蛋白表达及纯化精选PPT.ppt

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1、关于蛋白表达及纯化第1页，讲稿共52张，创作于星期三Part 1:蛋白表达、纯化第2页，讲稿共52张，创作于星期三蛋白表达流程1.目的基因cDNA2.表达宿主3.载体4.设计引物5.连接转化6.诱导表达7.蛋白纯化8.鉴定保存第3页，讲稿共52张，创作于星期三gene第4页，讲稿共52张，创作于星期三Cell-freeBacterialYeastInsectMammalianHost第5页，讲稿共52张，创作于星期三Expression System CharacteristicsCharacteristicsE.coliYeastInsectMammaliandoubling timerap

2、id(30 min)rapid(90 min)slow(18-24 hrs)slow(24 hrs)cost of growth mediumlowlowhighhighexpression levelhighlow high low high low moderate protein foldingrefolding may be requiredrefolding may be requiredproper foldingproper foldingN-linked glycos.nohigh mannosesimple,no sialic acidcomplexO-linked glyc

3、os.noyesyesyesphosphorylationnoyesyesyesacetylationno yesyesyesacylationnoyesyesyesg-carboxylationnononoyesproject costlowlowmiddlehigh第6页，讲稿共52张，创作于星期三一：大肠杆菌表达外源基因的优势一：大肠杆菌表达外源基因的优势l全基因组测序全基因组测序 ,共有共有44054405个开放型阅读框架个开放型阅读框架l基因克隆表达系统成熟基因克隆表达系统成熟l繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定l被美国被美国FDAFDA批准

4、为安全的基因工程受体生物批准为安全的基因工程受体生物大肠杆菌表达外源基因的劣势大肠杆菌表达外源基因的劣势l缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的复性功能l缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统l内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白l细胞周质内含有种类繁多的内毒素细胞周质内含有种类繁多的内毒素(endotoxin)(endotoxin)第7页，讲稿共52张，创作于星期三Vector第8页，讲稿共52张，创作于星期三二二 大肠杆菌表达载体的基本组成大肠杆菌表达载体的基本组成一个良好的大肠杆菌表达载体：一个良好的

5、大肠杆菌表达载体：l复制起点复制起点(ori)(ori)l多克隆位点。多克隆位点。l筛选标记（筛选标记（抗菌素抗性基因、抗菌素抗性基因、Tag、筛选标记）、筛选标记）l控制和调节转录与翻译的必不可少的原件控制和调节转录与翻译的必不可少的原件外源基因在原核寄主细胞中表达外源基因在原核寄主细胞中表达,它的编码结构必须它的编码结构必须是连续的是连续的,不间断的不间断的,处于寄主启动子有效控制下。处于寄主启动子有效控制下。第9页，讲稿共52张，创作于星期三可使外源基因高水平表达的最佳启动子必须具备以下几个条件可使外源基因高水平表达的最佳启动子必须具备以下几个条件1)1)强启动子，外源基因的蛋白质的表达

6、量占细胞总蛋白的强启动子，外源基因的蛋白质的表达量占细胞总蛋白的10%-30%10%-30%以上以上2)2)应能呈现出一种低限的基础转录水平应能呈现出一种低限的基础转录水平3)3)应该是诱导型的应该是诱导型的,能通过简单的方式能通过简单的方式,使用廉价的诱导物得以诱导。使用廉价的诱导物得以诱导。常用的大肠杆菌表达载体启动子常用的大肠杆菌表达载体启动子：噬菌体的噬菌体的P PL L启动子启动子 大肠杆菌乳糖操纵子大肠杆菌乳糖操纵子laclac启动子启动子 色氨酸操纵子色氨酸操纵子trptrp启动子启动子 pBR322pBR322质粒的质粒的betabeta内酰胺酶启动子内酰胺酶启动子启动子启动子

7、第10页，讲稿共52张，创作于星期三终止子终止子a:a:如果在克隆基因编码区的如果在克隆基因编码区的3 3 末端之后，接上一个有效的转录终止子，便能够阻止转录通读末端之后，接上一个有效的转录终止子，便能够阻止转录通读过位于下游另一个启动子过位于下游另一个启动子b:b:如果在启动子的上游部位放置一个有效的转录终止子如果在启动子的上游部位放置一个有效的转录终止子 ,那么由该启动子驱动的克隆基因的那么由该启动子驱动的克隆基因的转录便会被限制在最低本底水平。转录便会被限制在最低本底水平。c:c:转录终止子还能增强转录终止子还能增强mRNAmRNA分子的稳定性分子的稳定性,大大提高蛋白质产物水平。大大提

8、高蛋白质产物水平。d:d:在构建大肠杆菌表达载体时，通常是添加全部终止密码子在构建大肠杆菌表达载体时，通常是添加全部终止密码子 ,阻止核糖体跳跃阻止核糖体跳跃 (skipping(skipping)现象。现象。e:e:大肠杆菌格外偏爱使用终止密码子大肠杆菌格外偏爱使用终止密码子UAA,UAA,当其后连上一个当其后连上一个U U而形成四联核苷酸的情况下而形成四联核苷酸的情况下 ,转译终止效率便会得到进一步加强转译终止效率便会得到进一步加强第11页，讲稿共52张，创作于星期三转译起始序列转译起始序列a:mRNAa:mRNA的的5 5 末端之独特的结构特征末端之独特的结构特征,是决定是决定mRNAm

9、RNA转译起始效率的主要因素。转译起始效率的主要因素。b:b:在构建外源基因的高效表达载体时在构建外源基因的高效表达载体时 ,需认真选择有效的转录起始序列。需认真选择有效的转录起始序列。c:c:未鉴定出通用有效的转译起始序列的保守结构未鉴定出通用有效的转译起始序列的保守结构 (KOZAK SEQUENCE)(KOZAK SEQUENCE)第12页，讲稿共52张，创作于星期三筛选标记筛选标记:其编码产物可被快速测定的功能单元。其编码产物可被快速测定的功能单元。n追踪某些特定的追踪某些特定的DNADNA结构结构 (重组质粒重组质粒 )是否已经导入寄主细是否已经导入寄主细胞胞n同任何一种目的启动子连

10、接同任何一种目的启动子连接 ,其表达活性可作为检测其表达活性可作为检测启动子功能的依据。启动子功能的依据。半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ lacZ 荧光素酶基因荧光素酶基因(luciferase)(luciferase)基因、基因、半乳糖激酶基因半乳糖激酶基因(galK)(galK)氯霉素抗性氯霉素抗性(乙酰转移酶乙酰转移酶)基因基因(cat)(cat)四环素抗性基因四环素抗性基因(tet(tetr r)Tag-Tag-第13页，讲稿共52张，创作于星期三第14页，讲稿共52张，创作于星期三目的基因保护碱基内切酶1内切酶2保护碱基第15页，讲稿共52张，创作于星期三X genen引物的设

11、计：设计一对特异性引物。上游、下游引物引入酶切位点noligo6nRNA提取：TRNzol（附件）nRT-PCR：附件1：DNA marker；2：X 基因扩增产物图1.1 X基因的RT-PCR扩增产物第16页，讲稿共52张，创作于星期三Gene cloningYour destination vectorR1R2Your linearized vectorX基因基因R1R2+1.双酶切目的基因和载体及切胶回收：附件目的基因保护碱基内切酶1内切酶2保护碱基2.连接转化：附件3.双酶切鉴定：附件4.测序：附件1：DNA marker;2：重组质粒pET28-X双酶切;3：空质粒pET28a双酶切

12、图1.3 重组质粒pET28-X双酶切鉴定图1.4 X基因发生点突变(AGUAGC)，但为同义突变（Ser）第17页，讲稿共52张，创作于星期三Protein expression 检测该重组质粒在BL21中是否能被诱导表达，并确定在不同IPTG浓度和时间蛋白诱导效率的差异。q挑单克隆菌落于7ml含有相应抗生素LB培养液的50ml培养管中，37C振荡培养过夜（8-16h）。q37C，1mM IPTG终浓度诱导蛋白。取700ul过夜摇菌加入7ml含有相应抗生素LB培养液的50ml离心管中，于OD6000.4-0.6（1:100接种，37C培养时，细菌生长至OD6000.4-0.6约需2h）时加入

13、终浓度为1mM的IPTG。q诱导前在37C培养的菌液中取1ml未诱导的对照，按1ml菌液OD600100l的比例(如1ml OD600为0.4的菌加40ul buffer)加入2上样缓冲液，混匀，-20保存或直接上样。q根据蛋白分子量大小配置相应浓度的SDS-PAGE胶。（50KD蛋白10或12）q诱导3-4h后收集菌液，取1ml样品，测OD600，10000rpm，1min离心去上清后加入相应体积的2上样缓冲液，vortex。q将收集的菌液在水中煮5min，上样10l，120V电压走浓缩胶，加电压至150V进入分离胶电泳，直到染料刚好走到胶底。q取下胶，考马斯亮蓝染色至少30min（染液若是

14、新配的，染20min就够了），脱色液脱色。若急需看到结果，可以将胶在500ml蒸馏水中煮沸两次即可看到条带。第18页，讲稿共52张，创作于星期三IPTG induction1.Even in the absence of IPTG,there is some expression of T7 RNA polymerase from the lacUV5 promoter.2.The degree of toxicity will vary from protein to protein.pET system manual,Novagen,11th Edition第19页，讲稿共52张，创作于星

15、期三1：蛋白marker；29：分别用IPTG 诱导表达0、1、2、3、4、6、8、12 h。图1.6 X蛋白表达条件：诱导时间优化1：0mmol/L；2：0.25mmol/L；3：0.5mmol/L；4：0.75mmol/L；5：1.0mmol/L；6：1.5mmol/L；7：2.5mmol/L；8：3.5mmol/L；9：5.0mmol/L。图1.5 X蛋白表达条件：IPTG浓度优化X蛋白在大肠杆菌中表达条件优化第20页，讲稿共52张，创作于星期三Protein PurificationnCharacterize function,activity,structurenUse in ass

16、aysnRaise antibodiesnmany other reasons.第21页，讲稿共52张，创作于星期三Guidelines for protein purificationnDefine objectivesnDefine properties of target protein and critical contaminantsnMinimize the number of stepsnUse a different technique at each stepnDevelop analytical assaysAdapted from:Protein Purification

17、 Handbook.Amersham Biosciences.18-1132-29,Edition AC第22页，讲稿共52张，创作于星期三Basic scheme of protein purificationFrom:Protein Purification Handbook.Amersham Biosciences.18-1132-29,Edition AC第23页，讲稿共52张，创作于星期三Protein preparation,extraction,clarificationCell growth,protein over-expressionCell lysisRemoval of

18、 cell debrisFrom:Protein Purification Handbook.Amersham Biosciences.18-1132-29,Edition AC第24页，讲稿共52张，创作于星期三Protein isolation,concentration,and stabilizationReversible precipitation with salt or organic moleculesFrom:Protein Purification Handbook.Amersham Biosciences.18-1132-29,Edition AC第25页，讲稿共52张，

19、创作于星期三Fractional precipitation of proteinsAdd Precipitant,CentrifugationChromatographyPrecipitate contaminantsPrecipitate protein of interestDiscard supernatant,Resuspend proteinDiscard pelletAdd Precipitant,Centrifugation,Discard supernatant,Resuspend protein第26页，讲稿共52张，创作于星期三Intermediate Purificat

20、ionLiquid chromatography(lower resolution,lower cost)From:Protein Purification Handbook.Amersham Biosciences.18-1132-29,Edition AC第27页，讲稿共52张，创作于星期三An introduction to liquid chromatographynProtein solution applied to a columnnColumn=solid porous matrix(stationary phase)+liquid(mobile phase)nProteins

21、 separated based on differing interactions with stationary and mobile phasesnMobile phase conditions can be adjusted to increase or decrease affinity of protein for stationary phase(gradient)第28页，讲稿共52张，创作于星期三Size exclusion chromatographyBigger ProteinsSmaller Proteins第29页，讲稿共52张，创作于星期三Affinity Chro

22、matography第30页，讲稿共52张，创作于星期三Affinity ChromatographynMost commonly-used chromatography techniquenCan be used on protein with natural ligandsnOften involves covalent attachment of affinity tag to protein Because of unique tag,provides rapid,specific cleanup in one chromatography step*nCan allow for au

23、tomation of protein purification第31页，讲稿共52张，创作于星期三Popular Small Affinity TagsTagMatrixEluting AgentResiduesSequenceNotesHisNi2+-NTA,Talon,Cobaltimidazole or low pH5-15HHHHHnative or denaturing;inexpensive resinFLAGanti-FLAG antibodylow pH or EDTA/EGTA8DYKDDDDKhigh specificity;harsh elution cond.Stre

24、p IImodified streptavidindesthiobiotin8WSHPQFEKexpensive resinS-peptideS-proteinenzymatic cleavage15KETAAAKFERHMDSdetection possible;expensive resin第32页，讲稿共52张，创作于星期三Popular Large Affinity TagsTagMatrixEluting AgentSizeNotesMBPamylosemaltose40 kDasolubility+secretion enhancer;inexpensive resinGSTglu

25、tathionereduced glutathione26 kDainexpensive resincellulose-binding domainscellulosewater or GdHCl4-20 kDasecretion enhancercalmodulin-binding peptidecalmodulinEDTA/EGTA4 kDadetection possible;expensive resinHis-patch thioredoxinNi2+-NTA,Talonimidazole11.7 kDasolubility+S-S enhancer第33页，讲稿共52张，创作于星期

26、三镍柱亲和层析n详细步骤：附件第34页，讲稿共52张，创作于星期三(A)1：空质粒未诱导；2：空质粒IPTG诱导；3：细菌裂解液上清（可溶部分）；4：细菌裂解液沉淀（不可溶部分）；(B)(B)切胶回收 1：蛋白marker；2：重组质粒未诱导；3：重组质粒IPTG诱导；4：空白孔；5：纯化重组蛋白；(C)(C)Ni柱亲和层析：1-8为依次的蛋白过柱洗脱液图1.7 X蛋白的可溶性分析(A)和纯化(B、C)蛋白纯化结果1.亲和层析柱2.切胶回收（附件）可溶性蛋白 or包涵体纯化第35页，讲稿共52张，创作于星期三Polishing stepsFrom:Protein Purification Ha

27、ndbook.Amersham Biosciences.18-1132-29,Edition ACLiquid chromatography(higher resolution,higher cost)第36页，讲稿共52张，创作于星期三Basic scheme of protein purificationLiquid chromatography(higher resolution,higher cost)Liquid chromatography(lower resolution,lower cost)Reversible precipitation with salt or organ

28、ic moleculesCell growth,protein over-expressionCell lysisRemoval of cell debrisFrom:Protein Purification Handbook.Amersham Biosciences.18-1132-29,Edition AC第37页，讲稿共52张，创作于星期三Tag RemovalNH2proteintaglinkerDDDDKproteaseconsiderations:effect on structureeffect on functionflexibilityprotein 1 sequencen

29、Current strategies for the use of affinity tags and tag removal for the purification of recombinant proteins Protein Expression and PurificationVolume 48,Issue 1,July 2006,Pages 1-13 第38页，讲稿共52张，创作于星期三Protein detection methodsnSDS-PAGEqVisual confirmationqWestern blotnUV SpectrophotometryqAbsorbance

30、 280 nmqDue mostly to TrpqProtein calculated with Beers LawnColorimetric TechniquesqColor change proportional to proteinqBradford,Lowry,BCAJ.S.C.Olson and John Markwell.Current Protocols in Protein Science(2007)3.4.1-3.4.291：未加IPTG诱导的重组质粒；2：IPTG 诱导的重组质粒；3：空白孔；4：纯化后的重组蛋白图1.8 重组蛋白的Western blot 分析26kDa

31、1243Anti-6His antibody第39页，讲稿共52张，创作于星期三Final steps in purificationnCheck purity by detection methodsnConcentrate your proteinqPrecipitationqCentriconsqSmall column with high binding capacitynChoose a storage buffer and storage conditionsqConsider intended use of proteinqStabilizing additivesqFlash

32、freeze protein and store at-80o CnConfirm identity of purified proteinqMass spectrometryqsequencingqAnalytical assays第40页，讲稿共52张，创作于星期三Helpful references and guidesn附件：Protein_Expression_Protocol_3th.docnpET system manual,Novagen,11th EditionnAmersham Biosciences“Protein purification handbook.”18-11

33、32-29,Edition AC.Go to following URL and download pdf of Protein Purification Handbook:nAffinity Purification:Arnau,J.,Lauritzen,C.,Petersen,G.E.,Pedersen,J.Prot.Expr.Purif.48(2006)1-13.nJ.S.C.Olson and John Markwell.Current Protocols in Protein Science(2007)3.4.1-3.4.29第41页，讲稿共52张，创作于星期三Part 2：抗体制备

34、、应用第42页，讲稿共52张，创作于星期三n单抗制备n多抗制备：附件n抗体鉴定效价特异性第43页，讲稿共52张，创作于星期三Principle of McAb Production第44页，讲稿共52张，创作于星期三抗原经FCA或FIA充分乳化后免疫家兔。首次免疫佐剂用FCA，第二、三次用FIA。家兔脊柱两旁选5点皮下注射，每点注摄0.2ml，间隔后2周选不同点注射，每次免疫的抗原量约 350g/兔。第三次免疫后10天，耳动脉取血检测抗体效价。双相琼脂扩散实验效价至少达到1:16；ELISA效 价达到105即可放血。最后一次取血采用颈动脉放血。新西兰兔（附件）第45页，讲稿共52张，创作于星期

35、三图1.9 兔多克隆抗体效价测定-琼脂糖凝胶免疫扩散试验图1.10 兔血清抗体效价曲线-ELISA多抗效价测定 1.琼脂糖凝胶免疫扩散试验：附件2.ELISA：附件第46页，讲稿共52张，创作于星期三1-4:各孔上样量分别为69ug、138ug、230ug和920ug菌体蛋白图1.11 兔多克隆抗体特异性鉴定绿色：FITC-anti-rabbit IgG antibody蓝色：Hochest33258 图1.12 兔多克隆抗体免疫荧光检测（1000）多抗特异性鉴定和应用 1.Western blot2.Immunofluorescence technique第47页，讲稿共52张，创作于星期三

36、Part 3：ELISA间接法检测血清抗体浓度第48页，讲稿共52张，创作于星期三X-ELISA检测原理(间接法）第49页，讲稿共52张，创作于星期三 NS1-ELISA法检测步骤(1)抗原包板：纯化抗原1:100包被液稀释（2ug/ml），4过夜。PBS洗3次；(2)封闭：2.5%脱脂奶粉封闭1h；(3)一抗反应：小鼠血清1:10稀释（封闭液），100ul/孔，4过夜，PBS洗3次；(2)二抗反应：加入100ul 用稀释液1:500 稀释的酶标抗体，37 1h 后1洗涤缓冲液冲洗三次。(3)显色：每孔加底物溶液100ul 显色(A与B 1:1混合)，置室温10min 左右(可根据显色情况而定

37、)。(4)终止：每孔加终止液50ul。(5)结果判定：选波长450nm，空白孔校零。用酶联免疫检测仪对每孔进行比色，并记录其OD450值。样品孔OD值阴性对照孔平均值2.1时，该孔样品为阳性。反之为阴性。第50页，讲稿共52张，创作于星期三小鼠血清抗体水平P0.05图2.4 HA1-ELISA检测各组小鼠HA1抗体水平图2.5 X-ELISA法对病毒感染和疫苗免疫小鼠血清检测*表2.1 X-ELISA方法学评价87.581.81/89/1130d88.994.41/917/1815d10030.80/84/13*7d特异度（%）灵敏度（%）疫苗免疫病毒感染*分子表示ELISA检测阳性动物数，分母表示各组动物总数第51页，讲稿共52张，创作于星期三感谢大家观看第52页，讲稿共52张，创作于星期三