毛细管电泳分析解析.ppt

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1、高效毛细管电泳高效毛细管电泳内容摘要内容摘要1概述概述2基本理论基本理论3毛细管电泳仪毛细管电泳仪4电极液电极液5进样方式进样方式6毛细管电泳的分离模式毛细管电泳的分离模式1概述概述1.1高效毛细管电泳提出高效毛细管电泳提出高 效 毛 细 管 电 泳(HighPerformanceCapillaryElectrophoresis，简称HPCE)，广义的说，是泛指在极细的管内实现具有高效、快速、灵敏度高的一大类电泳分析技术，称之为高效毛细管电泳。高效毛细管电的发展过程大致分为以下几个阶段1967年Hjerten首先提出在高电场强度下，采用管径为3mm的毛细管进行自由溶液的区带电泳。1974年Vi

2、rtan采用内径为200500m的毛细管进行电泳，使毛细管的内径缩小了615倍。1981年Jorgenson和Lukass使用内径为75m的毛细管进行电泳，使毛细管的内径缩小了36倍。1984年Terabe等把胶束电泳技术引入到毛细管电泳中，为今后发展新型的毛细管电泳分离模式提供了依据。1987年H.Jerten把等电聚焦电泳、凝胶电泳引入到毛细管电泳中。1989年改用10-25m的毛细管电泳,并获得满意的分离效果1994年又推出了25m的毛细管柱，使得毛细管电泳在分析领域有了很大的发展。1.2HPCE的优点：的优点：(1)毛细管内径小，电泳时使用的电流小(2)毛细管中心与外界的距离很短，电泳

3、产生的焦耳热很快被散去，有效防止电泳条带的扩散。(3)既具有电泳高分辨率的功能，有具备高效液相层析的优点(4)电极液用量少，不破坏生物样品，检测灵敏度高，用激光诱导荧光检测器灵敏度可达10-19g(5)结构简单，操作方便，自动化程度高。1.3常用术语：常用术语：(1)电泳速度电泳速度(ElectrophoreticVelocity，简称Vep)在单位时间内，带电粒子在毛细管内，作定向运动的距离。电泳速度的单位用cm/sec表示。Vep=Ld/tmLd：毛细管入口端至检测器长度tm：电泳时间(2)电场强度电场强度(ElectricFieldStrength，简称E)在确定的毛细管长度（Lt）内两

4、端施加电压所形成的电效应。电场强度的单位是V/cm。电场强度与电压和毛细管长度的关系用公式表示为：E=V/LtV:电压Lt:毛细管两端的总长度(3)电泳淌度电泳淌度(ElectricFieldMobility，简称ep)带电粒子在毛细管中，作定向运动的电泳速度与所在电场强度之比。电泳淌度的单位用cm2/V.sec表示。Ld/tm ep=Vep/E=V/LtVep:电泳速度E：电场强度Ld:毛细管入口端至检测器长度(4)偶电层偶电层(ElectricDoubleLayer，简称EDL)也称之为双电层。在固体物质与溶液交界的表面的某些基团含有排列成一个正负电荷层，在溶液中固体表面某些基团受溶液pH

5、直直的影响，解离带有正电荷或负电荷，有选择性吸收溶液中的某种离子（正离子或负离子）而带电，使溶液中形成一层与固体表面电荷符号相反的离子层，称之为偶电层。(5)电势(Zeta Potential)参与形成双电层被毛细管表面吸附的一层离子与溶液中的游离阳离子之间会产生一个电势，称为毛细管壁Zeta电势。毛细管壁为高电位区，中心点为低电位区，毛细管的半径越大电位差越大，形成的电势越大。(6)电渗流电渗流(ElectroosmeticFlow)用EOF表示在高电压下毛细管电泳溶液中的正电荷与毛细管内壁表面上的负电荷之间相互作用，导致流体朝负极方向运动，这种现象称为电渗流，用EOF表示。一般情况下，电渗

6、流的运动方向与电泳运动方向相反，电渗流迁移速度与电泳速度一样，受电场强度、溶液粘度，Zeta电势等因素有关联。电渗速度(Veo)的表达式为：电渗流迁移速度Veo=E4:电解常数 :毛细管壁与表面平切面的Zeta电势 ：缓冲液黏度 E：电场强度根据毛细管壁引起的电渗流原理。可以推断在溶液pH3的情况下，毛细管电泳中电渗流总是由正极向负极移动。电渗流的大小受到Zeta电势，偶电层厚度和缓冲液粘度等因素的影响。一般情况，电渗流随着电解质浓度的增加而增加，随着pH值的上升（向碱性方向增加）而加大。如图所示。在高pH值溶液中，毛细管壁的负电荷多，吸附溶液中的正离子多，产生的电渗流大。在低pH值溶液中，毛

7、细管壁的负电荷少，吸附溶液中的正离子少，产生的电渗流小。(7)毛细管柱塞流毛细管柱塞流：(CapillaryFlowProfiled)由于毛细管电泳是属于电力驱动分离系统，在毛细管中流体的流型呈扁平的柱塞形状一样向前流动，这种现象称为柱塞流。这种流型有利于防止扩散，提高分离效率，而在压力驱动系统中(如HPLC)的流型呈抛物线形状向前流动，称弧线流型。这种流型容易造成扩散。(8)热效应热效应(JouleHeating)在高电场下毛细管中的电解质和电流发生剧烈的摩擦，产生大量的热，这种自热现象，称之为热效应。2基本理论：基本理论：2.1电泳分离的受力：电泳分离的受力：高效毛细管电泳是利用带电性不同

8、的粒子在电场中迁移，在泳动过程中物质的各组分被分离。被分离物质的迁移率取决于分子的结构、形状和电荷数量等因素，同时受溶液pH值、离子强度、粘度和两性电解质因素的影响。在电泳分离过程中的主要受到三方面的作用力。(1)电场的作用力：电场的作用力：在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下以不同的速度向其所带电荷相反的方向泳动。泳动的速度因分子结构、形状和电荷数量不同而异，利用带电粒子泳动的差异进行分离。(2)支持介质的摩擦力支持介质的摩擦力：支持介质相对于带电粒子是静止的，不运动的。当带电粒子经过支持介质时就会受阻，具有阻止带电粒子前进的作用，带电粒子必须克服介质的阻力前进，产生相应的摩擦力。不同分子结

9、构、形状的带电粒子受阻的程度不同，利用带电粒子受阻的差异进行分离。(3)电渗的反作用力电渗的反作用力：在电场的作用下，双电层中的水合阳离子引起流体整体地朝负极方向移动。粒子在毛细管内电解质中的泳动速度等于电泳和电渗这两种速度的矢量和。带电粒子在毛细管内实际运动的速度（V）有公式(1)表示V=Vep+Veo在常规电泳中，在电渗流影响较小的情况下或只测定电泳的相对速度，电渗的速度可以忽略不计。V=Vep(4)电渗与速度电渗与速度不同性质的离子在同样的电泳条件下的速度阳阳离离子子：运动方向和电渗方向一致，不受电渗反作用力影响，反而受电渗加速度的作用，运动速度最快。其运动速度是带电粒子的电泳速度与电渗

10、加速之和中中性性离离子子：电泳流速度为零，迁移的速度相当于电渗流的速度。其运动速度是带电粒子的电泳速度与电渗加速相等阴离子：阴离子：运动方向与电渗流方向相反，受电渗反作用力影响，电渗速度的反作用，其运动速度是带电粒子的电泳速度与电渗加速之差。利用电渗在电泳过程中产生的反作用力分离不同的带电粒子。2.2毛细管电泳的分类：毛细管电泳的分类：毛细管电泳操作模式有很多，大致分为五类。毛细管区带电泳毛细管区带电泳:(CapillaryZoneElectrophoresis,CZE)毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳:(CapillaryGelElectrophoresis,CGE)毛毛 细细 管管 胶胶 束束

11、 电电 泳泳:(MicellarElectrokineticChromatographyCapillary,MECC)毛细管聚焦电泳毛细管聚焦电泳:(CapillaryIsoelectricFocusing,CIEF)毛细管等速电泳毛细管等速电泳:(CapillaryIsotachophoresis,CITP)2.3毛细管电泳的应用范围毛细管电泳的应用范围：应用范围离子小分子肽类蛋白质类核苷酸类核酸类电CZEMECCCIEFCZECGECGE泳CITPCZEMECCCGEMECC方CIEFCITPCIEF式CGECIEF3毛细管电泳仪的结构：毛细管电泳仪的结构：目前毛细管电泳仪的生产厂家有十几

12、家，产品的型号很多。但是毛细管电泳仪的基本结构相差不大，主要由高压电泳仪、毛细管柱、检测器、电极槽及显示器几部分组成。3.1高压电泳仪高压电泳仪毛细管电泳使用的电源是一种超高压电器装置，一般最高电压可达到3050KV，最大电流为200300mA。超高压电泳仪应具备的条件：有良好的绝缘性能稳定的输出功率可以改变正、负极方向。3.2毛细管柱毛细管柱(1)毛细管性质毛细管性质不同材质制成的毛细管性能有所不同，聚四氟乙烯毛细管聚四氟乙烯毛细管：电渗小，但性能不太稳定。普通玻璃毛细管：普通玻璃毛细管：价格便宜，但电渗大，吸附作用大。石英玻璃毛细管石英玻璃毛细管：性能稳定，电渗较大，但也有一定的吸附。(2

13、)型号型号细管（内经25m）中粗管（内径2575m）粗管（内径100250m）(3)毛细管的改性毛细管的改性：通常在毛细管内壁涂一层亲水性非离子型聚合物(如：聚丙烯酰胺、甲基纤维素等)，这些涂层提高了对生物大分子分离的效率。涂层的方法有两种。物理涂层：物理涂层：将涂料经适当处理在毛细管内侧形成一层薄膜化学涂层：化学涂层：是将涂料通过化学键偶联在毛细管的内侧。3.3检测器：检测器：毛细管电泳配置的检测器与高效液相层析使用的检测器大致相同，都属于超微量分析，对检测器的灵敏度要求比较高，常用的检测器.紫外检测器灵敏度可达到10-17g激光诱发荧光检测器，灵敏度可达到10-19g质谱检测器，灵敏度可达

14、到10-21g核磁共振检测器，灵敏度可达到10-21g3.4制冷系统制冷系统(1)空空气气制制冷冷：在毛细管分析室内输入制冷空气使毛细管迅速冷却，达到制冷的目的。(2)液体制冷液体制冷：在毛细管的夹层中输入制冷液体达到制冷的目的。3.5电极槽电极槽主要与存放电极缓冲液和进样，由于毛细管电泳是超微量分析，电极液用量很少，使用的电泳槽很小。3.6显示器：显示器：通过计算机计算、处理和显示电泳结果。4缓冲液缓冲液缓冲液不但要有良好的导电作用，还要对样品具有很好的稳定作用。4.1缓冲剂缓冲剂：有Tris、borate、histidine、CAPS等。这些缓冲剂配成的缓冲溶液，可以在高浓度下进行电泳，不

15、会产生很大的电流。pH值值：在蛋白质的pI非常接近时，适当的调节缓冲液的pH值对分离是特别有效的。4.2缓冲溶液的添加剂：缓冲溶液的添加剂：常用的添加剂是离子型、非离子型或兼性离子型表面活性剂，如三甲基氨基丙磺酸(CH3)-N+-(CH2)3-SO3-等。表面活性剂作用：配对作用配对作用：疏水性溶质的增溶剂或者形成离子对，改性剂：改性剂：作为毛细管内壁涂层，改良毛细管的性能。隔离作用隔离作用：表面活性剂的烷基链与溶质分子的疏水端相互作用，阻止了溶质分子与毛细管壁吸附层的作用，形成了一个隔离层，提高了毛细管电泳的选择性。图表面活性对分离的影响示意图A:未加表面活性的分离效果,B:加入表面活性的分

16、离效果5进样方式进样方式由于毛细管的内径非常细，其进样方式与常规电泳和层析的进样方式有所不同。毛细管电泳的进样方式主要有两类，一类是电迁移进样，另一类是流体力学进样。5.1电动式进样电动式进样(1)电迁移进样电迁移进样(Electrokinetic)：将毛细管的阳极直接与样品接触，短时间内施加电压，使样品通过电迁移的方式进入毛细管的阳极端。进进样样量量：与溶质浓度，加电压的强度E，电迁移时间t，电迁移速度Vep，电渗速度Veo等因素有关。优点：优点：进样准确，容易控制重复性好。缺点：缺点：对浓度低的组分有歧视效应。(2)电击进样电击进样:在毛细管的阳极端通过电击方法将样液送入毛细管内。进样量：

17、进样量：与溶质浓度C，电击所使用的功率，电击次数等因素有关优点：优点：应用广泛，缺点：缺点：上样两不容易控制。5.2流体力学进样流体力学进样(1)虹吸进样：虹吸进样：进样时将阳极槽抬高形成槽的落差，利用液体重力差将样品吸入阳极端的毛细管内。进样：进样：量与落差、样品浓度、进样时间成正比，与样液粘度成反比优点：优点：操作简便，重复性好。缺点：缺点：比较适于自由电泳，而不是与凝胶电泳。(2)加压进样：加压进样：进样时将阳极端密闭，施加一定的液压把样品吸入毛细管内。进样量：与液压强度、样品浓度、进样时间成正比，与样液粘度成反比。(3)真空进样真空进样利用两端的气压差将样品送入毛细管内。进样量：与真空

18、度、样品浓度、进样时间成正比，与粘度成反比。6毛细管电泳的分离模式：毛细管电泳的分离模式：由于毛细管电泳时在微细的管中进行的，它的操作模和分离机理式与高效液相层析相似，二者之间所不同的是驱动力。前者是电力驱动，后者是压力驱动。6.1毛细管区带电泳毛细管区带电泳(1)原理：原理：毛细管区带电泳，亦称为毛细管自由溶液电泳毛细管区带电泳，是毛细管电泳中最简单的一种分离模式。其分离机理是根据被分离组分的净电荷与质量之间比值，各组分表面电荷密度的差异进行分离的。在进行毛细管电泳时，要求缓冲液具有均一性，毛细管内壁具有恒定的电场强度。(2)分离条件的选择分离条件的选择:工作电压的选择：在进行毛细管电泳时，

19、随着电压的增大，可缩短分离的组分在柱内的停留时间，提高柱效。但是随着电压的增大焦耳热的产生也增多，如果冷却系统不好，柱效反而下降。缓冲液的选择缓冲液的选择：CZE电泳中的缓冲液，一般可选择磷酸、醋酸或硼酸等弱酸作缓冲液。但是缓冲液的pH值和浓度是很重要的，选择的原则是缓冲液的pH值必须比被分离组分的等电点高于或低于1个pH单位以上，以便能得到合适的电泳淌度。常用的缓冲液见下表。表4常用的缓冲液及常用的缓冲液及pH值值缓冲液pH值两性缓冲液pH值磷酸醋酸盐磷酸盐硼酸盐1.143.143.76-5.766.20-8.208.14-10.14MESPIPESHEPESTricne5.15-7.155

20、.80-7.806.55-8.557.15-9.15缓缓冲冲液液的的添添加加剂剂：在缓冲液中加入合适的添加剂，不但可以改善分离的选择性，且还可以改善电泳淌度。常用的添加剂见表5：表5：添加剂与及其功能添加剂功能无机盐有机溶剂尿素磺酸胺类表面活性剂纤维素衍生物改变蛋白质的结构增加溶解度，减少电渗增加蛋白质溶解度，使低聚核苷酸变性增加离子对，起疏水作用覆盖硅烷基团改变毛细管内壁的特性减少电渗起筛泸作用(3)应用应用毛细管区带电泳鉴定核糖核酸酶的纯度，缓冲液：25mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.0,电压15kV,石英毛细管柱，柱长72cm，有效长度50cm，内径50m，紫外检测波长200nm。6.

21、2毛细管凝胶筛分电泳：毛细管凝胶筛分电泳：(1)原理：原理：毛细管凝胶筛分电泳的基本原理与常规的凝胶电泳相同，是在毛细管蛋白，电泳分离峰和标准曲线的线性关系见。内填充了凝胶类多聚物，电泳时对被分离的生物大分子筛分作用。凝胶的分类：可用于毛细管电泳的凝胶主要有两类.无机凝胶无机凝胶：如多孔硅胶，多孔玻璃等。有机凝胶有机凝胶：如葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等。分离生物大分子使用的凝胶主要是有机凝胶。在毛细管凝胶电泳中主要用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺(SDSPAGE)，甲基纤维素，羟基丙基纤维素等。用凝胶毛细管凝胶筛分电泳分离七种不同分子量的标准毛细管电泳分离标准蛋白图谱logMr对相对迁移率标准蛋

22、白曲线从图标准蛋白曲线可以看出，凝胶毛细管电泳分离的线性关系很好。无胶筛分：无胶筛分：使用粘度低的线性聚合物，如甲基纤维素，羟基丙基纤维素等。不加聚合剂处理一单体的形式填充到毛细管内，同样也有和很好的分子筛的作用。因此，把这类填料制成的毛细管称之为无胶筛分。无胶筛分与凝胶筛分所起的作用是相似的。优优点点：凝胶聚合过程中容易产生气泡的弊端、操作简便、毛细管使用寿命长、柱内的填料可以更换。缺点：缺点：是分离效果略比凝交差一点。6.3毛细管胶束电泳：毛细管胶束电泳：毛细管胶束电泳，亦称为毛细管胶束电动力学毛细管电泳，它最大特点是在分离离子化合物的同时又对中性分子进行分离。(1)原理原理:毛细管胶束电

23、泳中，将离子型表面活性剂加入到缓冲液中，在它浓度达到足够大时,表面活性剂的单体就结合在一起，形成一个球体，称之为胶束。带有不同电荷的胶束带，在缓冲液中朝着不同的方向运动。在毛细管胶束电泳的系统中存在两相，即被分离物质在流动的水相和起固定作用的胶束相，在电场的作用下溶质在两相之间分配。溶质分子根据疏水性的大小，在胶束与溶液之间进行分离。形成电泳和层析同时存在的胶束电动分离机制。它与普通层析分离不同的，作为固定相的胶束是移动的，即在电场的作用下作定向泳动。阴离子胶束在电场中向阳极迁移，如：十二烷基磺酸钠（SDS）。阳离子胶束在电场中向阴极迁移。如：十二烷基三甲基季胺(DTAC)。(2)胶束分离过程

24、胶束分离过程：在胶束电泳中，组分是根据其疏水性的差异进行分离的，不同疏水性的粒子与胶束相互作用不同，疏水性强的作用力大，保留时间长，否则相反，如图4-26所示。分离过程如下：a不与胶束结合的组分，比胶束泳动速度快而最先出来。b与胶束结合的组分，与胶束泳动速度一样，最后出来。c具有一定疏水基团的中性粒子，在胶束和溶液之间进行分配，因此它界于上述二者之间出来。胶束电泳分离过程示意图(4)胶束的种类：胶束的种类：胶束毛细管电泳常用的表面活性剂主要分两类。阳离子表面活性剂阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂十烷基硫酸钠十二烷基硫酸钠(SDS)十四烷基硫酸钠(STS)种类名称阳离子表面活性剂十二烷基三甲基

25、季胺氯(DTAC)十二烷基三甲基季胺溴(DTAB)十六烷基三甲基季胺氯(CTAC)(5)胶束电泳的应用胶束电泳的应用a蛋蛋白白分分离离:用非离子型表面活性分离神经肽，分离条件：250mmol/L磷酸缓冲液，pH7.0,80mmol/L的辛基葡萄糖苷，电场强度E=250V/cm,电流I=33A，毛细管长度L=70cm，内径id=17m，检测波长=210nm。b氨基酸的分离:胶束电泳分离PTH氨基酸6.4毛细管等电聚焦电泳毛细管等电聚焦电泳(CIEF)(1)原理：原理：毛细管等电聚焦电泳是根据蛋白质的等电点差异进行分离的一种高分辨率技术，其分辨率可以达到0.005个pH单位。分离的基本原理是在毛细

26、管内填充含有两性电解质的凝胶溶液，聚胶后将毛细管的阴极放入碱性电极槽，阳极放入酸性电极槽，施加一定的电压自动形成pH梯度。被分离的蛋白质在电场的作用下，开始迁移直至到达一个不带电荷的稳定区，停止运动。具有不同等电点的蛋白质组分在pH梯度胶中泳动时，各自按照自身所带电荷相反的方向（等电点方向）迁移，最后停留在等电点的位置，形成一条电泳区带。各组分彼此被分开。蛋白质的运动方向。毛细管等电聚焦电泳分原理示意图(2)分离过程：分离过程：毛细管等电聚焦电泳的分离是根据组分的pI进行的。当被分离组分达到其pI位置时就会停止迁移，如何将已分离好的样品逐个转移出来是很重要的。具体步骤如下：进进样样：将样品以1

27、2的浓度与两性电解质混合，采用压差法将两性电解质和样品的混合物压入毛细管内。电电泳泳：接通电源(6-8KV)，在恒压下电泳，由于两性离子不断的递减，电流也随之不断下降，待电泳基本趋于零时即可。电电迁迁移移：被分离的物质各自停留在其等电点区域，这时将阴极槽中的NaOH用NaOH+HCl取代，再施加电压使Cl-进入毛细管内，然后进行电迁移，这时毛细管内的pH梯度就会下降，使已分离的蛋白质重新带上电荷，按pI值大小顺序逐个迁移出来。6.5毛细管等速电泳毛细管等速电泳(CITP)：(1)原理：原理：毛细管等速电泳是一种在被分离组分与电解质一起向前移动的同时进行聚焦分离的电泳方法。如同等电聚焦电泳一样，等速电泳的毛细管内电渗流为零，缓冲系统由前后两种不同淌度的电解质组成。在电泳分离时，首先向毛细管内引入高于被分离物质各组分电泳淌度的电解质(称为前导电解质，LeadingElectrolyte)，然后进样，随后再引入低于被分离物质各组分电泳淌度的电解质(称为尾随电解质，TerminatingElectrolyte)。在电场作用下各组分在前导电解质和尾随电解质之间进行聚焦分离。毛细管等速电泳分离原理示意图(2)毛细管等速电泳缓冲液的选择：毛细管等速电泳缓冲液的选择：前导电解质：5nmol磷酸尾随电解质：100nmol缬氨酸，用伯胺调节所需pH值。(3)等速电泳分离PTH氨基酸