植物花药和花粉培养PPT精选PPT.ppt

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1、关于植物花药和花粉培养PPT第1页，讲稿共46张，创作于星期二花药和花粉培养花药和花粉培养：指在合成培养基上，改变花粉的发育指在合成培养基上，改变花粉的发育途径，使其途径，使其不形成配子不形成配子，而像体细胞一样进行分裂、分，而像体细胞一样进行分裂、分化、最终化、最终发育成完整植株。发育成完整植株。该发育途径被称为该发育途径被称为“花粉孢花粉孢子体发育途径子体发育途径”或或“雄核发育雄核发育”。图9-2 小麦花药小孢子胚胎发生（引自陈耀锋，1998）9.1 植物花药和花粉培养的概念植物花药和花粉培养的概念第2页，讲稿共46张，创作于星期二花药中（或花粉）小孢子的花药中（或花粉）小孢子的雄核发育

2、雄核发育，产生植物单产生植物单倍体倍体（haploidhaploid），进而可以通过染色体加倍），进而可以通过染色体加倍产生加倍产生加倍单倍体单倍体（double haploiddouble haploid，DHDH）。）。双倍体植株单倍体胚单倍体植株第3页，讲稿共46张，创作于星期二两者的异同点两者的异同点相同点：相同点：培养目的相同，均获得培养目的相同，均获得小孢子植株。小孢子植株。不同点：不同点：（1）花药培养离体操作）花药培养离体操作技术简单，而且，药壁组技术简单，而且，药壁组织有时可作为条件因子促织有时可作为条件因子促进小孢子的发育。进小孢子的发育。辣椒花药辣椒花药吊竹花粉粒吊竹花粉

3、粒第4页，讲稿共46张，创作于星期二 花粉培养没有药壁组花粉培养没有药壁组织干扰；可计数小孢子织干扰；可计数小孢子产胚率；可观察雄核发产胚率；可观察雄核发育的全过程；单倍体产育的全过程；单倍体产量高。但技术更复杂。量高。但技术更复杂。（2）花药培养属于）花药培养属于组织组织培养培养；而花粉培养属于；而花粉培养属于细细胞培胞培 养养。辣椒花药辣椒花药吊竹花粉粒吊竹花粉粒第5页，讲稿共46张，创作于星期二9.2.1 9.2.1 花药培养花药培养 1 1）取材）取材 镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适宜的镜检，根据花粉的发育时期，选取大小适宜的花蕾。花蕾。2 2）预处理）预处理 低温（接种前低温（

4、接种前320320或接种后或接种后610610）；）；射线和激光；射线和激光；高温预处理高温预处理（接种后（接种后3235 3235 ）；等方法）；等方法 9.2 花药和花粉培养方法花药和花粉培养方法第6页，讲稿共46张，创作于星期二3 3）消毒）消毒 7070酒精擦洗花蕾表面，或酒精擦洗花蕾表面，或7070酒精浸酒精浸泡泡30-60s30-60s后在后在1 1次氯酸钠溶液中浸泡次氯酸钠溶液中浸泡10-20min10-20min或在或在0.10.1的氯化汞溶液中消毒的氯化汞溶液中消毒3-10min3-10min，无菌水冲洗，无菌水冲洗3-53-5次。次。4 4）培养）培养 固体、液体与条件培养

5、。固体、液体与条件培养。先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形成先进行脱分化培养，至小孢子大量分裂形成胚胚或或愈伤愈伤，并突破花药壁表面，形成突出物（，并突破花药壁表面，形成突出物（2-3周）；周）；后转入分化培养基培养，形成小植株。后转入分化培养基培养，形成小植株。第7页，讲稿共46张，创作于星期二 图图9-3 小麦花药愈伤组织（左）及芽、根的分化（右）（引自陈耀锋，小麦花药愈伤组织（左）及芽、根的分化（右）（引自陈耀锋，2002）图9-2 小麦花药小孢子胚胎发生（引自陈耀锋，1998）第8页，讲稿共46张，创作于星期二与花药组织培养相比，花粉培养具有以下与花药组织培养相比，花粉培养具有以下优

6、点：优点：花药培养花药培养产生的植株产生的植株并不都是起源于花粉并不都是起源于花粉，容易受药，容易受药壁、花丝、药隔等体细胞组织的影响，再生的植株中壁、花丝、药隔等体细胞组织的影响，再生的植株中会出现会出现不同倍性的个体不同倍性的个体，所以花药培养在诱导单倍体，所以花药培养在诱导单倍体方面有一定的局限性，而分离的方面有一定的局限性，而分离的花粉粒培养可以克服花粉粒培养可以克服这一不足。这一不足。由于去除了药壁和其它连接组织的干扰，因此能更好地由于去除了药壁和其它连接组织的干扰，因此能更好地调调节节控制雄核发育的控制雄核发育的各种因子各种因子，而且能直接从单细胞开，而且能直接从单细胞开始始观察整

7、个雄核发育观察整个雄核发育的过程。的过程。9.2.2 9.2.2 花粉培养花粉培养第9页，讲稿共46张，创作于星期二花粉是真正的单细胞单倍体，花粉群花粉是真正的单细胞单倍体，花粉群体的所有小孢子在培养条件下均能匀体的所有小孢子在培养条件下均能匀质地接受各种化学的、物理的因子处质地接受各种化学的、物理的因子处理，是理，是突变体筛选及外源基因导入突变体筛选及外源基因导入研究的有用材料研究的有用材料，对育种有很大的意，对育种有很大的意义。义。花粉花粉群体大群体大，一个花药中就有成千上，一个花药中就有成千上万个小孢子，从花粉培养能得到更多的万个小孢子，从花粉培养能得到更多的花粉植株。花粉植株。七叶树花

8、粉粒第10页，讲稿共46张，创作于星期二1 1）自然散落法）自然散落法(漂浮培养散落小孢子收集法漂浮培养散落小孢子收集法)将花药接种在固体或液体培养基上，待花粉自动散将花药接种在固体或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。落后，收集培养。2 2）机械游离）机械游离 挤压法挤压法 在烧杯或研钵中用玻棒等挤压花药，在烧杯或研钵中用玻棒等挤压花药，将花粉挤出后收集培养。将花粉挤出后收集培养。磁搅拌法磁搅拌法 用磁力搅拌器搅拌培养液用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，中的花药，使花粉游离出来；使花粉游离出来；9.2.2.1 9.2.2.1 花粉的分离与纯化花粉的分离与纯化 第11页，讲稿共46张，创作

9、于星期二超速旋切法超速旋切法超速旋切法超速旋切法 通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、穗子、花药，使小孢子游离出来（此法应花蕾、穗子、花药，使小孢子游离出来（此法应用最广）。用最广）。4 4）甘露醇处理法（）甘露醇处理法（0.3 mol/L0.3 mol/L甘露醇中甘露醇中甘露醇中甘露醇中2525暗培养暗培养暗培养暗培养3 34 d4 d）5 5）小孢子纯化）小孢子纯化 对上述方法获得的小孢子混合对上述方法获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子。物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子。第12页，讲稿共46张，创作于星期二 梯度离心前梯度离心前（小孢

10、子形态、活力不一致）（小孢子形态、活力不一致）30%蔗糖梯度离心后蔗糖梯度离心后（获得均一的小孢子群体）（获得均一的小孢子群体）第13页，讲稿共46张，创作于星期二9.3.2.2 9.3.2.2 花粉培养方式花粉培养方式 平板培养平板培养 花粉置琼脂固化培养基上培养。花粉置琼脂固化培养基上培养。液体培养液体培养 花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。以利通气。双层培养双层培养 花粉置固体花粉置固体-液体双层培养基上培养。培养液体双层培养基上培养。培养基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加

11、入少量液体培养基。加入少量液体培养基。预培养法预培养法 将花药在培养基上先培养将花药在培养基上先培养34 d，再将，再将花粉分离出来小三角瓶中作薄层培养。花粉分离出来小三角瓶中作薄层培养。第14页，讲稿共46张，创作于星期二微室培养微室培养 利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养微室进行花粉培养条件培养基培养条件培养基培养 利用培养过花药的液体培养基利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的培养基上培养。花药条件培或含失活花药提取物的培养基上培养。花药条件培养基、子房条件培养等。养基、子房条件培养等。看护培养看护培养 利用花药或花药愈伤组织释放出利用花

12、药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。的活性物质促进花粉小孢子发育。第15页，讲稿共46张，创作于星期二看护培养图解看护培养图解第16页，讲稿共46张，创作于星期二9.4 9.4 花药培养一步成苗花药培养一步成苗通常花药培养一般是采用脱分化、再分化和生根壮苗等几通常花药培养一般是采用脱分化、再分化和生根壮苗等几个培养程序，称为个培养程序，称为多级成苗。多级成苗。一次成苗又称一步成苗或一次成苗又称一步成苗或直接成苗，直接成苗，是指离体培养是指离体培养的花药组织的花粉细胞的花药组织的花粉细胞在一种培养基上同时完成脱分化在一种培养基上同时完成脱分化和再分化过程和再分化过程，直接分化出完

13、整植株的培养方法。，直接分化出完整植株的培养方法。图9-4 小麦花药培养一步成苗第17页，讲稿共46张，创作于星期二与多级成苗相比，一步成苗有以下几个优点：与多级成苗相比，一步成苗有以下几个优点：1）一步成苗简化了培养程序，降低了培养成本，加快了一步成苗简化了培养程序，降低了培养成本，加快了成苗速度。成苗速度。2）一步成苗提高了花药培养效率。（提高绿苗率，主要一步成苗提高了花药培养效率。（提高绿苗率，主要通过胚状体成苗）通过胚状体成苗）3）一步成苗中绿苗的质量明显提高。（生长快而健壮）一步成苗中绿苗的质量明显提高。（生长快而健壮）4）一步成苗简化了培养过程，减少了愈伤组织形成过程一步成苗简化了

14、培养过程，减少了愈伤组织形成过程中的细胞变异，有效降低了白化苗产生频率。中的细胞变异，有效降低了白化苗产生频率。第18页，讲稿共46张，创作于星期二白化苗的重要特性白化苗的重要特性:生殖生长和雌蕊的发育均不正常，不能完成有性世生殖生长和雌蕊的发育均不正常，不能完成有性世代和获得白化苗的种子，无法用这种方法证明它是代和获得白化苗的种子，无法用这种方法证明它是否是一种可遗传性状。否是一种可遗传性状。在花粉白化苗的细胞中，常发现有微核存在。在花粉白化苗的细胞中，常发现有微核存在。9.5 白化苗现象白化苗现象第19页，讲稿共46张，创作于星期二白化苗叶肉细胞的细胞质中，无正常发育的成熟白化苗叶肉细胞的

15、细胞质中，无正常发育的成熟叶绿体，只存在前质体到近乎正常叶绿体的各种叶绿体，只存在前质体到近乎正常叶绿体的各种形态的质体。形态的质体。花粉白化苗和绿苗在蛋白质、花粉白化苗和绿苗在蛋白质、RNA和和DNA的的组成上有明显差异。组成上有明显差异。花粉植株的白化现象是不可逆的，通过改变营养花粉植株的白化现象是不可逆的，通过改变营养成分或其它条件都无法使白苗转绿。成分或其它条件都无法使白苗转绿。第20页，讲稿共46张，创作于星期二9.5.1 白化苗产生的影响因素及机理白化苗产生的影响因素及机理1 1）内因）内因 供体植株基因型（如籼稻比粳稻白苗供体植株基因型（如籼稻比粳稻白苗率高）、花粉发育时期。率高

16、）、花粉发育时期。2 2）外因）外因 预处理、培养基成分、激素水平与预处理、培养基成分、激素水平与种类、培养条件和方法、愈伤组织转分化时间等。种类、培养条件和方法、愈伤组织转分化时间等。3 3）机理）机理 核基因起关键作用，导致质体核基因起关键作用，导致质体DNA缺缺失，产生白苗。另外无性系变异也可能是原因之失，产生白苗。另外无性系变异也可能是原因之一。一。第21页，讲稿共46张，创作于星期二9.5.2 9.5.2 白化苗的控制白化苗的控制通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分等因通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分等因素进行调控。素进行调控。第22页，讲稿共46张，创作于星期二1)1)胚状

17、体发育途径胚状体发育途径 小小孢孢子子经经历历胚胚发发生生的的各各个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。个阶段，最后子叶展开，形成花粉植株。9.6 花粉植株形态发生方式花粉植株形态发生方式a)a)球形胚球形胚 d)d)鱼雷形胚鱼雷形胚芸苔属小孢子培养芸苔属小孢子培养第23页，讲稿共46张，创作于星期二烟草花药培养烟草部分花药通过胚状体途径形成小植株烟草部分花药通过胚状体途径形成小植株烟草花药培养通过胚状体途径再生形成小植株烟草花药培养通过胚状体途径再生形成小植株第24页，讲稿共46张，创作于星期二2)2)愈伤组织发育愈伤组织发育途径途径 小孢子分小孢子分裂数次形成愈伤，裂数次形成愈伤，再分化形成

18、花粉再分化形成花粉植株。此途径产植株。此途径产生的植株会出现生的植株会出现变异且倍性复杂。变异且倍性复杂。水水稻稻花花药药培培养养愈伤组织转接种愈伤组织转接种到再生培养基到再生培养基愈伤组织分化形愈伤组织分化形成再生植株成再生植株接种在平板上的水稻花药接种在平板上的水稻花药部分花药产生愈伤组织部分花药产生愈伤组织第25页，讲稿共46张，创作于星期二9.7.1 9.7.1 倍性鉴定倍性鉴定(1)(1)染色体直接计数法染色体直接计数法 通常取根尖、茎尖等分生组织区进行通常取根尖、茎尖等分生组织区进行制片，直接计数染色体数目。制片，直接计数染色体数目。(2)(2)间接鉴定间接鉴定 扫描细胞光度仪鉴定

19、（流式细胞仪）扫描细胞光度仪鉴定（流式细胞仪）主要测定叶片单个细胞中主要测定叶片单个细胞中DNADNA的含量确定细的含量确定细胞的倍性，材料的使用量可少到胞的倍性，材料的使用量可少到1cm21cm2。9.7 单倍体植株鉴定和染色体加倍单倍体植株鉴定和染色体加倍第26页，讲稿共46张，创作于星期二 细胞形态学鉴定法细胞形态学鉴定法 叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。相关性。植株形态学鉴定法植株形态学鉴定法 单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，单倍体植株瘦弱，

20、叶片窄小，花小柱头长，花粉粒小，不结实。花粉粒小，不结实。第27页，讲稿共46张，创作于星期二9.7.2 染色体加倍 （为什么要进行加倍？）9.7.2.1 9.7.2.1 茎段培养茎段培养 将单倍体植株的茎段进行培养，诱导愈伤组织将单倍体植株的茎段进行培养，诱导愈伤组织形成。由于单倍体愈伤组织在培养过程中会有一定形成。由于单倍体愈伤组织在培养过程中会有一定频率的核内有丝分裂，从而形成二倍体细胞，分化频率的核内有丝分裂，从而形成二倍体细胞，分化出纯合的二倍体植株。出纯合的二倍体植株。第31页，讲稿共46张，创作于星期二有秋水仙素、有秋水仙素、OryzalinOryzalin、triflurali

21、ntrifluralin、APMAPM等。等。1)1)秋水仙素诱导秋水仙素诱导（1 1 1 1）浸入法）浸入法）浸入法）浸入法 无菌条件下以一定浓度的秋水仙素浸泡再生小无菌条件下以一定浓度的秋水仙素浸泡再生小植株、根、茎、生长点或分蘖节进行染色体加倍的方法。植株、根、茎、生长点或分蘖节进行染色体加倍的方法。（2 2 2 2）生长锥处理）生长锥处理 双子叶植物多用此种加倍方法，可用涂布、双子叶植物多用此种加倍方法，可用涂布、滴下、带药棉球处理（顶芽或腋芽）法进行加倍。滴下、带药棉球处理（顶芽或腋芽）法进行加倍。9.7.2.2 9.7.2.2 化学试剂诱变化学试剂诱变第32页，讲稿共46张，创作于

22、星期二（3）培养过程加倍法）培养过程加倍法脱分化期培养基中加入低浓度秋水仙素加倍，加倍脱分化期培养基中加入低浓度秋水仙素加倍，加倍效果都不很理想效果都不很理想在继代培养基中加入秋水仙素是加倍处理另一途在继代培养基中加入秋水仙素是加倍处理另一途径。径。（4）注射法）注射法 禾谷类作物花培单倍体苗采用分蘖节注射法可以禾谷类作物花培单倍体苗采用分蘖节注射法可以得到良好的加倍效果。这一加倍方法的加倍成功率得到良好的加倍效果。这一加倍方法的加倍成功率可达到可达到40%以上，最高可达以上，最高可达68。2)2)除草剂诱导除草剂诱导除草剂诱导除草剂诱导 （毒性小，引起植株的变异几率小）（毒性小，引起植株的变

23、异几率小）第33页，讲稿共46张，创作于星期二花药和花粉培养基本流程：预处理花药（物理或生理逆境）预处理花药（物理或生理逆境）收集具胚性小孢子的花药，或离心收集胚性小孢子收集具胚性小孢子的花药，或离心收集胚性小孢子培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体培养（充足的营养、合适的温光、或条件培养）形成胚状体胚状体转移至固化培养基上胚状体转移至固化培养基上”萌发萌发”形成小植株。形成小植株。选择合适的供体植株（选择合适的供体植株（F1？）？）倍性鉴定或染色体加倍倍性鉴定或染色体加倍第34页，讲稿共46张，创作于星期二9.2 9.2 花药或花粉培养的意义：花药或花粉培养的意义：供体植株小

24、孢子（n）花培花粉植株（n）雄核发育自然加倍人工加倍纯合植株DH（2n）一年内获得纯系9.2.1 9.2.1 作物育种作物育种（1）缩短育种周期：缩短育种周期：常规育种需常规育种需4-6年获得纯系，年获得纯系，而小而小 孢子培养仅需一年。孢子培养仅需一年。第35页，讲稿共46张，创作于星期二例子：例子：二倍体供体植株基因型为二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选，若要从后代中选择基因为择基因为AAbb的纯合单株的纯合单株常规方法常规方法：AAbb出现的概率为出现的概率为1/16，并且不能，并且不能将将AAbb与与Aabb、aAbb区分开。区分开。（2 2）提高了目标基因型的选择效率）提

25、高了目标基因型的选择效率ABaBAbabABAABBAaBBAABbAaBbaBaABBaaBBaABbaaBbAbAabBAabBAAbbAabbabaAbBaabBaAbbaabb第36页，讲稿共46张，创作于星期二二倍体供体植株基因型为二倍体供体植株基因型为AaBb，若要从后代中选择，若要从后代中选择基因为基因为AAbb的纯合单株的纯合单株单倍体方法单倍体方法：AAbb出现的概率为出现的概率为1/4。单倍体单倍体 二倍体二倍体AB-AABBaB-aaBBAb-AAbbab-aabb供体亲本供体亲本AaBb花培花培第37页，讲稿共46张，创作于星期二诱变育种中的作用诱变育种中的作用 植株不

26、受显隐性的影响，植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能在当代及时获得突变个体，加倍在诱变育种中能在当代及时获得突变个体，加倍后成为稳定的纯系。后成为稳定的纯系。9.2.2 9.2.2 物种进化研究物种进化研究 可探索亲本染色体组的构可探索亲本染色体组的构成。分析单倍体植物减数分裂时，形成二价体的数目成。分析单倍体植物减数分裂时，形成二价体的数目和形状，能确定染色体组内是否存在同源染色体。和形状，能确定染色体组内是否存在同源染色体。第38页，讲稿共46张，创作于星期二9.2.3 9.2.3 遗传分析遗传分析 单倍体植株中基因不受显隐性单倍体植株中基因不受显隐性的影响，每一个基因的作用均能表现出来。能用的影响，每一个基因的作用均能表现出来。能用来研究基因的性质及其作用。还可用于基因的剂来研究基因的性质及其作用。还可用于基因的剂量效应分析。量效应分析。9.2.4 9.2.4 构建连锁图谱构建连锁图谱 双单倍体（双单倍体（DHDH）群体是永）群体是永久性群体，能有效地用于遗传图谱的构建。久性群体，能有效地用于遗传图谱的构建。9.2.5 9.2.5 用于遗传转化用于遗传转化 能直接表达外源基因，不受能直接表达外源基因，不受显隐性影响。显隐性影响。第39页，讲稿共46张，创作于星期二2023/4/3感谢大家观看第46页，讲稿共46张，创作于星期二