生化工艺——第四章沉淀.ppt
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1、第四章第四章 沉淀技术沉淀技术第一节第一节 蛋白质沉淀的基本原理蛋白质沉淀的基本原理第二节第二节 蛋白质沉淀技术实施蛋白质沉淀技术实施学习目标学习目标n了解蛋白质的基本性质;了解蛋白质的基本性质;n掌握蛋白质沉淀的基本原理;掌握蛋白质沉淀的基本原理;n掌握沉淀技术的基本方法;掌握沉淀技术的基本方法;n能够正确进行蛋白质的沉淀分离操作,并能分能够正确进行蛋白质的沉淀分离操作,并能分析影响沉淀的有关因素。析影响沉淀的有关因素。沉淀的定义沉淀的定义 沉淀技术沉淀技术是通过加入试剂或改变是通过加入试剂或改变条件,使溶液中的溶质离开溶液生条件,使溶液中的溶质离开溶液生成不溶性颗粒而沉降析出的技术。成不溶
2、性颗粒而沉降析出的技术。沉淀技术的特点及适用范围沉淀技术的特点及适用范围优点优点:操作简便、生产所需的原材料易得、成本低:操作简便、生产所需的原材料易得、成本低廉,在产物浓度越高的溶液中收率越高,既可以用于廉,在产物浓度越高的溶液中收率越高,既可以用于实验室,也可以进行工业规模化生产。实验室,也可以进行工业规模化生产。缺点:缺点:产品质量较低,一般情况需要精制,过滤比产品质量较低,一般情况需要精制,过滤比较困难。较困难。沉淀分离目前广泛应用于沉淀分离目前广泛应用于蛋白质等生物产物蛋白质等生物产物的分离。的分离。过程。过程。第一节第一节 蛋白质沉淀的基本原理蛋白质沉淀的基本原理蛋白质表面特性蛋白
3、质组成蛋白质表面特性蛋白质组成蛋白质组成蛋白质组成蛋白质折叠趋势蛋白质折叠趋势结果结果 在蛋白质三维结构中仍会有部分疏水性在蛋白质三维结构中仍会有部分疏水性氨基酸残基暴露于表面,在蛋白质表面形成氨基酸残基暴露于表面,在蛋白质表面形成一定的疏水区一定的疏水区 影响蛋白质溶解度的主要因素影响蛋白质溶解度的主要因素蛋白质性质的因素蛋白质性质的因素溶液性质的因素溶液性质的因素二、蛋白质胶体溶液的稳定性二、蛋白质胶体溶液的稳定性胶体的定义胶体的定义n胶体是一种尺寸在1100 nm以至1000 nm的分散体。它既非大块固体,又不是分子分散的液体,而是具有两相的微不均匀分散体系。-被遗忘了尺寸的世界Wilh
4、elm Friedrich Ostwald(1853 1932)胶体的性质胶体的性质n布朗运动布朗运动n丁达尔现象丁达尔现象n电泳现象电泳现象n粘度大粘度大n不能透过半透膜的性质等。不能透过半透膜的性质等。蛋白质表面特性蛋白质性质蛋白质表面特性蛋白质性质n蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质 n蛋白质的两性电离和等电点蛋白质的两性电离和等电点 n蛋白质的变性蛋白质的变性 蛋白质表面特性蛋白质表面特性沉淀屏障沉淀屏障n蛋白质分子周围的水化层蛋白质分子周围的水化层n分子间的静电排斥作用分子间的静电排斥作用-双电层双电层 蛋白质表面特性蛋白质表面特性沉淀策略及方法沉淀策略及方法n策略策略 破坏蛋白质四周
5、水化层破坏蛋白质四周水化层 降低双电层厚度降低双电层厚度 n沉淀方法沉淀方法 改变溶液改变溶液pH值值 加入无机盐或改变无机盐种类加入无机盐或改变无机盐种类 加入水溶性有机溶剂加入水溶性有机溶剂 添加脱水剂添加脱水剂 蛋白质表面特性蛋白质表面特性常用的沉淀技术常用的沉淀技术n盐析沉淀盐析沉淀n有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀n选择性变性沉淀选择性变性沉淀n等电点沉淀等电点沉淀n聚合物沉淀聚合物沉淀n聚电解质沉淀聚电解质沉淀 n金属离子沉淀金属离子沉淀第二节蛋白质沉淀技术的实施第二节蛋白质沉淀技术的实施一、盐析沉淀一、盐析沉淀n定义定义 蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、蛋白质在高离子强度的溶液中溶
6、解度降低、发生沉淀的现象称为盐析(发生沉淀的现象称为盐析(Salting-out)n溶解度与溶解度与I I的关系的关系Cohn经验经验方程方程 盐析沉淀盐析沉淀-盐析原理盐析原理n n当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现两种当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现两种情况:情况:(1 1)“盐溶盐溶”现象现象低盐浓度下,蛋白质溶解低盐浓度下,蛋白质溶解度增大度增大 原因原因?(2 2)“盐析盐析”现象现象高盐浓度下,蛋白质溶解高盐浓度下,蛋白质溶解度随之下降度随之下降 原因原因?盐析沉淀盐析沉淀-盐析原理图示盐析原理图示盐析沉淀的影响因素盐析沉淀的影响因素1 1、无机盐的种类和浓度、无机盐的种类和
7、浓度无机盐种类无机盐种类影响到影响到CohnCohn方程中的盐析常数方程中的盐析常数 无机盐的选择无机盐的选择结论:结论:a a 不同种类的盐主要影响盐析常数不同种类的盐主要影响盐析常数KsKs;b b 离离子子半半径径小小,带带电电多多,电电荷荷密密度度高高,盐盐析析效效果果好。好。最常用最常用(NHNH4 4)2 2SOSO4 4优点:溶解度(优点:溶解度(767767g/Lg/L)符合上述要求;符合上述要求;缺点:水解后溶液缺点:水解后溶液pHpH降低,在高降低,在高 pHpH下产氨,下产氨,腐蚀性强,有异味,有毒,终产物必须除尽。腐蚀性强,有异味,有毒,终产物必须除尽。次常用次常用Na
8、Na2 2SOSO4 4。缺点:在缺点:在40400 0C C以下溶解度较以下溶解度较低,主要用于热稳定蛋白。低,主要用于热稳定蛋白。还有还有NaClNaCl。无机盐的选择无机盐的选择盐析沉淀的影响因素盐析沉淀的影响因素2 2、蛋白质的浓度、蛋白质的浓度 高浓度的蛋白质用低的饱和度即可将其沉淀,但高浓度的蛋白质用低的饱和度即可将其沉淀,但若浓度过高,则易共沉淀作用,除杂效果会明显下降。若浓度过高,则易共沉淀作用,除杂效果会明显下降。低浓度的蛋白质,要使用大的硫酸铵饱和度,但低浓度的蛋白质,要使用大的硫酸铵饱和度,但共沉淀作用小,分离纯化效果较好,但回收率会降低共沉淀作用小,分离纯化效果较好,但
9、回收率会降低.通常认为比较适中的蛋白质浓度是通常认为比较适中的蛋白质浓度是2.52.53.03.0,相当于相当于25 25 mg/mg/mLmL30mg/30mg/mLmL。盐析沉淀的影响因素盐析沉淀的影响因素3、溶液pHpH影响Cohnx方程中的值。见图pH值值接近蛋白质接近蛋白质pI值时,蛋白质溶解度最小。值时,蛋白质溶解度最小。盐析沉淀的影响因素盐析沉淀的影响因素4、温度 在在低离子强度低离子强度溶液中,溶液中,蛋白质的溶解度在一定的温蛋白质的溶解度在一定的温度范围内随着度范围内随着温度升高而增温度升高而增大大 在在高离子强度高离子强度溶液中,溶液中,温度的升高温度的升高利于蛋白质脱水,
10、利于蛋白质脱水,破坏水化层破坏水化层,导致蛋白质导致蛋白质溶溶解度的降低解度的降低 低温(低温(0-4 0-4)避免失活)避免失活n n饱和度(饱和度(SaturationSaturation)的概念:的概念:以硫酸铵为例:以硫酸铵为例:25250 0C C时,硫酸铵的饱和溶解度是时,硫酸铵的饱和溶解度是767767g/Lg/L定义为定义为100%100%饱和度饱和度其它数据见附录其它数据见附录盐析操作(以硫酸铵为例)目的:目的:确定沉淀目确定沉淀目标蛋白蛋白质所需硫酸所需硫酸铵饱和度(和度(设操作温度操作温度为0):):盐析操作盐析操作-溶解度曲线确定溶解度曲线确定各级均离各级均离心分离沉心
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