植物原生质体培养及细胞融合课件.ppt

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1、关于植物原生质体培养及细胞融合第1页，此课件共63页哦 植物细胞中植物细胞中除去细胞壁除去细胞壁的裸露的有生活力的部分。的裸露的有生活力的部分。除了没有细胞壁外，具有细胞的一切特征。除了没有细胞壁外，具有细胞的一切特征。原生质体包括原生质体包括 细胞质膜细胞质膜 膜内膜内细胞质细胞质 其他具有生命活性的其他具有生命活性的细胞器细胞器，如细胞核、线粒体和高尔基体等。如细胞核、线粒体和高尔基体等。原生质体原生质体（protoplast）第2页，此课件共63页哦原生质体培养意义原生质体培养意义是植物是植物细胞工程细胞工程的核心技术。的核心技术。1.除去了细胞壁，除去了细胞壁，为植物为植物细胞细胞之间

2、的之间的融合融合扫平了障碍，扫平了障碍，实现实现体细胞杂交体细胞杂交，为制造新杂种开辟了道路。，为制造新杂种开辟了道路。(克服远缘杂交不亲和性克服远缘杂交不亲和性)2.原生质体是各种遗传操作的原生质体是各种遗传操作的理想受体理想受体，从而可以进行品种的遗传改良。从而可以进行品种的遗传改良。可摄入可摄入外源外源DNA，细胞器、细菌或病毒颗粒，细胞器、细菌或病毒颗粒，为高等植物的遗传饰变打下基础。为高等植物的遗传饰变打下基础。3.获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。第3页，此课件共63页哦一、原生质体的分离一、原生质体的分离（一）材料来源（一）材料来

3、源植物的茎、叶、胚、子叶、下胚轴等植物的茎、叶、胚、子叶、下胚轴等器官器官组织组织以及愈伤以及愈伤组织组织和悬浮培养和悬浮培养细胞细胞均可作为原生质体分离的材料。均可作为原生质体分离的材料。目前目前较多采用较多采用叶片分离原生质体，叶片分离原生质体，但分裂旺盛的、再分化能力强的但分裂旺盛的、再分化能力强的愈伤组织愈伤组织或或悬浮细胞系悬浮细胞系，尤其是尤其是胚性胚性愈伤组织或胚性悬浮细胞系愈伤组织或胚性悬浮细胞系是是最理想最理想的原生质体分离材料。的原生质体分离材料。第一节第一节 原生质体的分离与纯化原生质体的分离与纯化第4页，此课件共63页哦材料预处理意义意义 提高原生质体的提高原生质体的分

4、裂频率分裂频率；逐步提高植物材料的渗透压，以逐步提高植物材料的渗透压，以适应适应培养基中的培养基中的高渗环境高渗环境。方法方法暗暗处理处理豌豆枝条豌豆枝条取下后，分离原生质体前，先在取下后，分离原生质体前，先在黑暗黑暗中（一定湿度）放中（一定湿度）放1-2d，提高原生质体存活率高，并能继续分裂；提高原生质体存活率高，并能继续分裂；预培养预培养羽衣甘蓝羽衣甘蓝先去叶下表皮，再在诱导愈伤组织的先去叶下表皮，再在诱导愈伤组织的培养基培养基中中预培养预培养7d，再去壁，再去壁，原生质体高度液泡化，叶绿体也解体；原生质体高度液泡化，叶绿体也解体；低温低温处理处理龙胆试管苗龙胆试管苗的叶片只有用的叶片只有

5、用4低温处理低温处理后，分离得到的原生质体才能分裂。后，分离得到的原生质体才能分裂。（在很多情况下材料（在很多情况下材料不必不必经过专门的预处理）经过专门的预处理）第5页，此课件共63页哦1.机械法机械法Klercker于于1892年最早进行分离高等植物原生质体的研究。年最早进行分离高等植物原生质体的研究。其方法是把细胞置于一种其方法是把细胞置于一种高渗的糖溶液高渗的糖溶液中，使细胞发生中，使细胞发生质壁分离质壁分离，原生质体收缩成球形，然后用原生质体收缩成球形，然后用利刃切割利刃切割，发生质壁分离的细胞壁被切去后释放出原生质体。发生质壁分离的细胞壁被切去后释放出原生质体。缺点缺点原生质体的产

6、量低；原生质体的产量低；方法繁琐费力；方法繁琐费力；对分生细胞和其它液泡化程度不高的细胞对分生细胞和其它液泡化程度不高的细胞不适用不适用。未得到广泛应用未得到广泛应用。优点优点 能够排除外加能够排除外加酶酶对离体原生质体的结构和代谢活性的对离体原生质体的结构和代谢活性的有害影响有害影响。（二）原生质体分离方法（二）原生质体分离方法第6页，此课件共63页哦2.酶酶分离法分离法1960年，年，Cocking首先利用首先利用纤维素酶纤维素酶处理番茄根尖，处理番茄根尖，分离得到收率高、活力强、完整性好的原生质体。分离得到收率高、活力强、完整性好的原生质体。1968年，年，纤维素酶和离析酶纤维素酶和离析

7、酶商品化生产商品化生产后，后，大量进行植物原生质体的研究。大量进行植物原生质体的研究。现在现在果胶酶果胶酶处理处理 单细胞单细胞纤维素酶纤维素酶处理处理 原生质体原生质体分离原生质体分离原生质体最有效方法最有效方法。第7页，此课件共63页哦细胞壁的组成细胞壁的组成纤维素纤维素 半纤维素半纤维素 果胶质果胶质 少量蛋白质少量蛋白质 25-50 53 5 纤维素酶纤维素酶 半纤维素酶半纤维素酶 果胶酶果胶酶第8页，此课件共63页哦酶的种类及特点酶的种类及特点 纤维素酶纤维素酶主要含有主要含有纤维素酶纤维素酶C，作用于，作用于天然天然的和的和结晶结晶的纤维素，具有分解天然纤维素的作用，的纤维素，具有

8、分解天然纤维素的作用，还含还含纤维素酶纤维素酶CX，作用于，作用于定形定形的纤维素，可分解短链纤维素，的纤维素，可分解短链纤维素，另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、另含有纤维素二糖酶、木聚糖酶、萄聚糖酶、果胶酶果胶酶、脂肪酶、磷脂酶、脂肪酶、磷脂酶、核酸酶、溶菌酶等，核酸酶、溶菌酶等，总体作用是总体作用是降解纤维素降解纤维素，得到裸露的原生质体。，得到裸露的原生质体。半纤维素酶半纤维素酶降解半纤维素降解半纤维素为单糖或单糖衍生物。为单糖或单糖衍生物。果胶酶果胶酶使使细胞间细胞间的的果胶质降解果胶质降解，把细胞从组织内分离出来。，把细胞从组织内分离出来。此外，还有此外，还有蜗牛酶蜗牛酶（主

9、要用于花粉母细胞和四分体细胞）等。（主要用于花粉母细胞和四分体细胞）等。第9页，此课件共63页哦原生质体原生质体酶分离法酶分离法两步分离法两步分离法用用果胶酶果胶酶离析植物组织，收集细胞；离析植物组织，收集细胞；经洗涤后用经洗涤后用纤维素酶纤维素酶解离细胞壁，然后获得原生质体。解离细胞壁，然后获得原生质体。日本产的日本产的Onozuka纤维素酶纤维素酶常和果胶酶结合使用。常和果胶酶结合使用。一步分离法一步分离法一定量的一定量的纤维素酶纤维素酶和和果胶酶果胶酶组成混合酶液，对材料进行一次性处理。组成混合酶液，对材料进行一次性处理。上海植物生理研究所生产的上海植物生理研究所生产的ZA3-867纤维

10、酶纤维酶是多种酶的复合物，是多种酶的复合物，含有含有纤维素酶纤维素酶，果胶酶果胶酶，半纤维素酶半纤维素酶等，分离细胞壁的效果较好。等，分离细胞壁的效果较好。第10页，此课件共63页哦酶液的配制酶液的配制酶的配比和浓度酶的配比和浓度果胶酶果胶酶/纤维素酶纤维素酶纯度纯度高，高，但但浓度浓度不宜太高；不宜太高；木本植物木本植物加入半纤维素酶。加入半纤维素酶。第11页，此课件共63页哦 如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，如果溶液中的渗透压和细胞内的渗透压不同，原生质体原生质体有可能有可能涨破涨破或或收缩收缩，因此在酶液、洗液和培养液中因此在酶液、洗液和培养液中渗透压渗透压 应大致和应大致和原生

11、质体原生质体内的内的相同相同，或者比，或者比细胞细胞内渗透压内渗透压略大些略大些。较高水平较高水平的渗透剂可以的渗透剂可以阻止阻止原生质体的破裂和出芽，原生质体的破裂和出芽，但同时也可能但同时也可能抑制抑制原生质体的分裂。原生质体的分裂。糖溶液系统糖溶液系统 包括包括甘露醇甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等，浓度约在0.40-0.80molL。可促进分离的原生质体可促进分离的原生质体再生再生细胞壁并继续细胞壁并继续分裂分裂；盐溶液系统盐溶液系统 包括包括 KCl、MgSO4和和 KH2PO4等。等。此外，酶溶液里还可加入适量的此外，酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸

12、钾葡聚糖硫酸钾，提高提高原生质体原生质体的稳定性；使的稳定性；使RNA酶酶不活化；并使离子稳定。不活化；并使离子稳定。渗透稳定剂渗透稳定剂第12页，此课件共63页哦pH酶溶液的酶溶液的pH值值对原生质体的产量和生活力对原生质体的产量和生活力影响很大影响很大。用菜豆叶片作培养材料时发现用菜豆叶片作培养材料时发现原始原始pH值为值为5.0时，原生质体时，原生质体产生得很快产生得很快，但但损坏较严重损坏较严重，并且培养后，并且培养后大量破裂大量破裂。当当pH值提高到值提高到6.0时，时，最初最初原生质体却原生质体却产生少产生少，但与但与pH值为值为5.0时处理同样时间后相比，时处理同样时间后相比，原

13、生质体数量显著增加原生质体数量显著增加。原始原始pH值提高到值提高到7.0时，时，生活的原生质体数量进一步增加，生活的原生质体数量进一步增加，损伤损伤的原生质体也的原生质体也少少得多。得多。第13页，此课件共63页哦分离分离叶肉原生质体的完整流程叶肉原生质体的完整流程表面灭菌的叶片表面灭菌的叶片撕去撕去下表皮下表皮酶溶液及渗压稳定剂酶溶液及渗压稳定剂 （叶段漂浮其上）（叶段漂浮其上）抽真空、振荡抽真空、振荡 保温保温8hr原生质体沉于培养皿原生质体沉于培养皿底底吸掉酶液吸掉酶液原生质体原生质体悬浮于悬浮于清洗液清洗液中中 离心离心2次，次，第第2次离心前重新次离心前重新悬悬浮于浮于高蔗糖清洗液

14、高蔗糖清洗液中中原原生生质质体体（上上层层）重新悬浮于重新悬浮于培养基培养基中中取少量样品用血球板计数取少量样品用血球板计数以适当的植板密度以适当的植板密度重新悬浮于重新悬浮于培养基培养基中中第14页，此课件共63页哦（一）原生质体的纯化（一）原生质体的纯化1.沉降法沉降法（过滤离心法）过滤离心法）-应用最广应用最广利用比重原理，利用比重原理，低速离心低速离心使原生质体沉于使原生质体沉于底部底部。过滤过滤酶处理混合液，酶处理混合液，30-40m微孔微孔滤滤膜，膜，低速离心低速离心，150g以下，以下，3-5min，弃上清，弃上清，用液体培养基或甘露醇溶液用液体培养基或甘露醇溶液悬悬浮浮洗洗涤涤

15、，重复重复2-3次，次，1-2ml液体培养基液体培养基悬悬浮原生浮原生质质体，体，备备用。用。优优点：点：操作方便；操作方便；损损失少。失少。缺点：缺点：纯纯度不高度不高二、原生质体的纯化与活力测定二、原生质体的纯化与活力测定第15页，此课件共63页哦2.漂浮法漂浮法 利用比重大于原生质体的利用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液高渗蔗糖溶液，离心后，离心后 原生质体原生质体位于蔗糖溶液和原生质体悬浮培养基的位于蔗糖溶液和原生质体悬浮培养基的界面上界面上，残渣碎屑残渣碎屑沉到管底。沉到管底。先加先加蔗糖溶液蔗糖溶液（20%左右），左右），酶处理混合液酶处理混合液置于其上，置于其上，离心离心，150g

16、，5min 用液体培养基或甘露醇溶液悬浮用液体培养基或甘露醇溶液悬浮洗涤洗涤2-3次次,1-2ml液体液体培养基培养基悬浮原生质体，备用。悬浮原生质体，备用。优点：纯度高优点：纯度高缺点：收率低。缺点：收率低。第16页，此课件共63页哦3.界面法界面法采采用用2种或种或2种以上种以上密密度不同度不同的溶液，的溶液，离心后使完整的原生质体处在离心后使完整的原生质体处在两液相的界面两液相的界面。最早最早Hughes(1978)两液相两液相下层下层：450mM/L蔗糖蔗糖上层上层：450mM/L甘露醇甘露醇Piwowarczyk（1978）改进了上述方法）改进了上述方法 两液相两液相下层下层：培养基

17、，含：培养基，含500mM/L蔗糖蔗糖中层中层：培养基，含：培养基，含140mM/L蔗糖蔗糖，360mM/L山梨醇山梨醇上层：含原生质体酶液，含上层：含原生质体酶液，含300mM/L山梨醇山梨醇和和100mM/LCaCl2现在用不同连续梯度现在用不同连续梯度Ficoll（聚蔗糖）溶液（聚蔗糖）溶液，上面为酶上面为酶-原生质体混合液，原生质体混合液，经离心（经离心（150g，5min）,不同比重的原生质体漂浮在不同浓度梯度的界面上。不同比重的原生质体漂浮在不同浓度梯度的界面上。优点：收获的原生质体优点：收获的原生质体大小均匀一致大小均匀一致。缺点：收率低。缺点：收率低。第17页，此课件共63页哦

18、纯化后的叶肉原生质体纯化后的叶肉原生质体第18页，此课件共63页哦（二）原生质体活力的测定（二）原生质体活力的测定1.以以胞质环流胞质环流作为进行活跃代谢的指标，作为进行活跃代谢的指标，但对在细胞周围携有大量叶绿体的但对在细胞周围携有大量叶绿体的叶肉细胞叶肉细胞原生质体来说，原生质体来说，这种方法的这种方法的作用不大作用不大；2.以以氧的摄入量氧的摄入量作指标，作指标，摄入量可通过一个能指示呼吸代谢强度的摄入量可通过一个能指示呼吸代谢强度的氧电极氧电极进行测定。进行测定。3.以以光合活性光合活性作指标。作指标。4.以完整的质膜排斥以完整的质膜排斥伊凡蓝伊凡蓝的能力作指标。的能力作指标。5.以荧

19、光素双醋酸酯（以荧光素双醋酸酯（FDA）的染色能力为指标。）的染色能力为指标。第19页，此课件共63页哦一、供体植物的选择一、供体植物的选择 供体组织的供体组织的生理状态生理状态很重要。很重要。一般情况下，一般情况下，在在可控光可控光、温温、湿湿的环境条件下能得到重复的结果，的环境条件下能得到重复的结果，即在即在无菌条件下无菌条件下生长的生长的幼苗幼苗制备原生质体较好。制备原生质体较好。第二节第二节 原生质体培养原生质体培养第20页，此课件共63页哦1.基本培养基基本培养基 MS和和B5，或其衍生的培养基。或其衍生的培养基。CaCl2促进细胞分裂。促进细胞分裂。钙可增强原生质体钙可增强原生质体

20、稳定性稳定性，提高分裂频率，提高分裂频率，明显改变细胞质内外的离子交换。明显改变细胞质内外的离子交换。NH4NO3降低细胞分裂频率。降低细胞分裂频率。2.生长调节物质生长调节物质 生长素生长素/细胞分裂素类。细胞分裂素类。针对不同的针对不同的研究对象研究对象，培养基中生长素和细胞分裂素的水平要做培养基中生长素和细胞分裂素的水平要做适当调整适当调整。二、原生质体培养基二、原生质体培养基第21页，此课件共63页哦3.渗压剂渗压剂 在没有再生出一个坚韧的在没有再生出一个坚韧的细胞壁之前细胞壁之前，原生质必须有培养基渗透压的保护，原生质必须有培养基渗透压的保护。高渗溶液，培高渗溶液，培养时一般逐步过渡

21、。养时一般逐步过渡。通常的渗透剂是通常的渗透剂是甘露醇甘露醇和和山梨醇山梨醇。MSNAA 2.0ppmBA 0.5ppm3蔗糖蔗糖9甘露醇甘露醇 4.pH：5.6-6.0培养基培养基 用醋酸纤维微孔滤膜用醋酸纤维微孔滤膜过滤灭菌过滤灭菌。第22页，此课件共63页哦新新分离出来的原生质体分离出来的原生质体应在应在散射光散射光或或黑暗黑暗中培养。中培养。培养温度一般在培养温度一般在25-30下。下。三、培养条件三、培养条件第23页，此课件共63页哦 1.液体浅层培养液体浅层培养 原生质体悬浮在原生质体悬浮在液体培养基液体培养基（约（约2105/ml密度）密度）将原生质体悬浮液移到直径为将原生质体悬

22、浮液移到直径为6cm的的培养皿培养皿中（中（2-3mm为宜）为宜）5-10天后开始原生质体分裂天后开始原生质体分裂 优点优点通气通气好；好；原生质体代谢物原生质体代谢物易扩散易扩散，防止有害物质积累过多造成毒害；，防止有害物质积累过多造成毒害；转移添加新鲜培养基方便，转移添加新鲜培养基方便，便于观察和照相便于观察和照相；操作简单；操作简单；可微量培养，细胞可微量培养，细胞植板率植板率高。高。缺点：缺点：原生质体沉淀，原生质体沉淀，分布不均分布不均；细胞团聚集多，细胞团聚集多，难成单细胞株系难成单细胞株系。四、培养方法四、培养方法第24页，此课件共63页哦 原生质体原生质体（密度为（密度为410

23、5/ml）与等量体积）与等量体积琼脂糖琼脂糖培养基均匀混合培养基均匀混合置于置于6cm培养皿（培养皿（2-3mm）,暗暗培养培养5-7天原生质体开始分裂。天原生质体开始分裂。优点优点原生质体原生质体分布均匀分布均匀，利于分裂，利于分裂，容易获得容易获得单胞株系；单胞株系；可可定位观察定位观察。缺点缺点原生质体易受原生质体易受热伤害热伤害，易破碎；，易破碎；原生质体始终处于高渗透压胁迫下原生质体始终处于高渗透压胁迫下生长发育缓慢生长发育缓慢，植板率低。，植板率低。2.固体固体/平板培养平板培养第25页，此课件共63页哦原生质体原生质体采用平板培养方法采用平板培养方法包埋包埋在培养皿在培养皿底层底

24、层；上面上面再加入相同成分的再加入相同成分的液体培养基液体培养基，暗暗培养。培养。需需更换更换新鲜液体培养基。新鲜液体培养基。优点优点原生质体分布均匀，有利于分裂，原生质体分布均匀，有利于分裂，易获易获单细胞株系；单细胞株系；能能除去除去抑制分裂的抑制分裂的有害物质有害物质，细胞植板率高。，细胞植板率高。缺点缺点原生质体易受原生质体易受热伤害热伤害，易破碎。，易破碎。3.（固、液）双固、液）双层层培养培养第26页，此课件共63页哦第27页，此课件共63页哦五、低密度培养五、低密度培养与细胞培养相似，与细胞培养相似，原生质体原生质体初始植板密度初始植板密度对植板效率有显著的影响。对植板效率有显著

25、的影响。原生质体培养的一般密度为原生质体培养的一般密度为104-105。高密度下，高密度下，个别原生质体形成的个别原生质体形成的细胞团细胞团在相当早时就交织在一起，在相当早时就交织在一起，如果原生质体群体在遗传上是异质的，就会形成如果原生质体群体在遗传上是异质的，就会形成嵌合体组织嵌合体组织。在体细胞杂交和诱发突变的研究中，在体细胞杂交和诱发突变的研究中，最好能获得最好能获得个别细胞个别细胞的无性系。的无性系。需要需要低密度低密度（100-500）原生质体培养。）原生质体培养。第28页，此课件共63页哦1.培养基培养基KM8pKao&Michayluk（1975）Vicia hajastana

26、（一种蚕豆）单细胞（一种蚕豆）单细胞再生出壁再生出壁，并分裂形成，并分裂形成愈伤愈伤；在苜蓿、豌豆和在苜蓿、豌豆和Vicia中培养中，中培养中，低密度下（低密度下（小于小于100）分裂的更快分裂的更快；培养马铃薯培养马铃薯原生质体原生质体及及马铃薯马铃薯/番茄番茄原生质体融合产物原生质体融合产物获得成功。获得成功。黑暗或近于黑暗（黑暗或近于黑暗（50lx）培养。）培养。第29页，此课件共63页哦2.培养方法培养方法1）饲饲养养细细胞胞层层法法 用用X射线射线或或紫外线紫外线照射细胞（照射细胞（106），抑制细胞分裂，但不破坏细胞代谢，），抑制细胞分裂，但不破坏细胞代谢，将其清洗，将其清洗，植板

27、在植板在软琼脂培养基软琼脂培养基上，此平板称上，此平板称饲喂层饲喂层，然后将未照射处理的然后将未照射处理的原生质体原生质体铺在饲喂层上。铺在饲喂层上。特点特点 以一种植物细胞制成的平板，以一种植物细胞制成的平板，支持另一种植物原生质体的生长。支持另一种植物原生质体的生长。饲喂层饲喂层没有种的特异性没有种的特异性。烟草原生质体植板密度低于烟草原生质体植板密度低于104时，一般不能分裂，时，一般不能分裂，用此方法，植板密度可低至用此方法，植板密度可低至10-100。第30页，此课件共63页哦2种类型种类型的活跃代谢和正在分裂的的活跃代谢和正在分裂的原生质体原生质体混合混合在液体培养基中一起培养。在

28、液体培养基中一起培养。用于某些物种用于某些物种原生质体原生质体或或杂种细胞杂种细胞的培养。的培养。条件条件2个物种原生质体间能发生有效的个物种原生质体间能发生有效的互馈互馈；其产生的其产生的愈伤组织愈伤组织形态上能彼此形态上能彼此区分区分。2）共培养法）共培养法第31页，此课件共63页哦3）Cuprak微滴法微滴法高国楠（高国楠（1977）及）及Gleba（1978）设计设计特别培养皿特别培养皿培养培养单个原生质体单个原生质体及其再生的细胞。及其再生的细胞。两室两室大的大的内室内室：很多：很多小穴小穴，加入原生质体悬浮液（，加入原生质体悬浮液（0.25-0.5l）；）；小的小的外室外室：注入：

29、注入无菌水无菌水，保持培养皿内湿度。，保持培养皿内湿度。可进行可进行单个单个原生质体培养。原生质体培养。第32页，此课件共63页哦六、细胞壁的形成六、细胞壁的形成培养培养2-4天，原生质体天，原生质体失去失去其特有的其特有的球型外观球型外观，这是再生新壁的象征。，这是再生新壁的象征。研究认为，研究认为，旋花科旋花科植物原生质体只有在外源供应植物原生质体只有在外源供应一种一种易于代谢的碳源（易于代谢的碳源（蔗糖蔗糖）时，）时，细胞壁才能细胞壁才能再生再生。培养基中若存在培养基中若存在电解质渗透压调节剂电解质渗透压调节剂时会抑制壁的再生。时会抑制壁的再生。壁的形成与壁的形成与细胞分裂细胞分裂有直接

30、关系，有直接关系，凡是不能再生壁的原生质体就不能进行正常的有丝分裂。凡是不能再生壁的原生质体就不能进行正常的有丝分裂。愈伤组织形成后，转入愈伤组织形成后，转入不含不含渗透压调节剂的培养剂中，渗透压调节剂的培养剂中，其培养及植株再生与其培养及植株再生与一般组织培养方法一般组织培养方法相同。相同。第33页，此课件共63页哦原原生生质质体体培培养养的的程程序序第34页，此课件共63页哦一、原生质体融合意义一、原生质体融合意义原生质体融合也称原生质体融合也称体细胞杂交体细胞杂交，即，分离下来的即，分离下来的不同亲本不同亲本杂交的原生质体，杂交的原生质体，在人工控制下互相融合成一体。在人工控制下互相融合

31、成一体。自然自然条件下，原生质体自然融合频率条件下，原生质体自然融合频率极低极低，必须加以必须加以一定的方法诱导一定的方法诱导，才能促进原生质体的融合。，才能促进原生质体的融合。第三节第三节 原生质体融合原生质体融合第35页，此课件共63页哦原生质体融合原生质体融合打破了打破了种间界限种间界限（生殖隔离），使基因交流扩大范围；（生殖隔离），使基因交流扩大范围；克服有性杂交特别是远缘杂交的克服有性杂交特别是远缘杂交的不亲和性不亲和性；扩大了遗传变异及种质资源的范围。扩大了遗传变异及种质资源的范围。原生质体融合的意义原生质体融合的意义第36页，此课件共63页哦甘薯甘薯原生质体融合植株原生质体融合植

32、株第37页，此课件共63页哦1.化学法融合化学法融合1）无机无机盐盐诱导诱导融合融合1909年，年，Kuster证实，证实，低渗低渗NaNO3处理处理可诱导发生可诱导发生质壁分离质壁分离表皮细胞表皮细胞2个原生质体融合。个原生质体融合。缺点缺点异核体异核体形成频率形成频率不高不高，尤其是对于高度液泡化的叶肉原生质体。尤其是对于高度液泡化的叶肉原生质体。二、原生质体融合方法二、原生质体融合方法第38页，此课件共63页哦Carlson等（等（1972）获得第一个体细胞杂种获得第一个体细胞杂种第39页，此课件共63页哦2）高高pH-高高钙钙离子离子诱导诱导融合融合Keller 和和Melcher（1

33、973年）年）强碱性的高浓度钙离子强碱性的高浓度钙离子（pH，10.5；钙离子钙离子，50mmol/L）37处理处理30min，两个品系两个品系烟草烟草叶肉原生质体很容易融合。叶肉原生质体很容易融合。1977年，获得年，获得烟草烟草种间和种内体细胞杂种。种间和种内体细胞杂种。对对矮牵牛矮牵牛效果效果也很好，也很好，但对有些物种，但对有些物种，高高pH可能可能有毒有毒。第40页，此课件共63页哦高国楠等（高国楠等（1974）提出，现被广泛采用。）提出，现被广泛采用。滴滴150l混合双亲混合双亲的原生质体悬浮液于载体玻片上，形成一层薄层的原生质体悬浮液于载体玻片上，形成一层薄层;吸取吸取PEG融合

34、诱导液融合诱导液（28-58%，分子量，分子量1500-6000）450l，使其逐渐与原生质体接触，促使原生质体相使其逐渐与原生质体接触，促使原生质体相粘连粘连；培养基进行培养基进行清洗清洗。高高Ca2+-高高pH溶液溶液清洗，清洗，可提高原生质体融合频率。可提高原生质体融合频率。3）聚乙二醇聚乙二醇（PEG）诱导诱导融合融合第41页，此课件共63页哦优点优点 采用聚乙二醇作为融合剂时，采用聚乙二醇作为融合剂时，异核体异核体形成的形成的频率很高频率很高，可重复性很强；，可重复性很强；对大多数细胞类型来说对大多数细胞类型来说毒性很低毒性很低；第42页，此课件共63页哦洋葱洋葱烟草烟草第43页，此

35、课件共63页哦将原生质体悬浮液将原生质体悬浮液离心离心，去上清，去上清，用电击液（用电击液（10%甘露醇，甘露醇，0.1mmol/L醋酸钙，醋酸钙，0.5mmol/L醋酸镁）醋酸镁）悬浮悬浮，置于置于融合小室融合小室；在电融合仪的在电融合仪的交变电场交变电场作用下，原生质体彼此靠近，作用下，原生质体彼此靠近，紧密接触，在两极间排成紧密接触，在两极间排成串珠状串珠状。给予瞬间的高强度给予瞬间的高强度电脉冲电脉冲，质膜发生，质膜发生可逆性电激穿可逆性电激穿，导致融合。，导致融合。电融合法的电融合法的优点优点（与化学融合法相比）（与化学融合法相比）简单、迅速、效率高；简单、迅速、效率高；经融合处理后

36、经融合处理后没有中毒反应没有中毒反应；需要需要特殊设备特殊设备，不常采用不常采用。2.物理法物理法融合（融合（电电融合技融合技术术）第44页，此课件共63页哦第45页，此课件共63页哦德国农业科学院培育德国农业科学院培育枝头上开花、结出鲜红的枝头上开花、结出鲜红的番茄番茄，而地下块茎却是而地下块茎却是马铃薯马铃薯。番茄马铃薯番茄马铃薯第46页，此课件共63页哦德国汉堡大学德国汉堡大学把把牛肉细胞牛肉细胞和和番茄细胞番茄细胞融合成杂交种细胞，融合成杂交种细胞，繁殖出一种杂交新品种。繁殖出一种杂交新品种。内含内含牛肉动物蛋白牛肉动物蛋白和和番茄植物蛋白番茄植物蛋白各半；各半；蛋白质总量为普通番茄的

37、蛋白质总量为普通番茄的40倍倍；所结出的所结出的果实果实 兼有牛肉味和番茄味，营养也较全面。兼有牛肉味和番茄味，营养也较全面。牛肉番茄牛肉番茄第47页，此课件共63页哦对称融合对称融合 完整原生质体融合，产生完整原生质体融合，产生核核核核、胞质胞质胞质胞质重组的对称杂种。重组的对称杂种。常因常因分裂不同步分裂不同步使一方的染色体全部或部分使一方的染色体全部或部分丢失丢失。不对称融合不对称融合 使一方的细胞使一方的细胞核失活核失活（胞质体）（胞质体）或同时也使另一方的或同时也使另一方的胞质失活胞质失活（核质体），产生不对称杂种。（核质体），产生不对称杂种。微原生质体融合微原生质体融合 只有一条或

38、几条染色体的只有一条或几条染色体的微核微核与原生质体融合。与原生质体融合。原生质体融合类型原生质体融合类型第48页，此课件共63页哦胞壁再生胞壁再生 比原生质体培养比原生质体培养稍滞后稍滞后。核融合核融合 异核体、同核体及多核体的混合群体。异核体、同核体及多核体的混合群体。异核体异核体双核分裂双核分裂同步同步 子细胞含子细胞含双亲双亲的遗传物质；的遗传物质；不同步不同步 一方染色体一方染色体丢失丢失；细胞增殖细胞增殖 有的在条件适合时继续有的在条件适合时继续分裂分裂形成细胞团或形成细胞团或愈伤组织愈伤组织；有的中途停止分裂、有的中途停止分裂、死亡死亡。融合体融合体的培养和发育的培养和发育第49

39、页，此课件共63页哦经过融合处理后的经过融合处理后的原生质体群体原生质体群体内包含内包含未融合的未融合的2种亲本原生质体，种亲本原生质体，同核体、同核体、异核体异核体、各种其他核各种其他核-质组合。质组合。异核体异核体是未来杂种的潜在来源，约占是未来杂种的潜在来源，约占0.5-10%，但其在但其在生长生长和和分化分化两个方面均两个方面均无竞争优势无竞争优势可言，可言，有效鉴定和选择杂种细胞，有效鉴定和选择杂种细胞，是体细胞杂交成功的关键。是体细胞杂交成功的关键。三、杂种细胞的筛选与鉴定三、杂种细胞的筛选与鉴定第50页，此课件共63页哦1.根据物理特性直观选择根据物理特性直观选择1）根据）根据可

40、可见标见标志志选择选择如根据亲本原生质体含有的如根据亲本原生质体含有的色素色素，对融合产物进行鉴定，对融合产物进行鉴定，在其可辨特征消失之前，在其可辨特征消失之前，将其从混合群体中分离出来单独培养。将其从混合群体中分离出来单独培养。主要用于主要用于非绿色非绿色原生质体原生质体 与含有与含有叶绿体叶绿体的原生质体的融合。的原生质体的融合。第51页，此课件共63页哦用用不同荧光染料不同荧光染料标记标记2种原生质体，种原生质体，杂种存在杂种存在2种荧光染料。种荧光染料。在酶解时，在酶解时，染料染料 0.5mg/L，加到酶混合液中。，加到酶混合液中。异硫氰酸荧光素（绿）异硫氰酸荧光素（绿）碱性蕊香红荧

41、光素（红）碱性蕊香红荧光素（红）2）根据）根据荧荧光光标记选择标记选择第52页，此课件共63页哦用发不同荧光的用发不同荧光的荧光染料标记荧光染料标记第53页，此课件共63页哦3）低密度植板）低密度植板选择选择把原生质体以低密度植板在把原生质体以低密度植板在琼脂培养基琼脂培养基上，上，以便以便追踪追踪个别的杂种细胞及它们的后代。个别的杂种细胞及它们的后代。第54页，此课件共63页哦1）激素激素自主性互自主性互补选择补选择2个个亲本亲本原生质体生长，原生质体生长，需要需要生长激素，生长激素，杂种杂种自身能自身能产生产生生长激素。生长激素。无激素无激素培养基培养基筛选筛选。Carson筛选出粉蓝筛选

42、出粉蓝烟草烟草和朗氏烟草的杂种细胞。和朗氏烟草的杂种细胞。2.互补筛选法互补筛选法第55页，此课件共63页哦2）野生型与白化）野生型与白化突突变变互互补补选择选择矮牵牛矮牵牛白化突变体白化突变体与与绿色野生型绿色野生型矮牵牛（不同种）矮牵牛（不同种）原生质体融合后，植板在原生质体融合后，植板在MS培养基上。培养基上。绿色野生型矮牵牛绿色野生型矮牵牛原生质体在很小的细胞团阶段就遭原生质体在很小的细胞团阶段就遭淘汰淘汰；矮牵牛白化矮牵牛白化突变突变体原生质体、体原生质体、与与杂种杂种原生质体产生原生质体产生愈伤组织愈伤组织；杂种愈伤组织表现杂种愈伤组织表现绿色绿色。第56页，此课件共63页哦3）营

43、营养缺陷型互养缺陷型互补选择补选择2个位点个位点突变（硝酸还原酶）突变（硝酸还原酶）的的烟草烟草突变体突变体原生质体融合后，原生质体融合后，培养在仅以培养在仅以NO3为为N源的培养基上进行筛选，源的培养基上进行筛选，亲本原生质体不生长，亲本原生质体不生长，杂种杂种原生质体原生质体生长生长。第57页，此课件共63页哦4）抗性突）抗性突变变体互体互补选择补选择Power等（等（1976）利用拟矮牵牛和矮牵牛对利用拟矮牵牛和矮牵牛对药物抗性的差异药物抗性的差异选择杂种细胞。选择杂种细胞。限制性培养基（限制性培养基（1mg/L 放线菌素放线菌素-D）上）上拟矮牵牛拟矮牵牛原生质体只能形成原生质体只能形

44、成小细胞团小细胞团；矮牵牛矮牵牛原生质体能原生质体能分化分化植株，但植株植株，但植株不能生长不能生长；杂种杂种能分化发育成能分化发育成完整植株完整植株。第58页，此课件共63页哦5）基因互）基因互补选择补选择烟草烟草2个个光敏感叶绿体缺失突变体光敏感叶绿体缺失突变体（S和和V）正常光照下，生长缓慢，叶片淡绿；正常光照下，生长缓慢，叶片淡绿；二者原生质体融合后，二者原生质体融合后，杂种杂种能形成绿色能形成绿色愈伤愈伤组织，组织，并再生并再生植株植株。第59页，此课件共63页哦根据根据愈伤愈伤组织生长差别选择组织生长差别选择 一般，一般，杂种杂种愈伤组织生长愈伤组织生长优势优势明显。明显。植株植株

45、再生再生能力的差别选择能力的差别选择 一方亲本原生质体一方亲本原生质体不能再生不能再生植株，植株，而另一方和融合体而另一方和融合体能再生植株能再生植株进行选择，进行选择，然后采取策略将另一亲本然后采取策略将另一亲本未融合的细胞未融合的细胞淘汰。淘汰。根据生长和分化对培养基要求的差别选择根据生长和分化对培养基要求的差别选择3.根据生长和再生能力的差别选择根据生长和再生能力的差别选择第60页，此课件共63页哦1.形态学鉴定形态学鉴定杂种杂种植株表型往往介于植株表型往往介于两亲本之间两亲本之间；2.细胞学观察细胞学观察杂种细胞的核、杂种细胞的核、染色体（数目）染色体（数目）、细胞器等；、细胞器等；3.分子生物学分子生物学限制性内切酶对限制性内切酶对胞质胞质DNA进行酶切分析。进行酶切分析。4.生化鉴定生化鉴定酶、色素等，酶、色素等，同工酶分析法同工酶分析法四、杂种植株的鉴定四、杂种植株的鉴定第61页，此课件共63页哦原原生生质质体体培培养养程程序序示示意意图图第62页，此课件共63页哦感感谢谢大大家家观观看看第63页，此课件共63页哦