自然选育和诱变育种精选PPT.ppt

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1、关于自然选育和诱变育种第1页，讲稿共65张，创作于星期三第四章自然选育和诱变育种第2页，讲稿共65张，创作于星期三菌种菌种选育选育经验经验育种育种定向定向育种育种自然自然选育选育诱变诱变育种育种杂交杂交育种育种分子分子育种育种主要通过突主要通过突变和筛选来变和筛选来育种育种常规的杂常规的杂交育种交育种原生质原生质体融合体融合通过通过DNADNA重重组技术来组技术来育种育种第3页，讲稿共65张，创作于星期三第一节第一节自然选育自然选育自自然然选选育育：不不经经人人工工处处理理，利利用用微微生生物物的自然突变进行菌种选育的过程的自然突变进行菌种选育的过程一、引起自然选育的因素一、引起自然选育的因素

2、1、低剂量的诱变效应、低剂量的诱变效应2、互变异构效应、互变异构效应第4页，讲稿共65张，创作于星期三基因突变基因突变第5页，讲稿共65张，创作于星期三二、微生物突变的类型二、微生物突变的类型1、形态突变型2、致死突变型3、抗性突变型4、营养缺陷型突变型 青霉青霉青霉青霉第6页，讲稿共65张，创作于星期三三、微生物突变的特点三、微生物突变的特点1 1、不对应性不对应性2 2、自发性自发性3 3、稀有性稀有性4 4、独立性独立性5 5、诱变性诱变性6 6、稳定性稳定性7 7、可逆性可逆性 第7页，讲稿共65张，创作于星期三稀释法稀释法（四）、自然选育的程序1.采样2.增殖培养3.纯种分离4.生产

3、性能的测定 划线法划线法第8页，讲稿共65张，创作于星期三第二节、第二节、诱变育种诱变育种一一概念：概念：诱诱变变育育种种是是利利用用各各种种诱诱变变剂剂处处理理微微生生物物细细胞胞，提提高高基基因因突突变变频频率率，再再通通过过适适当当的的筛筛选选方方法法获得高产优质菌种的育种方法。获得高产优质菌种的育种方法。第9页，讲稿共65张，创作于星期三二二诱变育种的原理诱变育种的原理基基因因突突变变:染染色色体体畸畸变变和和点突变。点突变。染染色色体体畸畸变变：指指的的是是染染色色体体或或DNA片片段段发发生生缺缺失失、易易位位、逆逆位、重复等。位、重复等。点突变：指的是点突变：指的是DNA中的碱基

4、发生中的碱基发生变化。变化。第10页，讲稿共65张，创作于星期三三、常用的诱变剂种类三、常用的诱变剂种类1 1、物理诱变剂：紫外线、快中子、物理诱变剂：紫外线、快中子 2 2、化学诱变剂：、化学诱变剂：5 5BUBU（5-5-溴尿嘧啶）溴尿嘧啶）硫酸二乙酯，亚硝基胍硫酸二乙酯，亚硝基胍3 3、生物诱变剂：噬菌体、生物诱变剂：噬菌体第11页，讲稿共65张，创作于星期三3、使用方法：单一诱变剂处理:复合诱变剂处理：第12页，讲稿共65张，创作于星期三诱变育种中还常常采取诱变剂复合处理，使它们产生协同效应。诱变育种中还常常采取诱变剂复合处理，使它们产生协同效应。第13页，讲稿共65张，创作于星期三

5、四四、常用诱变、常用诱变剂的具体使用方剂的具体使用方法：法：1 1、紫外线：紫外线：第14页，讲稿共65张，创作于星期三A A、诱诱变变处处理理前前，先先开开紫紫外外灯灯预预热热2020分分钟钟，使光波稳定。使光波稳定。B B、将将3 35ml5ml细细胞胞悬悬浮浮液液置置于于培培养养皿皿,于于诱诱变变箱箱内内的的电电磁磁搅搅拌拌器器上上，照照射射3 35 5分分钟，进行表面杀菌。钟，进行表面杀菌。C C、打打开开培培养养皿皿盖盖，开开启启电电磁磁搅搅拌拌器器，边边照射边搅拌。照射边搅拌。D、处理一定时间后，在红外灯下，吸取一定量菌液，经稀释后，取0.2毫升涂平板。第15页，讲稿共65张，创作

6、于星期三2.5-溴尿嘧啶溴尿嘧啶：A、称称取取5-溴溴尿尿嘧嘧啶啶，加加入入无无菌菌生生理理盐盐水水微热溶解，使浓度为微热溶解，使浓度为2mg/ml。B、将将细细胞胞培培养养至至对对数数期期并并重重悬悬于于缓缓冲冲液液或生理盐水中过夜。或生理盐水中过夜。C、将将5-溴溴尿尿嘧嘧啶啶加加入入培培养养基基内内，一一般般为为1020微克微克/ml，倒平板。，倒平板。D、涂涂布布菌菌液液，在在生生长长中中诱诱变变，挑挑单单菌菌落落进行测定。进行测定。第16页，讲稿共65张，创作于星期三五、诱变育种的一般程序第17页，讲稿共65张，创作于星期三出发菌株出发菌株菌种纯化菌种纯化同步培养同步培养制备单孢子悬

7、浮液制备单孢子悬浮液诱变剂处理诱变剂处理平板分离平板分离挑选疑似突变菌落纯培养挑选疑似突变菌落纯培养突变体的初步筛选突变体的初步筛选重复筛选重复筛选选出突变体选出突变体第18页，讲稿共65张，创作于星期三1、同步培养、同步培养诱诱变变处处理理前前，菌菌悬悬液液的的细细胞胞应应尽尽可可能能达达到到同同步步生生长长状状态态，培培养养出出生理活性一致的细胞。生理活性一致的细胞。同步生长细胞的培养就及其收集第19页，讲稿共65张，创作于星期三第20页，讲稿共65张，创作于星期三2.孢子或菌体悬浮液的制备孢子或菌体悬浮液的制备用用生生理理盐盐水水或或缓缓冲冲溶溶液液配配制制，先先用用无无菌菌的的玻玻璃珠

8、振荡分开，再用脱脂棉过滤。璃珠振荡分开，再用脱脂棉过滤。第21页，讲稿共65张，创作于星期三3变异菌株的初步筛选变异菌株的初步筛选1）利用形态突变直接淘汰低产变异菌株。）利用形态突变直接淘汰低产变异菌株。2）利用平皿反应直接挑取高产变异菌株。）利用平皿反应直接挑取高产变异菌株。第22页，讲稿共65张，创作于星期三饱浸含某种指示剂饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤的固体培养基的滤纸片变色圈纸片变色圈 指示剂直接掺入或喷洒固体培养指示剂直接掺入或喷洒固体培养基，菌落周围形成变色圈。如淀基，菌落周围形成变色圈。如淀粉的平皿上喷上稀碘液粉的平皿上喷上稀碘液 固体培养基中渗入溶解性差、固体培养基中渗入溶解

9、性差、可被特定菌利用的营养成分，可被特定菌利用的营养成分，造成不透明的培养基背景。造成不透明的培养基背景。菌落利用此物质形成透明圈。菌落利用此物质形成透明圈。利用一些有特别营养要求利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，如的微生物作为工具菌，如待筛选菌具有该营养物的待筛选菌具有该营养物的前体转化成营养物前体转化成营养物 能力，能力，工具菌就能围绕该菌生长工具菌就能围绕该菌生长 待筛选的菌株能分泌待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具产生某些能抑制工具菌生长的物质菌生长的物质 第23页，讲稿共65张，创作于星期三第第三三节节营营养养缺缺陷陷型型突突变变体体的的筛筛选选及及应应用用一一、营营养养缺

10、缺陷陷型型：指指通通过过诱诱变变而而产产生生的的丧丧失失了了合合成成某某种种营营养养物物质质的的能能力力，必必须须在在基基本本培培养养基基中中加加入入相相应应缺缺陷陷的的物物质质才才能能正正常常生生长的变异菌株。长的变异菌株。第24页，讲稿共65张，创作于星期三二、筛选营养缺陷型的培养基二、筛选营养缺陷型的培养基：基基本本培培养养基基-:凡凡是是能能满满足足某某种种野野生生菌菌株株营养要求最低成分的合成培养基。营养要求最低成分的合成培养基。完完全全培培养养基基:凡凡能能满满足足一一切切营营养养缺缺陷陷株株营营养养需要的培养基需要的培养基+。第25页，讲稿共65张，创作于星期三补补充充培培养养基

11、基A：只只能能满满足足相相应应的的营营养养缺缺陷型生长需要的组合培养基。陷型生长需要的组合培养基。第26页，讲稿共65张，创作于星期三三、营养缺陷型菌株筛选的一般方法三、营养缺陷型菌株筛选的一般方法1.诱变处理诱变处理2.淘汰野生型淘汰野生型第27页，讲稿共65张，创作于星期三A、抗菌素法:将抗生素加入到基本培养基中，杀死生长野生型菌株，浓缩营养缺陷型。用加有青霉素的基本培养基分用加有青霉素的基本培养基分离培养诱变处理后的菌体，离培养诱变处理后的菌体，野生型菌株因为繁殖产生的野生型菌株因为繁殖产生的子细胞不能合成正常细胞壁子细胞不能合成正常细胞壁而死亡，而对不能繁殖的营而死亡，而对不能繁殖的营

12、养缺陷型细胞因为在基本培养缺陷型细胞因为在基本培养基中不能繁殖而得以保留。养基中不能繁殖而得以保留。第28页，讲稿共65张，创作于星期三酵母菌：用加有制霉菌素基本培养基分离培养诱变处理后的菌体，制霉菌素抑制真菌细胞壁中甾醇合成，从而使繁殖中的细胞产生的子细胞死亡，保留营养缺陷型细胞。第29页，讲稿共65张，创作于星期三B、菌丝过滤法、菌丝过滤法:诱诱变变后后的的孢孢子子在在中中培培养养一一段段时时间间后后过过滤滤，去去除除大部分野生型菌株，浓缩营养缺陷型大部分野生型菌株，浓缩营养缺陷型 。Sartorius正压式过滤器正压式过滤器 真菌和放线菌等真菌和放线菌等真菌和放线菌等真菌和放线菌等丝状菌

13、丝状菌丝状菌丝状菌的野生型菌株在的野生型菌株在基本培养基基本培养基中产生中产生菌丝体菌丝体，而营养缺陷型菌株以，而营养缺陷型菌株以孢子孢子形形式存在，不能萌发。把诱变处理后的孢子悬液用液式存在，不能萌发。把诱变处理后的孢子悬液用液体基本培养基培养，适温振荡培养，使野生型孢子体基本培养基培养，适温振荡培养，使野生型孢子萌发形成菌丝体，用萌发形成菌丝体，用灭菌脱脂棉、滤纸等除去菌灭菌脱脂棉、滤纸等除去菌丝体丝体，再培养，再过滤。重复，再培养，再过滤。重复3 34 4次，最大限次，最大限度地除去野生型菌株，然后再分离度地除去野生型菌株，然后再分离第30页，讲稿共65张，创作于星期三三、检出所需缺陷型

14、三、检出所需缺陷型 逐个检出法逐个检出法 经经诱诱变变处处理理后后的的细细胞胞涂涂布布在在平平板板上上，待待长长出出单单个个菌菌落落后后，用用接接种种针针将将这这些些单单个个菌菌落落逐逐个个依依次次地地分分别别接接种种到到基基本本培培养养基基和和另另一一完完全全培培养养基基 。经经培培养养后后，如如果果在在完完全全培培养养基基上上的的某某一一部部位位上上出出现现菌菌落落，而而在在基基本本培培养养基基上上却却不不长长菌菌 ，说说明明这这是是一一个营养缺陷型。个营养缺陷型。第31页，讲稿共65张，创作于星期三三、检出所需缺陷型三、检出所需缺陷型 影印培养法影印培养法 将长出菌落的平皿开口朝下，在丝

15、绒布上轻轻地印将长出菌落的平皿开口朝下，在丝绒布上轻轻地印一下，把此皿上的全部菌落转印到另一基本培养基一下，把此皿上的全部菌落转印到另一基本培养基平板上。经培养后，比较这两个平皿上长出的菌落，平板上。经培养后，比较这两个平皿上长出的菌落，如果发现前一平皿上某一部位长有菌落，而在后一如果发现前一平皿上某一部位长有菌落，而在后一培养基的相应部位上却没有，说明这就是一个营养培养基的相应部位上却没有，说明这就是一个营养缺陷型。缺陷型。第32页，讲稿共65张，创作于星期三第33页，讲稿共65张，创作于星期三一般从菌落大小也可以一般从菌落大小也可以判断，新长出的菌落较判断，新长出的菌落较小，即是营养缺陷型

16、小，即是营养缺陷型 夹层培养法 A A、夹夹层层培培养养法法:先先在在培培养养皿皿中中倒倒一一薄薄层层不不含含菌菌的的基基本本培培养养基基，待待冷冷凝凝后后加加上上一一层层含含诱诱变变处处理理菌菌液液的的基基本本培培养养基基，其其上上再再浇浇一一薄薄层层不不含含菌菌的的基基本本培培养养基基。经经培培养养后后在在培培养养皿皿底底用用笔笔对对首首次次出出现现的的菌菌落落作作记记号号，然然后后再再在在其其上上倒倒一一薄薄层层完完全全培培养养基基。再再经经培培养养后后所所出出现现的的新菌落，多数为营养缺陷型。新菌落，多数为营养缺陷型。第34页，讲稿共65张，创作于星期三四四.鉴定营养缺陷型鉴定营养缺陷

17、型生长谱法生长谱法第35页，讲稿共65张，创作于星期三方法一：把纯化好的缺陷型菌株与基本培养基方法一：把纯化好的缺陷型菌株与基本培养基倒混倒混 合平板或涂布平板，再在平板上点接各种合平板或涂布平板，再在平板上点接各种营养物质（最好稀释成一定浓度，用滤纸片法营养物质（最好稀释成一定浓度，用滤纸片法接入），适温培养，观察生长圈。此法可以在接入），适温培养，观察生长圈。此法可以在一个平板上对一株菌进行多种营养因子进行测一个平板上对一株菌进行多种营养因子进行测定定 方法二：在基本培养基中加入某种营养物质，方法二：在基本培养基中加入某种营养物质，倒混合平板，再点接菌株，观察生长圈。此法可同倒混合平板，再

18、点接菌株，观察生长圈。此法可同时对多个菌株进行测定时对多个菌株进行测定第36页，讲稿共65张，创作于星期三第37页，讲稿共65张，创作于星期三五、营养缺陷型突变株的应用1.工业微生物育种中，用于积累代谢中间产物2.作为杂交、重组育种的遗传标记3.用于微生物代谢途径研究4.在转化、转导、原生质体融合、质粒和转座子研究中用作标记菌株第38页，讲稿共65张，创作于星期三营养缺陷型的应用实例营养缺陷型的应用实例 利用营养缺陷型突变株来生产氨基酸和核苷酸是典型的例子利用营养缺陷型突变株来生产氨基酸和核苷酸是典型的例子 第39页，讲稿共65张，创作于星期三天冬氨酸激酶天冬氨酸激酶(AK)(AK)被赖氨酸及

19、苏氨酸协同反馈所抑制被赖氨酸及苏氨酸协同反馈所抑制 通过诱变处理，获得高丝氨酸缺陷型突变菌株，该突变通过诱变处理，获得高丝氨酸缺陷型突变菌株，该突变型不能产生苏氨酸。型不能产生苏氨酸。在限量高丝氨酸的培养基中缺陷型菌株能够正常生长，并且在限量高丝氨酸的培养基中缺陷型菌株能够正常生长，并且因为消除了反馈抑制因为消除了反馈抑制 突变型能过量生产突变型能过量生产L-L-赖氨酸赖氨酸 第40页，讲稿共65张，创作于星期三第四节第四节 温度敏感突变株的筛选温度敏感突变株的筛选一、温度敏感突变株（一、温度敏感突变株（temperature-sensitivemutant,TS突变体）：突变体）：突变株在一

20、定温度范围内（许可温度）正突变株在一定温度范围内（许可温度）正常生长，其表型和野生型没有区别，但超常生长，其表型和野生型没有区别，但超出这一温度范围（非许可温度），则不能出这一温度范围（非许可温度），则不能生长或生长微弱甚至死亡（条件致死）或生长或生长微弱甚至死亡（条件致死）或某些代谢停止或减弱。某些代谢停止或减弱。第41页，讲稿共65张，创作于星期三二、二、TS突变的原理突变的原理TSTS突变主要是由必需基因发生突变，致突变主要是由必需基因发生突变，致使该基因在一定温度条件下无法正常表使该基因在一定温度条件下无法正常表达，或其编码的酶失活，造成细胞不能达，或其编码的酶失活，造成细胞不能正常生

21、长。正常生长。第42页，讲稿共65张，创作于星期三三、三、TS TS突变株的选育方法突变株的选育方法（一）（一）TS TS突变株的诱发突变株的诱发 TSTS突变主要由基因错义突变所致，要选择突变主要由基因错义突变所致，要选择易于引起碱基置换的亚硝基类、磺酸酯类易于引起碱基置换的亚硝基类、磺酸酯类化合物，或亚硝酸、化合物，或亚硝酸、UVUV等诱变剂。等诱变剂。（二）（二）淘汰野生型菌株淘汰野生型菌株/TS/TS菌株富集培养菌株富集培养 抗生素法：加入抗生素，在非许可温度下抗生素法：加入抗生素，在非许可温度下培养一定时间，杀灭在该温度下生长的野培养一定时间，杀灭在该温度下生长的野生型菌株，再离心除

22、去抗生素，分离生型菌株，再离心除去抗生素，分离第43页，讲稿共65张，创作于星期三四、TS突变株分离筛选富集培养后，用完全培养基先在许可温度下培养，富集培养后，用完全培养基先在许可温度下培养，再用影印法、点植法等方法在许可温度和非许可温度再用影印法、点植法等方法在许可温度和非许可温度下分别培养，对照结果即可检出下分别培养，对照结果即可检出 TSTS突变体；突变体；也可同一平板先在非许可温度培养，长出野生型菌株，也可同一平板先在非许可温度培养，长出野生型菌株，做好记号，再转许可温度培养，则后长出的为做好记号，再转许可温度培养，则后长出的为TSTS菌株。菌株。第44页，讲稿共65张，创作于星期三五

23、、五、TS突变株在发酵工业中应用突变株在发酵工业中应用1 1、在谷氨酸发酵中的应用在谷氨酸发酵中的应用 增加谷氨酸产量的关键在于改变菌体的细胞膜结构和功增加谷氨酸产量的关键在于改变菌体的细胞膜结构和功能，通过一些有效方法使谷氨酸产生菌由谷氨酸非积累能，通过一些有效方法使谷氨酸产生菌由谷氨酸非积累型转变为积累型。型转变为积累型。如：以乳糖发酵杆菌如：以乳糖发酵杆菌NO2256NO2256为出发菌株，选育出细胞膜结为出发菌株，选育出细胞膜结构或功能缺损的构或功能缺损的TSTS突变株突变株8888号，通过温度来调节细胞膜号，通过温度来调节细胞膜透性。当在许可温度透性。当在许可温度(30(30)下培养

24、繁殖得到一定量菌下培养繁殖得到一定量菌体后，升温致非许可温度体后，升温致非许可温度(37(37)培养，使细胞膜的合培养，使细胞膜的合成、结构或功能发生障碍，结果突变株能在高浓度生成、结构或功能发生障碍，结果突变株能在高浓度生物素培养基中分泌大量谷氨酸。物素培养基中分泌大量谷氨酸。第45页，讲稿共65张，创作于星期三2、TS突变株在丝氨酸发酵中的应用以C1化合物为唯一碳源的微生物合成细胞组分是通过丝氨酸途径来实现的。要提高丝氨酸产量，关键在于阻断丝氨酸降解。日本味之素公司的Moringga筛选到TS突变株，它们在30丝氨酸降解正常，但在3840失去降解丝氨酸的能力，因而大量分泌丝氨酸第46页，讲

25、稿共65张，创作于星期三第五节 诱变育种实例 第47页，讲稿共65张，创作于星期三一、产环己酰亚胺新菌株YIM41004的复合诱变选育 前言：环己酰亚胺（前言：环己酰亚胺（cycloheximidecycloheximide）,又名放线酮又名放线酮（ActidioneActidione），是于），是于19481948年德国化学家年德国化学家B.E.LeachB.E.Leach等分等分离并鉴定出来的一种戊二酰类化合物离并鉴定出来的一种戊二酰类化合物.它对多种真菌具它对多种真菌具有拮抗作用，其制剂具有水溶解性良好、作用剂量低的优有拮抗作用，其制剂具有水溶解性良好、作用剂量低的优点点,在植物保护方面

26、得到广泛应用。在植物保护方面得到广泛应用。云南大学省微生物研究所云南大学省微生物研究所 教育部微生物资源重点实验教育部微生物资源重点实验室）发现一株产生具有产生环己酰亚胺类化合物的放室）发现一株产生具有产生环己酰亚胺类化合物的放线菌新种线菌新种Streptomyces yunnanensisStreptomyces yunnanensis,典型菌株为典型菌株为YIM41004YIM41004第48页，讲稿共65张，创作于星期三（一）产环己酰亚胺新菌株产环己酰亚胺新菌株YIM41004的复合诱变选育的复合诱变选育 为了选育出活性物质为了选育出活性物质产量高、遗传性状稳定、培养要求产量高、遗传性状

27、稳定、培养要求低、工艺简单低、工艺简单的优良菌株的优良菌株,作者采用紫外线（作者采用紫外线（UVUV）、）、亚硝基胍（亚硝基胍（NTGNTG）、）、UV+LiClUV+LiCl和和6060CoCo对对YIM41004YIM41004进行进行了复合诱变研究了复合诱变研究。经过八代诱变育种，。经过八代诱变育种，到一株生产特性和生长特性均有所改善的变异菌株到一株生产特性和生长特性均有所改善的变异菌株F8-F8-439.439.第49页，讲稿共65张，创作于星期三（二）孢子悬液预培养（二）孢子悬液预培养 用种子培养基刮洗下用种子培养基刮洗下57d57d成熟斜面孢子，并稀释到成熟斜面孢子，并稀释到1 1

28、千千万至万至1 1亿个孢子每毫升，置于亿个孢子每毫升，置于50mL50mL带玻璃珠和搅拌子带玻璃珠和搅拌子的三角瓶中，的三角瓶中，2828磁力搅拌培养到大多数孢子开始萌发磁力搅拌培养到大多数孢子开始萌发（约（约34h).34h).6060CoCo诱变时不做预培养诱变时不做预培养.第50页，讲稿共65张，创作于星期三（三）诱变处理方法诱变处理方法1UV1UV诱变诱变一切操作在红光下或避光进行一切操作在红光下或避光进行.取经预培养的取经预培养的孢子悬液孢子悬液8mL8mL于直径于直径9cm9cm带搅拌子平皿中，在诱变箱带搅拌子平皿中，在诱变箱中中(提前开紫外灯提前开紫外灯0.5h)0.5h)磁力搅

29、拌，磁力搅拌，15W30cm15W30cm照射一定照射一定时间时间.收集于试管中，冰水浴收集于试管中，冰水浴2h2h，钝化修复酶，钝化修复酶.涂布基础涂布基础培养基分离平板，培养基分离平板，2828避光培养避光培养23d.23d.第51页，讲稿共65张，创作于星期三2 2、亚硝基胍（亚硝基胍（NTGNTG）诱变）诱变于通风橱中准确称量于通风橱中准确称量NTGNTG，加助溶剂甲酰胺或丙酮少许（加助溶剂甲酰胺或丙酮少许（12mL12mL）,用用pH6.0pH6.0磷酸磷酸缓冲液溶解成缓冲液溶解成1mgmL-11mgmL-1，保存于棕色瓶中，保存于棕色瓶中.NTG.NTG不用不用灭菌，现配现用灭菌，

30、现配现用.采用混合平板涂菌法：先倒好含采用混合平板涂菌法：先倒好含525gmL-1NAG525gmL-1NAG的混合平板的混合平板,再用预培养好的孢子悬再用预培养好的孢子悬液涂布分离平板，液涂布分离平板，2828避光培养避光培养34d.34d.第52页，讲稿共65张，创作于星期三3 36060CoCo诱变诱变每支试管中装每支试管中装3mL3mL用生理盐水稀释到用生理盐水稀释到106107106107孢子孢子/mL/mL的孢子悬液，整个过程置于装有冰水的烧杯中，的孢子悬液，整个过程置于装有冰水的烧杯中，照射剂量以处理总剂量计算照射剂量以处理总剂量计算.第53页，讲稿共65张，创作于星期三 4UV

31、+LiCl4UV+LiCl复合诱变复合诱变 孢子悬液按孢子悬液按UVUV诱变常规处理后涂诱变常规处理后涂布于含布于含0.11.0%LiCl(W/V)0.11.0%LiCl(W/V)的分离平板上，的分离平板上，2828培养培养34d.34d.第54页，讲稿共65张，创作于星期三（三）筛选步骤1预筛1 1琼脂块法预筛琼脂块法预筛 琼脂块制备琼脂块制备:在直径在直径9cm9cm平皿中定量加入平皿中定量加入30mL30mL基础培养基基础培养基,冷却凝固冷却凝固后用直径后用直径6mm6mm打孔器打好琼脂块，然后用竹签把琼脂块移至直打孔器打好琼脂块，然后用竹签把琼脂块移至直径径9cm9cm空平皿中空平皿中

32、单菌落点接琼脂块和培养单菌落点接琼脂块和培养:挑取挑取 型菌落，或形态变异明显的菌落，型菌落，或形态变异明显的菌落，点接到琼脂块上点接到琼脂块上.每次诱变最少挑每次诱变最少挑200200株株.把以上平皿置于保湿盒内，把以上平皿置于保湿盒内，2828培养培养2d2d，使活性物质积累于琼脂块中，使活性物质积累于琼脂块中;琼脂块生测琼脂块生测:把培养好的琼脂块移到生测平板上，把培养好的琼脂块移到生测平板上，2828培养培养2d,2d,测测量抑菌圈直径量抑菌圈直径.每生测平板挑取抑菌圈最大的菌落每生测平板挑取抑菌圈最大的菌落2323个，接个，接种斜面种斜面,每次诱变最少挑每次诱变最少挑5050株株.第

33、55页，讲稿共65张，创作于星期三（三）筛选步骤2 2小瓶发酵初筛小瓶发酵初筛预筛所得菌株斜面培养预筛所得菌株斜面培养57d57d，待孢子成熟，待孢子成熟，刮取约刮取约1/41/4斜面孢子，接种于装有斜面孢子，接种于装有20mL20mL发酵培养基的发酵培养基的250mL250mL三角瓶中，三角瓶中，200r/min200r/min，2828培养培养96h.96h.发酵液发酵液4 4000r/min000r/min离心离心10min10min，取，取40L40L上清液用杯碟法生测上清液用杯碟法生测初筛出抑菌圈最大的初筛出抑菌圈最大的2020株用于复筛和菌种保藏株用于复筛和菌种保藏.第56页，讲稿

34、共65张，创作于星期三（三）筛选步骤3复筛3 3大瓶复发酵复筛大瓶复发酵复筛用初筛出的用初筛出的5858株菌成熟斜面孢子接种株菌成熟斜面孢子接种于装有于装有100mL100mL种子培养基的种子培养基的500mL500mL三角瓶，三角瓶，200r/min200r/min，2828培养培养48h48h，得种子液，得种子液.取种子液取种子液10mL10mL接种于装接种于装有有80mL80mL发酵培养基的发酵培养基的500mL500mL三角瓶中，三角瓶中，200r/min200r/min，2828培养培养96h.96h.复发酵复筛复发酵复筛3 3批次，每次每株重复接种批次，每次每株重复接种3 3瓶瓶.

35、发酵液用发酵液用HPLCHPLC法测定发酵液放线酮含量，筛选出法测定发酵液放线酮含量，筛选出2424株产量高的变异菌株用于下一轮诱变处理和菌种保藏株产量高的变异菌株用于下一轮诱变处理和菌种保藏.第57页，讲稿共65张，创作于星期三（四）测定方法测定方法1 1 1指示菌平板生物活性测定法（生测）指示菌平板生物活性测定法（生测）指示菌：用放线酮敏感菌株赭色掷孢酵母菌（指示菌：用放线酮敏感菌株赭色掷孢酵母菌（Sporolomyces Sporolomyces salmonicolorsalmonicolor）.生测平板生测平板制备：制备：用直径用直径20cm20cm平皿平皿.下层：下层：水琼脂水琼脂

36、100mL100mL（含（含2 2 琼脂）琼脂）；上层：取新鲜酵母菌斜面；上层：取新鲜酵母菌斜面1 1支，用支，用5mL5mL生理盐水刮洗下菌体，生理盐水刮洗下菌体，倒入已熔化并冷却到倒入已熔化并冷却到45504550的的80mL80mL指示菌培养基中，摇匀，指示菌培养基中，摇匀，迅速倒入平皿中迅速倒入平皿中.冷却后用于生测，现制现用冷却后用于生测，现制现用.第58页，讲稿共65张，创作于星期三（四）测定方法测定方法22HPLC2HPLC法法复筛时菌株发酵液用浓硫酸调酸至复筛时菌株发酵液用浓硫酸调酸至pH23pH23，摇匀后静置，摇匀后静置30min,4000r/min30min,4000r/

37、min离心离心10min.10min.上清液上清液用用2 2倍体积氯仿萃取倍体积氯仿萃取2 2次，有机相合并蒸干，甲醇洗次，有机相合并蒸干，甲醇洗脱并定容，用脱并定容，用HPLCHPLC法测定放线酮含量法测定放线酮含量.含量根据色谱峰含量根据色谱峰面积与标准品的峰面积对比进行计算面积与标准品的峰面积对比进行计算.第59页，讲稿共65张，创作于星期三（五）诱变剂量的确定诱变剂量的确定为确定各诱变剂合适的处理剂量，每一种诱变剂设置了为确定各诱变剂合适的处理剂量，每一种诱变剂设置了一系列不同的处理剂量，对孢子悬液按诱变处理操作进行处一系列不同的处理剂量，对孢子悬液按诱变处理操作进行处理，平板分离后统

38、计致死率。由于实验菌株理，平板分离后统计致死率。由于实验菌株YIM41004YIM41004为初次为初次受诱变，本实验拟选择致死率在受诱变，本实验拟选择致死率在90909999的高致死率来确定的高致死率来确定各诱变剂合适的处理剂量各诱变剂合适的处理剂量.根据实验结果，拟定各诱变剂合适的根据实验结果，拟定各诱变剂合适的处理剂量为：处理剂量为：UVUV诱变时诱变时UVUV照射时间选照射时间选40s60s40s60s，NTGNTG诱变时选分诱变时选分离平板培养基中加离平板培养基中加15gmL-1NTG15gmL-1NTG，6060CoCo诱变时选照射总剂量为诱变时选照射总剂量为1.0105R1.01

39、05R，UV+LiClUV+LiCl复合处理时选复合处理时选UVUV照射时间照射时间4050s4050s、分离平板、分离平板培养基中加培养基中加0.10.1 LiCl(w/w).LiCl(w/w).第60页，讲稿共65张，创作于星期三（六）（六）YIM41004菌落形态筛选菌落形态筛选 诱变处理前对出发菌株诱变处理前对出发菌株YIM41004YIM41004进行了平板分离纯化，并考察了不进行了平板分离纯化，并考察了不同菌落类型菌株的放线酮生产特性同菌落类型菌株的放线酮生产特性.结果发现，出发菌株结果发现，出发菌株 YIM41004YIM41004在在平板上主要形成平板上主要形成3 3种菌落类型

40、，分别称其为种菌落类型，分别称其为 型、型、型 和型 和型型.型型菌落出现最早（菌落出现最早（2d2d）、）、数量占绝大多数，圆形，较厚，中等数量占绝大多数，圆形，较厚，中等大小，气丝丰富，培养大小，气丝丰富，培养5d5d孢子化明显；孢子化明显；型 和型 和 型菌落于培养型菌落于培养34d34d出现，出现，型菌落很少，圆形，较大，开始无气丝，培养型菌落很少，圆形，较大，开始无气丝，培养 89d89d后后成龟背形，产生少量气丝和孢子，而成龟背形，产生少量气丝和孢子，而型菌落最小，为中空的面型菌落最小，为中空的面圈形，培养圈形，培养68d68d孢子化明显孢子化明显.发酵试验表明，发酵试验表明，只

41、有只 有 型菌落菌株型菌落菌株具有产生放线酮的能力具有产生放线酮的能力.所以，诱变处理后，在分离平板上挑所以，诱变处理后，在分离平板上挑选菌落时，应挑选出现早（培养选菌落时，应挑选出现早（培养23d23d）、中等大小、气丝丰）、中等大小、气丝丰富的富的 型菌落型菌落 第61页，讲稿共65张，创作于星期三（七）诱变线路（七）诱变线路 本实验采用了如下诱变线路：本实验采用了如下诱变线路：YIM41004YIM41004出发菌株出发菌株UVUV诱变诱变筛选筛选F1F1UVUV诱变诱变筛选筛选F2F2UV+LiClUV+LiCl诱变诱变筛筛F3F3UV+LiClUV+LiCl诱变诱变筛选筛选F4F4N

42、TGNTG诱变诱变F5F5NTGNTG诱变诱变筛选筛选F6F660Co60Co诱变诱变筛选筛选F7F7UVUV诱变诱变筛筛选选F8F8 第62页，讲稿共65张，创作于星期三（八）F8-439菌株特性研究菌株特性研究 经过连续经过连续8 8代的诱变育种，选育得到一株生产特性和生代的诱变育种，选育得到一株生产特性和生长特性均有所改善的变异菌株长特性均有所改善的变异菌株F8-439.F8-439F8-439.F8-439菌株摇瓶菌株摇瓶发酵放线酮发酵放线酮产量产量平均达平均达538.7mgL538.7mgL-1-1,比出发菌株（比出发菌株（450450mgLmgL-1-1）提高）提高19.7119.71.而且，而且，F8-439F8-439菌株产生的放线菌株产生的放线酮酮HPLCHPLC峰形狭长，无杂峰，说明峰形狭长，无杂峰，说明产物较单一。产物较单一。F8-439F8-439菌株菌株生长周期缩短生长周期缩短，液体种子培养，液体种子培养36h36h达对数期达对数期中后期，即可用做种子液，而出发菌株发酵种子培中后期，即可用做种子液，而出发菌株发酵种子培养需养需48h.48h.第63页，讲稿共65张，创作于星期三作业：1、什么是诱变育种？2、检出营养缺陷型的方法有哪些？第64页，讲稿共65张，创作于星期三感谢大家观看第65页，讲稿共65张，创作于星期三