高效液相色谱法课件.ppt

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1、高效液相色谱法第1页，此课件共34页哦一、一、HPLC与经典与经典LC区别区别主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1经典LC：仅做为一种分离手段 柱内径13cm，固定相粒径100m 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H，n）分析周期长 无法在线检测2HPLC：分离和分析 柱内径26mm，固定相粒径10m（球形，匀浆装柱）高压输送流动相 柱效高（H，n）分析时间大大缩短 可以在线检测第2页，此课件共34页哦二、二、HPLC与与GC差别差别相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别1分析对象分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，高沸点、挥发

2、性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测 占有机物的20%HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%第3页，此课件共34页哦续前2流动相差别流动相差别vGC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 vHPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性3操作条件差别操作条件差

3、别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）第4页，此课件共34页哦三、高效液相色谱仪流程图三、高效液相色谱仪流程图 1 1贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）2 2高压泵（输液泵）高压泵（输液泵）高压泵（输液泵）高压泵（输液泵）3 3进样装置进样装置进样装置进样装置4 4色谱柱色谱柱色谱柱色谱柱分离分离分离分离5 5检测器检测器检测器检测器分析分析分析分析6 6废液出口或组分收集器废液出口或组分收集器废液出口或组分收集器废液出口或组分收集器 7 7记录装置记录装置记录装置记录装置第

4、5页，此课件共34页哦续前续前四、四、HPLC的特点和应用的特点和应用 “三高”“一快”“一广”高柱效高柱效n=10n=104片片/米，柱效高（远高于一般LCLC）高灵敏度高灵敏度高选择性高选择性分析速度快应用范围广泛（可分析应用范围广泛（可分析80%80%有机化合物）有机化合物）第6页，此课件共34页哦第二节第二节 基本理论和条件选择基本理论和条件选择热力学理论：塔板理论平衡理论 基础动力学理论：速率理论Vander方程 一、塔板理论二、速率理论 三、HPLC法中分离条件的选择 第7页，此课件共34页哦一、塔板理论一、塔板理论 第8页，此课件共34页哦二、速率理论（与二、速率理论（与GCGC

5、对比）对比）1.第9页，此课件共34页哦续前2）涡流扩散项及其影响 next2.2.讨论：讨论：1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）next第10页，此课件共34页哦图示back 第11页，此课件共34页哦续前3）传质阻抗项及其影响 第12页，此课件共34页哦图示第13页，此课件共34页哦三、三、HPLC法中分离条件的选择法中分离条件的选择1.固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp10m）首选化学键合相，匀浆法装柱2.流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相甲醇，1ml/min 3.柱温的选择：选室温250C左右 第14页，此课件共34页哦第三节第三节

6、 各类高效液相色谱法各类高效液相色谱法 一、液固吸附色谱法（LSC）二、液液分配色谱法（LLC）三、化学键合相色谱法（BPC）第15页，此课件共34页哦一、液固吸附色谱法（一、液固吸附色谱法（LSC）流动相为液体，固定相为固体吸附剂流动相为液体，固定相为固体吸附剂 1分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性 中心能力的差异 分离前提：K不等或k不等第16页，此课件共34页哦续前2固定相：与LC比，固定相粒径不同（17%分配色谱 硅胶失活载体 吸附的水固定液第18页，此课件共34页哦二、液液分配色谱法（二、液液分配色谱法（LLC）1分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异2固定相：载体+固定液

7、（物理或机械涂渍法）缺点：系统内部压力大，易流失，不实用 固定液极性NLLC 固定液非极性RLLC3正相色谱固定液极性 流动相极性（NLLC）极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 适于分离极性组分 反相色谱固定液极性 固定相极性 底剂+有机调节剂（极性调节剂）例：水 +甲醇，乙腈，THF 第22页，此课件共34页哦续前4流动相极性与k的关系：流动相极性，洗脱能力，k，组分tR5出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱6适用：非极性中等极性组分（HPLC80%问题）第23页，此课件共34页哦（三）正相键合相色谱（三）正相键合相色谱1分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢

8、键作用力2固定相：极性大的氰基或氨基键合相3流动相：极性小（同LSC）底剂 +有机极性调节剂 例：正己烷 +氯仿-甲醇，氯仿-乙醇 第24页，此课件共34页哦续前4流动相极性与k的关系：流动相极性，洗脱能力，组分tR，k5出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱 极性大的组分后出柱6适用：氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）分离物质也相似氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性 分析极性大物质、糖类等 第25页，此课件共34页哦（四）离子对色谱和离子抑制色谱（四）离子对色谱和离子抑制色谱1反相离子对色谱法 2反相离子抑制色谱 第26页，此课件共34页哦1反相离子对色谱法（反相离子对色谱法（IP

9、C或或PIC）反相色谱中，在极性流动相中加入离子对试剂，使被测组分与其中的反离子形成中性离子对，增加k和tR，以改善分离1）离子对试剂：烷基磺酸钠分析碱 四丁基季胺盐分析酸2）影响k的因素a与m的极性有关（同反相色谱）b与R的链长有关：R长，极性小，tR，k 3）适用：较强的有机酸、碱第27页，此课件共34页哦2反相离子抑制色谱反相离子抑制色谱在反相色谱中，通过加入缓冲溶液调节流动相pH值，抑制组分解离，增加其k和tR，以达到改善分离的目的1）离子抑制剂：弱酸、弱碱性物质 pH一定的缓冲溶液2）k的影响因素：与流动相极性有关，还与pH值有关选择流动相：应同时考虑极性及pH值 酸性物质加入酸HA

10、c tR，k 碱性物质加入碱NH3H2O tR，k 调节pH范围：3.08.0 pH8.0 破坏键合相与载体的结合 pH3.0 腐蚀柱子3）适用：极弱酸碱物质 pH=37弱酸；pH=78弱碱；两性化合物第28页，此课件共34页哦第四节第四节 影响分离的因素影响分离的因素1 第29页，此课件共34页哦续前2对流动相的要求：1）与固定液不反应2）对样品有良好溶解度 k=110 k=25 最理想的3）与检测器匹配：UV（常用，测定波长应大于溶剂的截止波长）荧光，电化学4）使用粘度小、纯度高的流动相（甲醇，乙腈）使用前过滤、脱气第30页，此课件共34页哦续前 3洗脱方式 1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）

11、以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一个泵）类似GC的等温度洗脱2）梯度洗脱：在一定分析周期内不断变换流动相的种类和比例 即不断改变其极性（两个泵）适于分析极性差别较大的复杂组分 类似GC的程序升温（沸程较长样品）第31页，此课件共34页哦图示第32页，此课件共34页哦第五节第五节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪1泵：恒压泵：流量精度不稳 恒流泵：常用2进样装置 1）隔膜进样（高分子有机硅胶垫进样室）GC系统压力较小，可以 HPLC系统压力太大，必须停泵进样（早期）2）阀进样：不必停泵，六通阀 第33页，此课件共34页哦续前3色谱柱：直径46mm,柱长1030cm 柱效评价：色谱系统适应性试验 R，n，fs（拖尾因子）柱再生：维护、保养、柱子的冲洗4检测器 1）紫外检测器：适于吸收紫外光的物质 2）荧光检测器：只能分析自身发光的物质 灵敏度高 3）示差折光检测器：利用折光率的差别 灵敏度低，温度要求严格 4）电化学检测器 5）化学发光 第34页，此课件共34页哦