实验一氨基酸的分离鉴定——纸层析法%3f.ppt

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1、氨基酸的分离鉴定氨基酸的分离鉴定纸层析法纸层析法生物化学实验之一生物化学实验之一生物化学实验之一生物化学实验之一安徽师范大学生科院生化教研室一、实验目的一、实验目的1.1.掌握纸上层析的一般原理和方法掌握纸上层析的一般原理和方法2.2.了解氨基酸的特征性颜色反应了解氨基酸的特征性颜色反应 二、实验原理二、实验原理l纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具纸层析是以滤纸为惰性支持物的分配层析。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。当有机有亲水性，吸附一层水作为固定相，有机溶剂为流动相。当有机相流经固定相时，物质在两相间不断分配而得到分离。相流经固定相

2、时，物质在两相间不断分配而得到分离。l溶质在滤纸上的移动速度用溶质在滤纸上的移动速度用Rf值表示：值表示：Rf =原点到层析斑点中心的距离原点到层析斑点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离原点到溶剂前沿的距离=X/Y=X/Yl在一定的条件下某种物质的在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。值是常数。Rf值的大小与物质的值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。本实验利用纸层析法分离氨基酸。三、实验器材三、实验器材（1 1）层析缸）层析缸（2 2）毛细管：）毛细管：5 5只只/组。组

3、。（3 3）培养皿：）培养皿：1 1只只/组。组。（4 4）层析滤纸（长）层析滤纸（长16cm16cm、宽、宽16cm16cm的）：的）：1 1张张/组。组。（5 5）直尺、铅笔：自备。）直尺、铅笔：自备。（6 6）电吹风：）电吹风：1 1只只/组。组。（7 7）针、白线：）针、白线：1 1套套/组。组。（8 8）小试管：）小试管：4 4只只/组组 四、实验试剂四、实验试剂1.1.展层剂和平衡液展层剂和平衡液 正丁醇正丁醇:冰醋酸冰醋酸:水水=4:1:5=4:1:5，充分摇匀，用分液漏斗取上层液作展，充分摇匀，用分液漏斗取上层液作展层剂；下层液作平衡液层剂；下层液作平衡液(弃去弃去)。2.2.

4、样品液样品液 用水配成每用水配成每mlml含有丝氨酸、亮氨酸、脯氨酸各含有丝氨酸、亮氨酸、脯氨酸各4mg/ml4mg/ml的氨基酸溶的氨基酸溶液，以及上述四种氨基酸的混合液液，以及上述四种氨基酸的混合液(各各4mg/ml)4mg/ml)。3.3.茚三酮茚三酮 按展层剂按展层剂0.25%0.25%的比例将茚三酮加入展层剂中，使其溶解。的比例将茚三酮加入展层剂中，使其溶解。实验试剂实验试剂 五、实验操作五、实验操作l检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净检查培养皿是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内并置于干燥箱内120120烘干。烘干。（2 2）规划：取宽约）规划：取宽约16cm16cm

5、、高约、高约16cm16cm的层析滤纸一张。在纸的层析滤纸一张。在纸的下端距边缘的下端距边缘2cm2cm处轻轻用铅处轻轻用铅笔划一条平行于底边的直线笔划一条平行于底边的直线A A，在直线上做，在直线上做4 4个记号，记号个记号，记号之间间隔之间间隔2cm2cm，这就是原点的，这就是原点的位置。另在距左边缘位置。另在距左边缘1cm1cm处画处画一条平行于左边缘的直线一条平行于左边缘的直线B B，在在B B线上以线上以A A、B B两线的交点为两线的交点为原点标明刻度（以厘米为单原点标明刻度（以厘米为单位），参见左图。位），参见左图。（3 3）点样：在每个圈下用铅笔记上每种氨基酸的代号）点样：在每

6、个圈下用铅笔记上每种氨基酸的代号(混合样可写混合样可写M)M)，然，然后用毛细管吸取样品，轻轻地点到相应的氨基酸圈内，待晾干或用冷风后用毛细管吸取样品，轻轻地点到相应的氨基酸圈内，待晾干或用冷风吹干后再点第二次。前三种氨基酸各点吹干后再点第二次。前三种氨基酸各点3 3次，混合液点次，混合液点6 6次。将点过样的次。将点过样的滤纸用针线卷成筒状（点样面向内），注意纸的两边不能接触，留一定滤纸用针线卷成筒状（点样面向内），注意纸的两边不能接触，留一定缝隙。缝隙。（4 4）层析：将培养皿中放入）层析：将培养皿中放入2/32/3量的展层剂，迅速放置于层析缸中。把滤量的展层剂，迅速放置于层析缸中。把滤纸

7、筒转移到此培养皿内，样品端向下垂直放置，切勿使展层剂浸到样品纸筒转移到此培养皿内，样品端向下垂直放置，切勿使展层剂浸到样品点。当溶剂前沿到达滤纸点。当溶剂前沿到达滤纸2/32/3处，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿。处，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿。l（5 5）显色：热风吹干滤纸）显色：热风吹干滤纸至显出氨基酸斑点，用铅至显出氨基酸斑点，用铅笔描出轮廓。参见左图。笔描出轮廓。参见左图。l（6 6）计算各种氨基酸的）计算各种氨基酸的Rf值，并判断混合样品中值，并判断混合样品中都有哪些氨基酸，各人将自己的实验结果贴在实都有哪些氨基酸，各人将自己的实验结果贴在实验报告上，见表验报告上，见表3-23-2。

8、l（7 7）倒掉用过的展层液，将培养皿洗净，整理好）倒掉用过的展层液，将培养皿洗净，整理好桌面上的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台，桌面上的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台，请老师验收，实验报告当场交给老师。请老师验收，实验报告当场交给老师。l（8 8）计算）计算 Rf纸层析结果纸层析结果丝氨酸丝氨酸 脯氨酸脯氨酸 亮氨酸亮氨酸 待测氨基酸待测氨基酸 原点到层析斑点原点到层析斑点中心的距离中心的距离 原点到溶剂前沿原点到溶剂前沿的距离的距离 Rf判断待测氨基酸判断待测氨基酸 思考题思考题1、氨基酸纸上层析用哪种物质作为显色剂?这种显色剂与哪些氨基酸反应不产生蓝紫色?写出这种显色剂与氨基酸反应的反应式。2.何谓Rf值？影响Rf值的主要因素是什么?