实验一显微摄影技术讲稿.ppt

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1、实验一显微摄影技术第一页，讲稿共二十七页哦一、实验目的一、实验目的1 1、了解光学显微镜结构原理并熟练掌握其操、了解光学显微镜结构原理并熟练掌握其操作方法；作方法；2 2、掌握显微摄影技术操作流程，了解传统摄、掌握显微摄影技术操作流程，了解传统摄影技术中照片洗印操作流程；影技术中照片洗印操作流程；3 3、了解暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显、了解暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、微分干涉差显微镜、倒置显微镜、微镜、微分干涉差显微镜、倒置显微镜、等的构造和使用方法。等的构造和使用方法。第二页，讲稿共二十七页哦二、实验原理二、实验原理 显微镜的放大效能是由其照明系统所使用光的波长显微镜的放大效

2、能是由其照明系统所使用光的波长和透镜系统的数值孔径决定，缩短使用的光波长或增加和透镜系统的数值孔径决定，缩短使用的光波长或增加数值孔径可以提高分辨率。数值孔径可以提高分辨率。可见光的光波振幅较窄，因此使用较短波长的紫可见光的光波振幅较窄，因此使用较短波长的紫外光作为光源系统，可以提高分辨率。而对于一台普外光作为光源系统，可以提高分辨率。而对于一台普通光学显微镜，一般来说，提高其分辨率主要通过提通光学显微镜，一般来说，提高其分辨率主要通过提高数值孔径（选用镜口角大的透镜，提高介质折射率）高数值孔径（选用镜口角大的透镜，提高介质折射率）。第三页，讲稿共二十七页哦基础知识基础知识显微镜概述：显微镜概

3、述：显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同，可分为光学显微镜显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同，可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以可见光（紫外线显微镜以紫外光）为光源，和电子显微镜两大类。前者以可见光（紫外线显微镜以紫外光）为光源，后者则以电子束为光源。后者则以电子束为光源。1.1.光学显微镜光学显微镜 普通生物显微镜由普通生物显微镜由3 3部分构成：部分构成：照明系统：包括光源和聚光器。照明系统：包括光源和聚光器。光学放大系统：由物镜和目镜组成，光学放大系统：由物镜和目镜组成，是显微镜的主体。是显微镜的主体。机械装置：用于固定材料和观察方便，机械装置：用于固定材料和观察方便，

4、包括镜台包括镜台(载物台载物台)、调节器和、调节器和、物镜转换器物镜转换器(旋转器旋转器)等。等。尼康E-600显微镜 第四页，讲稿共二十七页哦光学显微镜基本结构光学显微镜基本结构：1.照明灯照明灯(Lamp)2.聚光器聚光器(Condenser)3.载物台和切片夹载物台和切片夹(Mechanical stage and specimen retainer)4.推进器推进器(Mechanical stage adjustment knob)5.物镜物镜(Objectives)6.粗细螺旋粗细螺旋(Course and fine focus knob)7.目镜目镜(Oculars)8.照相机等接

5、口照相机等接口(Connection to camera,etc.)第五页，讲稿共二十七页哦2.荧光显微镜 尼康E800荧光DIC显微镜 荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）第六页，讲稿共二十七页哦荧光显微镜荧光显微镜(Fluorescence microscope)(Fluorescence microscope)：以以紫外线为光源紫外线为光源,用以照射被检物体，使之用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。所在位置。用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等

6、。质的分布及定位等。细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。行定性和定量研究的工具之一。第七页，讲稿共二十七页哦3.3.激光共聚焦激光共聚焦扫描显微镜扫描显微镜 LCSM照片蓝色为细胞核，绿色为微管 第八页，讲稿共二十七页哦 用用激光作扫描光源激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速

7、扫描成像，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短，光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力有较高的分辨力，大，大约是普通光学显微镜的约是普通光学显微镜的3 3倍。倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的

8、图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。样品的立体结构。激光共聚焦扫描显微镜既可以用于激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。的测量。第九页，讲稿共二十七页哦4.暗视野显微镜 暗视野显微镜（暗视野显微镜（dark field microscopedark field microscope）的聚光镜中央有当）的聚光镜中央有当光片，使照明光线不直接进人物镜，只允

9、许被标本反射和衍射的光光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至种显微镜能见到小至 4-200nm4-200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高的微粒子，分辨率可比普通显微镜高5050倍倍。5.相差显微镜 一种介壳虫的染色体一种介壳虫的染色体 第十页，讲稿共二十七页哦 相差显微镜相差显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。活细胞。活细胞和未染色的生物标本，因细胞各部细微结构活细胞和未染色的生物标本，因

10、细胞各部细微结构的折射率和厚度的不同，光波通过时，波长和振幅并的折射率和厚度的不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位发生变化不发生变化，仅相位发生变化(振幅差振幅差)，这种振幅差人，这种振幅差人眼无法观察。而相差显微镜通过改变这种相位差，并眼无法观察。而相差显微镜通过改变这种相位差，并利用光的衍射和干涉现象，利用光的衍射和干涉现象，把相差变为振幅差来观察活把相差变为振幅差来观察活细胞和未染色的标本。细胞和未染色的标本。相差显微镜和普通显微镜的区别是相差显微镜和普通显微镜的区别是:用环状光阑代用环状光阑代替可变光阑，替可变光阑，用带相板的物镜代替普通物镜，并带有一用带相板的物镜代替普通

11、物镜，并带有一个合轴用的望远镜。个合轴用的望远镜。第十一页，讲稿共二十七页哦6.偏光显微镜偏光显微镜 将普通光改变为偏振光进行镜检的方法，以鉴别某一物质是单折射将普通光改变为偏振光进行镜检的方法，以鉴别某一物质是单折射（各向同行）或双折射性（各向异性）。（各向同行）或双折射性（各向异性）。偏光显微是鉴定物质细微结构光学性质的一种显微镜。凡具有双偏光显微是鉴定物质细微结构光学性质的一种显微镜。凡具有双折射性的物质，在偏光显微镜下就能分辨的清楚，当然这些物质也可折射性的物质，在偏光显微镜下就能分辨的清楚，当然这些物质也可用染色法来进行观察，但有些则不可能，而必须利用偏光显微镜。用染色法来进行观察，

12、但有些则不可能，而必须利用偏光显微镜。双折射性是晶体的基本特征。因此，偏光显微镜被广泛地应用在矿物、双折射性是晶体的基本特征。因此，偏光显微镜被广泛地应用在矿物、化学等领域。在生物学中，很多结构也具有双折射性，这就需要利用偏光化学等领域。在生物学中，很多结构也具有双折射性，这就需要利用偏光显微镜加以区分。在植物学方面，如鉴别纤维、染色体、纺锤丝、淀粉粒、显微镜加以区分。在植物学方面，如鉴别纤维、染色体、纺锤丝、淀粉粒、细胞壁以及细胞质与组织中是否含有晶体等。在植物病理上，病菌的入侵，细胞壁以及细胞质与组织中是否含有晶体等。在植物病理上，病菌的入侵，常引起组织内化学性质的改变，可以偏光显微术进行

13、鉴别。在人体及动物常引起组织内化学性质的改变，可以偏光显微术进行鉴别。在人体及动物学方面，常利用偏光显微术来鉴别骨骷、牙齿、胆固醇、神经纤维、肿瘤学方面，常利用偏光显微术来鉴别骨骷、牙齿、胆固醇、神经纤维、肿瘤细胞、横纹肌和毛发等。细胞、横纹肌和毛发等。第十二页，讲稿共二十七页哦7.微分干涉差显微镜微分干涉差显微镜nDICDIC显微镜其优点是能显示结构的三维立体显微镜其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。体感更强。DIC显微镜下的硅藻（伪彩色）第十三页

14、，讲稿共二十七页哦8.倒置显微镜 组成和普通显微镜一样，组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。具有相差物镜。第十四页，讲稿共二十七页哦9.透射电子显微镜 JEM-1011透射电子显微镜 莱卡超薄切片机 第十五页，讲稿共二十七页哦u用透过样品的用透过样品的电子束电子束使其成像的电子显微镜。使其成像的电子显微镜。u在光学显微镜下无法看清在光学显微镜下无法看清亚显微结构或超微亚显微结构或超微结构。结构。电子束的波长要比可见光和紫外光短电

15、子束的波长要比可见光和紫外光短得多。目前得多。目前TEMTEM的分辨力可达的分辨力可达0.2nm0.2nm。u由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度约标本须制成厚度约50nm50nm左右的左右的超薄切片超薄切片。这。这种切片需要用超薄切片机种切片需要用超薄切片机（ultramicrotomeultramicrotome）制作。电子显微镜的放）制作。电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍大倍数最高可达近百万倍 第十六页，讲稿共二十七页哦要知道的几个重要的分辨率要知道的几个重要的分辨率n人眼：人眼：0.2mm0.2mmn光学显微镜：光学显微镜：0.

16、2um0.2umn电子显微镜：电子显微镜：0.2nm0.2nm第十七页，讲稿共二十七页哦内质网透射电镜图（伪彩色）内质网透射电镜图（伪彩色）冰冻蚀刻电镜照片冰冻蚀刻电镜照片 第十八页，讲稿共二十七页哦10.扫描电子显微镜 JEOLJEOL扫描电子显微镜扫描电子显微镜 人类血细胞SEM照片 第十九页，讲稿共二十七页哦厚标本和薄标本厚标本和薄标本厚标本和薄标本厚标本和薄标本4-5 um4-5 um2um2um基础知识基础知识第二十页，讲稿共二十七页哦n显微摄影装置的安装与调试显微摄影装置的安装与调试nn显微镜的光路调整显微镜的光路调整nn装入胶片装入胶片nn取景聚焦取景聚焦nn暴光暴光:1/15s

17、ec(应先测光应先测光:绿灯亮可以正确暴光绿灯亮可以正确暴光)nn黑白胶片的冲洗黑白胶片的冲洗:显影显影 3min停显停显 10sec定影定影 15min水洗水洗:流水冲洗流水冲洗30min 晾干晾干nn印相放大印相放大:取景聚焦取景聚焦暴光暴光显影显影 停显停显 10sec定影定影 15min水洗水洗:流水冲流水冲洗洗30min nn上光剪切上光剪切三、传统胶片显微摄影过程第二十一页，讲稿共二十七页哦显微摄影技术利利用用显显微微摄摄影影装装置置拍拍摄摄显显微微镜镜(或或解解剖剖镜镜)视视野中物象的技术称为野中物象的技术称为显微摄影显微摄影。显微摄影技术主要包括两个方面：显微摄影技术主要包括两

18、个方面：1)1)拍摄：拍摄：需要一套完备的显微摄影装置需要一套完备的显微摄影装置 2)2)洗印放大洗印放大：需要一个较好的暗室和成套的洗印需要一个较好的暗室和成套的洗印放大设备。放大设备。第二十二页，讲稿共二十七页哦三、实验用品三、实验用品n双目显微镜，生物标本，擦镜纸等双目显微镜，生物标本，擦镜纸等四、实验内容四、实验内容1 1、双目显微镜的操作规范：、双目显微镜的操作规范：取送取送放置放置对光对光低倍物镜使用低倍物镜使用高倍物镜使用高倍物镜使用油镜使用油镜使用保养维护保养维护第二十三页，讲稿共二十七页哦 显微镜使用及绘图显微镜使用及绘图（1）取、放显微镜的正确做法）取、放显微镜的正确做法

19、一手握镜臂，一手托镜座，托在胸前。小心轻放，避免震动。一手握镜臂，一手托镜座，托在胸前。小心轻放，避免震动。放在放在距离桌边距离桌边5-10cm5-10cm左右为好。左右为好。（2）对光）对光 先将先将低倍物镜对准通光孔低倍物镜对准通光孔，调整反光镜（外光源显微镜）或电源，调整反光镜（外光源显微镜）或电源电压（内光源显微镜），使视野中的光线电压（内光源显微镜），使视野中的光线明亮而不刺眼明亮而不刺眼。也可。也可以改变孔径光圈或改变聚光器的位置达到改变照明的目的，以改变孔径光圈或改变聚光器的位置达到改变照明的目的，但反光镜一定要调到最佳的角度。但反光镜一定要调到最佳的角度。（3）放置标本）放置标

20、本 将标本放在载物台上，固定好。将将标本放在载物台上，固定好。将玻片中有标本的地方移到通光孔玻片中有标本的地方移到通光孔的中央的中央。如果位置不是在中央，因为物镜的观察范围有限，有可能观。如果位置不是在中央，因为物镜的观察范围有限，有可能观察不到所要看到的内容。察不到所要看到的内容。第二十四页，讲稿共二十七页哦显微镜的正确使用方法显微镜的正确使用方法（4）调整焦距）调整焦距 眼眼睛睛不不要要看看目目镜镜，要要从从侧侧面面注注视视低低倍倍镜镜与与标标本本。慢慢慢慢转转动动粗粗准准焦焦距距螺螺旋旋，使使物物镜镜与与玻玻片片标标本本接接近近。待待目目测测低低倍倍镜镜与与标标本本盖盖玻玻片片之之间间的

21、的距距离离比比低低倍倍物物镜镜的的工工作作距距离离（7.63mm7.63mm）小小一一些些时时，即即可可注注视视目目镜镜，并并向向相相反反的的方方向向调调节节粗粗准准焦焦螺螺旋旋，使使物物镜镜与与标标本本的的距距离离增增大大，慢慢慢慢会会看看到到视视野野中中物物像像的的出出现现。注注意意这这一一操操作作如如果果违违章章有有可可能能会会损损坏坏仪器或标本！仪器或标本！（5）使用低倍镜观察）使用低倍镜观察 移动标本，找到要观察的位置。用移动标本，找到要观察的位置。用细准焦螺旋细准焦螺旋调清物像。调清物像。（6）使用高倍镜观察）使用高倍镜观察 将将需需观观察察的的位位置置移移到到显显微微镜镜视视野野

22、的的中中央央，将将高高倍倍镜镜换换入入即即可可。使用高倍镜前一定要用低倍镜进行观察。不可直接用高倍镜。使用高倍镜前一定要用低倍镜进行观察。不可直接用高倍镜。第二十五页，讲稿共二十七页哦显微镜的正确使用方法显微镜的正确使用方法（7）使用油镜观察）使用油镜观察 在在观观察察细细小小结结构构时时需需要要使使用用100100倍倍的的物物镜镜。100100倍倍的的物物镜镜需需要要在在油油的的介介质质中中工工作作，故故称称油油镜镜或或油油浸浸物物镜镜。油油镜镜需需在在物物镜镜与与标标本本之之间间充充上上一一种种折折光光率率与与玻玻璃璃一一样样高高的的介介质质，通通常常使使用用香香柏柏油油，才才能能使使物物

23、像像清清晰晰。方法是方法是先低倍，后高倍，再用油镜先低倍，后高倍，再用油镜。（8 8）显微镜用后）显微镜用后 应应先先转转动动物物镜镜转转换换器器，将将高高倍倍物物镜镜或或油油镜镜旋旋出出通通光光孔孔的的上上方方，再再取取下下玻玻片片标标本本。一一定定要要及及时时清清除除油油镜镜上上的的油油。将将反反光光镜镜放放在在竖竖直直的的位位置置，以以减减少少落落上上灰灰尘尘。保保持清洁，持清洁，罩好防尘罩罩好防尘罩。第二十六页，讲稿共二十七页哦生物绘图方法生物绘图方法（1）看清楚）看清楚 把把正正常常的的、一一般般的的结结构构与与偶偶然然的的、人人为为的的一一些些结结构构区区分分开开，然后选择那些有代

24、表性的典型的部位进行绘图。然后选择那些有代表性的典型的部位进行绘图。（2 2）定位置）定位置 先先确确定定要要画画的的图图在在实实验验报报告告纸纸上上的的位位置置和和大大小小，力力求求布布局局合合理理、美美观观，不不能能任任意意的的无无计计划划的的画画图图，否否则则位位置置不不适适当当或或偏偏在在一一角角、或或过过大大过过小小，影影响响注注字字和和说说明明。考考虑虑在在左左侧侧一一边边留留一一定定边边缘缘，以备装订之用。以备装订之用。（3 3）定大小）定大小 一一般般尽尽可可能能的的把把图图画画大大些些。如如果果是是细细胞胞图图，为为了了清清楚楚表表明明细细胞胞内内部部结结构构，所所画画细细胞胞不不宜宜过过多多，1 12 2个个即即可可，但但每每个个细细胞胞的的各各个个部部分分按按同同比比例例适适当当放放大大，如如画画轮轮廓廓图图或或图图解解图图，也也不不一一定定把把全全部部切切面面（如如根根茎茎的的横横切切面面图图）画画出出，根根据据需需要要画画出出1/21/21/81/8即可。即可。第二十七页，讲稿共二十七页哦