式细胞分析的信息Forwardscatter(FSC)Sidescatter(SSC)
6、FL1-FITCFL2-PEFL3-PerCPPL4-APC第28页,讲稿共80张,创作于星期二流式细胞的基本信息流式细胞的基本信息:“形态形态”第29页,讲稿共80张,创作于星期二流式细胞的主要信息流式细胞的主要信息:FluorescenceFL1FL2FL3FL4最常用的标记方法是荧光素分子标记的抗最常用的标记方法是荧光素分子标记的抗体与细胞抗原结合体与细胞抗原结合第30页,讲稿共80张,创作于星期二Gating常用术语常用术语第31页,讲稿共80张,创作于星期二流式常见图形流式常见图形(HistogramPlot)直方图适用于:单参数分析直方图适用于:单参数分析第32页,讲稿共80张,创
7、作于星期二流式常见图形流式常见图形(DotPlot)散点图适用于:多参数分析散点图适用于:多参数分析第33页,讲稿共80张,创作于星期二流式应用常见范围流式应用常见范围细胞大小细胞大小细胞的颗粒度细胞的颗粒度细胞表面分子:细胞表面分子:CD系列系列细胞浆内分子:胞内细胞因子细胞浆内分子:胞内细胞因子细胞核内分子:细胞核内分子:P53细胞功能检测:细胞周期、凋亡细胞功能检测:细胞周期、凋亡其他(膜电位、钙离子浓度、核酸等)其他(膜电位、钙离子浓度、核酸等)第34页,讲稿共80张,创作于星期二实验对照的设计实验对照的设计空白对照:空白对照:ALL阴性对照:阴性对照:常用同型抗体对照常用同型抗体对照
8、单色分析:设同型抗体对照单色分析:设同型抗体对照多色分析:同型对照,单阳性对照多色分析:同型对照,单阳性对照(用于仪器校正)(用于仪器校正)阳性对照:阳性对照:检测阴性时检测阴性时第35页,讲稿共80张,创作于星期二实验标本的处理实验标本的处理单细胞悬液的制备:单细胞悬液的制备:物理法物理法(剪碎法、(剪碎法、网搓法、研磨粉)网搓法、研磨粉)化学法化学法(酶消化)(酶消化)抗体或标记分子的染色:抗体或标记分子的染色:抗原抗体反应抗原抗体反应非特异结合的去除:非特异结合的去除:洗涤和封闭洗涤和封闭封闭封闭血清和同型抗体血清和同型抗体第36页,讲稿共80张,创作于星期二可用流式细胞仪分析的标本外周
9、血、骨髓、癌组织、癌旁组织、石蜡切片、各种体液(尿、脑脊液、胸腹水等)单细胞生物、特殊处理的植物细胞、某些非细单细胞生物、特殊处理的植物细胞、某些非细胞粒子、可溶性分子胞粒子、可溶性分子第37页,讲稿共80张,创作于星期二待测标本待测标本处理成单event悬液荧光素标记的单抗染色鞘液经处理的细胞单个通过激光聚焦区检测散射光、荧光信号转化、放大计算机数据处理分选第38页,讲稿共80张,创作于星期二SORTING(细胞分选)细胞分选)分选速度分选速度分选纯度分选纯度分选收获率分选收获率第39页,讲稿共80张,创作于星期二第40页,讲稿共80张,创作于星期二流式细胞术的应用流式细胞术的应用细胞死亡分
10、两种:凋亡和坏死细胞死亡分两种:凋亡和坏死细胞凋亡是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自细胞凋亡是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同,细胞凋亡不是主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同,细胞凋亡不是一件被动的过程,而是主动过程,它涉及一系列基因的激活、一件被动的过程,而是主动过程,它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用;它并不是病理条件下,自体损伤的表达以及调控等的作用;它并不是病理条件下,自体损伤的一种现象,而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死一种现象,而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。细胞发生凋亡时,就像树叶或花的自然
11、凋落一样,亡过程。细胞发生凋亡时,就像树叶或花的自然凋落一样,借用希腊借用希腊“Apoptosis”来表示,意思是像树叶或花的自来表示,意思是像树叶或花的自然凋落,可译为细胞凋亡。然凋落,可译为细胞凋亡。(一)凋亡的检测(一)凋亡的检测第41页,讲稿共80张,创作于星期二细胞凋亡与坏死的区别细胞凋亡与坏死的区别虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似,但它们的过程与表现却有很大差别。坏死(necrosis):坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表现为细胞胀大,胞膜破裂,细胞内容物外溢,核变化较慢,DNA降解不充分,引起局部严重的炎症反应。凋亡是细胞对环境的生理性、病理性刺激
12、信号,环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程。其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。第42页,讲稿共80张,创作于星期二细胞凋亡的生物学意义胚胎形成、肌体正常发育、衰老和损伤细胞的清除以及肿瘤的发生、发展和转归等都与细胞凋亡有关。生物医学的研究热点生物医学的研究热点第43页,讲稿共80张,创作于星期二凋亡检测凋亡检测每一步都有检测试剂盒每一步都有检测试剂盒每一步都有检测试剂盒每一步都有检测试剂盒第44页,讲稿共80张,创作于星期二1、半胱氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶3检测法(早早期)检测法(早早期)2、AnnexinV-FITC/PI法(早期)法(早期)3、Apo2.7检测法(早
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