分离纯化工艺演示教学.doc

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1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。分离纯化工艺-摘要本论文对从发酵液中分离纯化阿卡波糖的工艺进行了研究。通过对十余种树脂进行筛选，确定了除色素和除杂质效果较好的大孔吸附树脂DCZ和阳离子交换树脂工A4，以及起中和作用的阴离子交换树脂工BI。通过三种树脂柱的串连使用，实现了对阿卡波糖的有效分离和纯化。利用此分离纯化工艺得到了阿卡波糖纯品，纯度达到95.1%。此外，本论文还对三种树脂的操作条件进行了研究，并优化了分离纯化的流程。实验结果表明DCZ对去除发酵上清液红棕色色素效果较好，而阳离子交换树脂AI4对阿卡波糖发酵上清液中保留时间为7一S

2、lul及之前的杂质去除效果较好。通过二种树脂柱的串联使用后，认4的洗脱液己检测不到杂质峰。将认4的洗脱液利用阴离子交换树脂IBI进行中和，使溶液pH值中和至样品稳定的pH范围内。然后通过旋转蒸发浓缩和真空冷冻千燥，得到了白色针状结晶的纯品。再经过真空千燥后得到了白色粉末状阿卡波糖纯品。本论文还考察了三种树脂柱的吸附及洗脱条件并对其进行了优化，达到了最佳的吸附及洗脱效果.经过三种树脂柱的连续分离纯化后，得到的精制液总收率为韶%，整个分离纯化流程总收率为85%，千燥后得到白色粉末状纯品，其纯度为95.1%。本工艺与其它报道的工艺路线相比流程简单，成本低廉，适用于工业化生产。关键词:阿卡波糖;提取分

3、离;树脂;静态吸附;洗脱;纯化:千燥浓缩沈阳药科大学硕士学位论文ABSTRAC丁ABSTRACTIn而spaper，阮etchniqesofPesalatinoandp硕ficaitnoof那abroesformefmrelattionbrothwerestdied.Byexanumngmorethandecadekindsofresins，3k访dsofresinsweredeterm山ed，incldingmacro.reticularabsorpt1onresionDC2andcationexchangerIA4whiChwereg。datrelnovingpigmentandlmp面t

4、yfromsulx泊utantnuldasweUas画onexcbangerIBI贾hichwas侧哭dintheneutrali刀滋ionof翻diceluateof1A4.Byusingtheclu引erofthe公万eekindsofresins，acalbosewass印公成ed助dPunfiede价ctlvel醉TbeacarboseProduCt。bta山edby如stechniquesofseParationandPunficationreacbedaPuntyof95.1%.Furthennore，theOPeratiOnconditionsofthe3kindsofresin

5、swerealsoinvest1gatedandtheprocesofseParationalldpud6cationwasalsooPt加亩zed.ExPerlmentserslsthsowedtlla丈hteor.ret1cluarabosrbentDC2SWaabelotemreovhteplg叮ente任比tlvely丘omferlnentatlonbro奴认七“已巧thestrongacidcationexChanger认4hadastrongabllltytosePaxatethe汕P吐ty认lhlchh翻areservationtimeat7.5田Inandbeforeitdet

6、ectedbyBPLCmethod.Byus吨the幻刃oklildsofresinsconiinuouS】y，lmPurityintheeluate。f1A4wasDofdetected.TbeclateofLA4Wasneutra】泳d妙the画皿exc玩mgerml，sothepHofthee】州atewaskePtinaaPProPriatevalueinw场chacarbose翻ststeadlly.1七enthep侧fiedli呵dwasconcentratedbyrotaryev叮扣ratorandthewhiteaceratecrys园wasobtainedby曰卜叩玩11乙a

7、tio几Finally，thew肠tesolid加wderOfpuleac田七。sewasgotbyvaculn山叹ness.Moeorerv，hteco幻ditionsofabso印tinoandelitunofoacarboesbyeht3k山dsofers此wereaisoinve呱gatedandOpt妇正Zed，andanOPt如滋dresultswasaChieved.A丑erco川Inuing邵palatlonbytheth代ek山dsofresir，the10talrecoveryra龙eofacarbose证thep心fiedli脚dwas8%，andaw址tesolidPO

8、wderofacalbose，withaP而tyof951%，wasobtained.Compalediwthohtercet俪quesreoprtedbyilteratuel，面sCet画qeusaswemorisuabtelfor1Ddustdalproduction玩causeofitssimPleinpro“sandfowcost，Keyw0rds:acarbose;extractionandseParat1on;resin;引泊tloabsorb;eluted;p心ficati眠伪幻centratinoandcaleafciton沈阳药科大学硕士学位论文第一章前言第一章前言Q一葡萄糖

9、昔酶抑制剂是一类具有寡糖结构的抗n型糖尿病药物，它通过抑制小肠上皮绒毛膜刷状沿上的多种酶来降低餐后血糖。目前用于临床的a一葡糖昔酶抑制剂有三种:阿卡波糖(拜糖平Acaxbose)、米格列醇(Miglito)、伏格列波糖(倍欣voglibose).其中，阿卡波糖和米格列醇均由拜尔公司分别利用微生物发酵法和化学合成一生物转化一化学合成的方法研制开发的1。伏格列波是由日本武田药品公司利用全合成方法研制开发的.1.阿卡波糖概述1.1化学结构及理化性质阿卡波糖外观为白色粉末易溶于水，比旋度为167，pKa值为.51，分子式为C25H43N0，卜分子量为6456，化学名为0一4，6一双去氧礴(15，4民5

10、5，65)礴，5，6一三经基一3-轻甲基召一环已烯基一1一氨基。一毗喃葡萄糖基卜(1叶4)一0一。一毗喃葡萄糖基一(l，4)一毗喃葡萄糖l.分子结构式如图1一1所示.山们六一0刊台匀右翻七.吕.御.尹。由血.卿1.)1图1一1阿卡波糖分子结构式阿卡波糖是一种复合的低聚糖(伪四糖)，包括acarvloes和麦芽糖两部分，其中份se由具不饱和C7户环多醇的valleDan”ne和今氨基一，6一双脱氧葡萄糖通过类似于N一糖昔键的氨基桥连接在一起而组成，这个ac田，10se部分对葡萄糖昔酶的抑制效应起主要作用121。1.2临床药理作用已知人类食物中绝大部分的碳水化合物为复合糖，包括分子量较低的低聚糖(

11、寡糖)以及分子量较大的多糖，这些复合糖必须先经过唾液及胰液。一淀粉酶的作用分解为麦芽3沈阳药科大学硕士学位论文-一一一一一一一一一二堑生旦糖(由二分子葡萄糖组成)、麦芽三糖(含三分子葡萄糖)及糊精(寡糖)，继而在肠上皮细胞刷缘处的。一糖昔酶的作用下分解为单糖后才能被吸收。阿卡波糖的主要作用机制是其acarViosine中含有氮，可与a-糖昔酶上结合碳水化合物位点紧密相连(如蔗糖酶一蔗糖)，因此它可竞争性抑制葡萄糖贰水解酶，降低多糖及蔗糖分解成葡萄糖，使糖的吸收相应减缓，因此可具有降低饭后血糖的作用3l。阿卡波糖仅局部作用于消化道，全身的生物利用度极低，一项有6名健康受试者参加的研究显示，阿卡波

12、糖经吸收后仅有2%甚至更少的量转化为活性体。因此对机体的毒副作用很小。阿卡波糖仅在消化道中进行代谢，主要被肠道细菌分解，部分被消化酶分解，代谢产物的一部分被吸收后从尿中排泄。以原形吸收的阿卡波糖完全由肾脏排泄。阿卡波糖通过降低对单糖的吸收，抑制胰岛素分泌，改善胰岛素敏感性，使胰岛素抵抗降低，从而减轻“葡萄糖毒性”，使血糖控制在良好状态14.2.阿卡波糖生物合成途径及相关酶2.1生物合成途径2.1.IC7一环多醇，称之为valienol(orvalienatlune)的合成阿卡波糖的环多醇部分通过戊糖磷酸途径由景天庚酮糖一7一磷酸衍生而来问。阿卡波糖的合成开始于环化酶AcbC催化的景天庚酮糖一7

13、一磷酸到2一1一5一ePi一aliolone的环化作用.然后，再由AcbM蛋白，即2-epi.5-epi.valiolone7一激酶，催化2一1-5一1.valiofone形成2一1一5褚pi一valiolone7一磷酸;由Acbo蛋白催化转化为5一ePi.valiolone7一磷酸;随之由人比L蛋白催化转化为5一1.valiolof7一磷酸;紧接着，由AcbN蛋白催化转化为1邵1.vali01of7-磷酸:再由AcbJ蛋白催化生成1，7-二磷酸一1一1.vallolol;最后经ACbR蛋白催化形成NDP一1.ep，一aliolol7一磷酸，即valienanune。其合成途径如图1一所示6切

14、。沈阳药科大学硕士学位论文第一章前言，护图1一v葫即翻ein的生物合成途径2.1.24一氨基一，6一双脱氧一葡萄糖部分的合成D一葡萄糖一1一磷酸由A比A蛋白催化转化为dTDP一D一葡萄搪;然后再由AcbB蛋白催化而进行分子内氢化物转移形成dTDP4一酮基一6-脱氧一D-葡萄糖;最后酮基一糖随之由a比V基因编码的转氨酶AcbV蛋白催化生成dTDP一4一氨基人6一双脱氧一D-葡萄糖。其合成途径如图1一3所示习.八心七八自种-一-今翻加伪口心口兀甲图1一4-氨基戒6-双脱氧葡萄糖的生物合成途径2.1.3AcaJ，iose核心部分的合成沈阳药科大学硕士学位论文第一章前言经Acbsl蛋白的催化作用，ND

15、P一1一即1一aliolof7一磷酸和dTDP一氨基一6一双脱氧一葡萄糖最终合成dTDP一即arviose-7一磷酸。其合成途径如图1碑所示16。0，公-图1礴Aca丁viose的生物合成途径2.1.4阿卡波糖的合成dTDP一。势7一磷酸与麦芽糖经AcbQ瓦Js蛋白的催化作用最终形成阿卡波糖。其合成途径如图1一5所示间。在存在卜14C麦芽糖的ActinoplaensPs.发酵实验表明，阿卡波糖的麦芽糖基单位直接由麦芽糖衍生而来18.ac田，iose和麦芽糖之间通过由毗D基因编码的acarvlosvl转移酶(AcbD)的二。州转移作用而连接。一些磷酸化步骤需要由a比K、acbM和acbo基因分别

16、编码的AcbK、ACbM和ACbo蛋白来催化完成。这些步骤被认为是类似于耐受的自我保护机制19。dTI，F。r，如仲，血。p七二M.It.1啥05.“h皿ride.图1一5阿卡波搪的生物合成途径3阿卡波糖分离工艺国内外研究现状近几年来国内外对阿卡波糖提取工艺的研究报道日益增多，九十年代国外一般用树沈阳药科大学硕士学位论文第一章前言脂进行分离提取10。利用阿卡波糖结构中含有一个N所表现出弱碱性的特点，可利用离子交换树脂进行分离纯化，国外一篇最新的关于阿卡波糖提取工艺的报道中川利用阿卡波糖在乙醇中沉淀的特点，采用醇沉法进行初步分离后，再用强酸性阳离子交换树脂和亲和色谱法进行纯化精制，最后得到的白色

17、粉末状阿卡波糖纯度达98%。而近几年国内的研究技术也己形成规模，采用了另一种新技术膜过滤系统来进行分离提取，几篇专利文章中都涉及了此项技术112。其中以三达膜科技有限公司为例13，该公司将阿卡波糖的发酵液直接用一级膜分离系统，去除菌丝体、可溶性蛋白、培养基及部分色素，得到澄清的阿卡波糖滤液，再用二级膜分离系统进一步浓缩，并脱盐脱色，去除部分单糖、大量的无机盐等小分子杂质.然后再利用层析树脂来纯化阿卡波糖，此项技术虽然方便简单，但成本大，不适于工业生产。另外浙江海正药业股份有限公司先采用传统的离子交换树脂分离纯化阿卡波糖Ilj，之后再用膜过滤器除去无机盐、低分子的有机杂质，来得到高纯度的阿卡波糖

18、.4.本论文研究内容1、利用静态吸附法初步筛选树脂选用不同型号的大孔吸附树脂和离子交换树脂，将发酵上清液调成不同州值后用静态吸附法初步筛选去除色素较好的树脂，并通过HlLc检测吸附后溶液中物质组成，与发酵上清液的HPLc图谱对比，来寻找除杂质效果较好的树脂。2、利用动态的吸附及解吸考察初筛树脂将初筛的树脂装柱后，将发酵上清液以一定流速通过该柱，吸附平衡后，用不同的洗脱剂进行洗脱，HPLc检测流出液和洗脱液的物质组成，通过吸附前后图谱对比来考察解吸情况，进而确定洗脱条件。3、将所确定的树脂进行深入研究考察样品溶液在该树脂的最佳吸附pH值、上样流速，洗脱条件及影响洗脱效果的几点因素。4、最后纯化溶

19、液的浓缩和千燥将纯化的溶液进行浓缩和干燥，考察浓缩和千燥的温度和时间，确定最佳的浓缩和千燥条件，最后得到千燥粉末，HPLc检测其纯度。沈阳药科大学硕士学位论文第一章前言第二章Hp比检测阿卡波糖含量方法的确立及理化性质的考察1实验材料1，1实验原料发酵液:采用本实验室03一1号放线菌培养得到阿卡波糖发酵液阿卡波糖标准品:由我校生物制药教研室提供1.2实验试剂乙腊(色谱纯)山东禹王实业有限公司磷酸氢二钾天津市博迪化工有限公司磷酸二氢钾天津市博迪化工有限公司纯净水杭州娃哈哈百立食品有限公司微孔滤膜(0.45四有机膜和水膜)天津市鑫洲科技有限公司无水乙醇(分析纯)天津市百世化工有限公司丙酮(分析纯)天

20、津市博迪化工有限公司乙睛(分析纯)山东禹王实业有限公司盐酸沈阳市东兴试剂厂氢氧化钠天津市博迪化工有限公司1.3实验仪器高效液相色谱仪:C.RGACHROMAI心PAC日本岛津公司SPD一10A丫1产琴VISDETECTORLC一10戌n用Ph企色谱柱Sgar一D，aters46x250nu日本NacalaiTesqeIncA卜330柱温箱天津奥特赛恩斯仪器有限公司BSll0S分析天平MadebysartoriSyB电子天平上海海康电子仪器厂址一092磁力搅拌器上海浦江分析仪器厂KQ20E超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司RE一25A旋转蒸发仪巩义市英峪予华仪器厂沈阳药科大学硕士学位论文第二章H

21、PLc检测阿卡波糖含量方法的确立及理化性质的考察SHZ一D(1)循环水式真空泵电热恒温水浴锅241袱分光旋光仪台式离心机5一5型pH计HIMACCRZIG冷冻离心机巩义英峪予华仪器厂江苏红旗医疗器械厂日本Perkln一Elmer公司上海安亭科技仪器厂上海雷磁仪器厂日本日立公司2实验方法2.IHPLC检测阿卡波糖含量方法的确立2.1.1发酵上清液的获得培养:将.03一1号放线菌接入优化好的培养基中，28摇床培养3天，得到深红棕色粘稠状发酵液。离心:将发酵液在12，。00r/而n下低温离心01分钟得发酵上清液.2.1.2液相检测条件的确定文献报道1n阿卡波糖在uv12o川叮处有吸收，并参考中国药典

22、1网阿卡波糖检测条件流动相配比，经过多次实验摸索初步确定的色谱条件如下:色谱柱:氨基柱sgar-D，sh笼4.6x250口1流动相:乙睛:PBS=70:30检测波长:210创m流速:认81创六nin进样量:20川2.1.3阿卡波糖标准品的线性考察由于需要采用外标法或标准曲线法对阿卡波糖发酵液及其在树脂柱的洗脱液进行含量计算，所以要考察阿卡波糖标准品的线性以便为准确计算含量提供可靠科学依据。标准品配制:用分析天平精确称取一定量的阿卡波糖标准品，用重蒸水配成浓度分别为100。留创、200。创山1、300。留面、4oopg/1111、soopg/ml、60opg八Dl、700。留血、500，留加1的

23、溶液。将不同浓度的标准品用0.朽帅的水膜过滤后可进行HPLC检测。用上述液相检测条件对不同浓度的标准品进行检测，将浓度对峰面积作标准曲线。2.1.4HPLc检测时稀释倍数考察取发酵上清液1血用流动相分别稀释成4倍、5倍、6倍、7倍、8倍后，于400/rmin转速下离心10分钟后，取样品上清液用0.45呻的酷膜过滤后即可进行HPLc检测，用沈阳药科大学硕士学位论文50。，留ml的标准品做对照效价计算。22阿卡波糖理化性质的考察第二章HPLC检测阿卡波糖含量方法的确立及理化性质的考察在提取过程中为保证生物效价不降低，对它的标准品和发酵上清液的一些理化性质如溶解性、稳定性及旋光性等进行了考察，为分离

24、纯化提供参考依据。22.1阿卡波糖标准品2.211外观:阿卡波糖标准品为白色粉末2.2.12溶解度:极易溶于水，微溶于95%乙醇，不溶于丙酮、无水乙醇、乙睛。对其在水中的溶解度进行了考察。2.2.1.3稳定性考察2.2.1.3.1冰箱4冷藏取浓度为5。伽创创阿卡波糖标准品(蒸馏水配制)置于冰箱4冷藏室，一个月取一次样品，将样品用0.45帅的水膜过滤后进行液相检测，考察效价变化。2.2.1.3.2稳定PH值范围用.02%盐酸及.02%氢氧化钠将蒸馏水pH值分别调成为1.5、3、.45、6、6名、8.5、9.5、10.5、15的水溶液，用该水溶液分别配制浓度为60即9/Iil阿卡波糖标品。对照品是

25、用未调pH蒸馏水配制。配制完在室温27放置二小时后取样，将样品用0.45帅的水膜过滤后即可进行液相检测，考察效价变化。2.2.1.3.3热稳定性分别取15血浓度为80o9/Iln阿卡波糖标准品用稀盐酸或稀碱调成声分别为1.5、4、9、10的溶液。用旋转蒸发仪温度控制在47科9之间旋转蒸发加分钟浓缩成体积都为8一snil，将样品用0.45pm的水膜过滤后进行护LC效价检测。2.21.4旋光性用.02%盐酸及.02%氢氧化钠将蒸馏水调州值分别为1.5、3、.45、6、.68、.85、.95、10.5、1.5的水溶液，用该水溶液配成浓度为3%的阿卡波糖标准品，用未调PH值的蒸馏水配制对照品。配完后在

26、室温27放置半小时，取样进行旋光测定。22.2阿卡波糖发酵上清液由于在提取过程中需要调节发酵上清液的pH值便于树脂吸附，所以要考察发酵上清液的PH值稳定性。同时在提取后期需要用旋转蒸发仪浓缩洗脱液，这样要考察发酵上清液的热稳定性。并且在保藏方面要考察冰箱冷冻保藏发酵液的稳定性.所以针对上述这三点对其稳定性进行考察。2.2.2.1热稳定性沈阳药科大学硕士学位论文_三1翌巴鱼塑全些生些巡塑鲤通翌丝塑塑逸取发酵上清液各llm置于离心管中，放于水浴温度分别为03、40、50水浴锅中保温1小时，取出后按照2.1的方法进行液相检测。然后取3份发酵上清液各lml置于离心管中，在水浴47下分别放置加分钟、30

27、分钟、40分钟，取出后同样按照2.1的方法进行液相检测。2.2.2.2保藏稳定性将发酵上清液置于冰箱冷冻层(-02)冷藏，于1个月、2个月、3个月、4个月后取样。取样品后按照2.1的方法进行液相检测。2.2.2.3稳定pH值范围用.02%盐酸、.02%氢氧化钠将发酵上清液HP调成4、5、6、8、9、01后放置二小时，然后取样品按照2.1的方法进行HPLC检测，考察效价变化。3实验结果3.1.标准曲线考察表2一1阿卡波糖标准品HPCL检测结果标准品(pg如】)峰面积200154月42627y=243835x一54379RZ=099892500000200000015000001000000500

28、0000100200300400500600700800浓度(ug/.1)图.21阿卡波糖标准品标准曲线考察从图2一1中数据可知标准品的线性回归方程R开平方根为.0994，达到了外标法所需要求。所以确定阿卡波糖标准品在浓度100昭加1一800此/ml之间线性良好，可以用外标沈阳药科大学硕士学位论文法来计算发酵上清液的效价。3.ZHPLc检测时稀释倍数考察表2-2第二章即LC检测阿卡波糖含量方法的确立及理化性质的考察阿卡波糖发酵上清液稀释倍数的考察稀释倍数保留时间(min)标品4567811.08711.241117111.22711.24311222峰面积1167813163018213109

29、191098688955914770198效价(pglml)变化百分率(%)5002791.92806.4282428649263810.50一581.5_55注:变化百分率的计算是用两个相邻数据之差除以两者中较小数据进行计算从表2一2中的变化百分率可以看出发酵上清液稀释倍数在4、5、6时效价变化不大，而稀释倍数为7、8时，效价波动的幅度较大，所以确定发酵上清液稀释倍数在4、5、6时计算效价比较准确，从节省试剂的角度出发采用稀释倍数为4来进行效价检测。3.3阿卡波糖理化性质考察3，3.1标准品理化性质3.3.1.1溶解度在.05血的水溶液中分次加入一定量的阿卡波糖，观察其溶解状态。表-23溶解

30、度的考察名称加入量回现象第一次第二次0.04逐渐溶解第三次0一2116第四次0一3568慢慢溶解缓慢溶解但溶液已很粘稠从现象看，第四次加入量己接近阿卡波糖的饱和度了，因为阿卡波糖是糖类似物，所以极易溶解于水中，从上面的数据可以看出当浓度为。.714g/inl时已接近其饱和度。3.3.1.2冰箱4冷藏表2礴冷藏稳定性考察名称新鲜发酵液时隔一个月时隔二个月时隔三个月标50峰面积1202444120548311939161191175从表2碑中可看出标准品放置三个月效价几乎无变化，可知标准品在水溶液中是比较稳定的。3.3.1.3稳定pH值范围沈阳药科大学硕士学位论文第二章HPIC检测阿卡波搪含量方法

31、的确立及理化性质的考察表2一5不同PH值水溶液中效价检测调不同pH样品保留时间(min)606458659160762063065262D对照品9.7431.597683973669.73568，.2728.597579.59一73210597331159夕3峰面积135953214705501318606134857613690721416168143823214892081415899效价(pg/ml)注:对照品以未调州值的水洛液(5)5配制侧”p倒角1从表2一5可以看出pH值的变化对效价有一定的影响。当样品pH值在5.5至6.8之间，效价最接近对照品。确定标准品PH值稳定范围在5.5一6

32、.8。33.1.4热稳定性表2一不同HP值水溶液中热稳定性考察结果样品浓度(“留山1)体积(m)1含量(.9)降低百分比(%)备注对照品一1512对照品二样品调PHg样品调PHI.5样品调PH4样品调PH1011.4911854259.9513411968510名15.92未浓缩未调州的sop目由1标准品浓缩未调PH的s0p创由之标准品浓缩4720min浓缩47加mln浓缩4720min浓缩47加min、目、曰jll口口ROnOOR80脱洲170溯1272注:样品为8加p创血的标准品，对照品二47浓缩2。旧in.由表么6数据分析，以未浓缩未调pH值的80伽留如1的标准品做对照，当标准品在47旋

33、转蒸发浓缩20分钟后，效价降低4.25%.再以对照品二做参照，pH值为1.5和PH值为10时旋转蒸发效价下降得较大，分别降低13.4%、5.92%。而pH值为4和9时旋转蒸发效价与对照品二相比无变化.说明阿卡波糖标准品在酸性PH(4、碱性州)9时，47旋转蒸发时不稳定，易分解而导致效价降低，其中酸性条件下比碱性条件下降低得要明显。3.3.1.5旋光性沈阳药科大学硕士学位论文第二章HPLc检测阿卡波糖含量方法的确立及理化性质的考察180.0175.01650160.01.53.05.566.88.59.510511.5pH值图2一2不同HP值标准品与比旋度关系以pH值为.55的水溶液中测得的比旋

34、度作对照，从图2一2中可以看出标准品在HP值为1.5时旋光度比其它PH值的都要大，而其它州值溶液中旋光度基本都一致.3.3.2阿卡波糖发酵上清液理化性质3.3.2.1热稳定性表2一5热稳定性考察结果条件效价小留mD降低百分率(，司对照品(室温)1099水浴4010990水浴60906176水浴l()0798274-一一-.-注:对照品是未进行水浴加热的发醉上清液从表2一8中看出阿卡波糖发酵上清液在水浴40时加热一小时效价基本不变，而水浴温度为60和10加热一小时效价降低较多，降低程度分别为17.6%和27.4%，可以看出温度越高效价降低越多。将温度控制为47，水浴加热时间为02、03、04分钟

35、的效价检测结果表2一47水浴热稳定性考察样品pH值效价(pg/ml)备注降低百分率(%)对照品样品一样品二样品三2307225122272101未进行水浴加热的发酵上清液47水浴20分钟47水浴30分钟47水浴40分钟2.433一48893内J几，1月，内，.71了77注:标准品月阅p倒而从表2一9可以看出阿卡波糖发酵上清液在水浴47加热20分钟、30分钟时效价降低百分率都很小，只有水浴40分钟时降低得多一些。说明在水浴47加热30分钟，阿卡波糖活性物质损失很少。沈阳药科大学硕士学位论文3.32.2保藏稳定性第二章妇1，LC检测阿卡波糖含量方法的确立及理化性质的考察表2一10阿卡波糖发酵上清液

36、保藏稳定性考察组分保存方式效价(”留ml)降低百分率(%)发酵上清液发酵上清液发酵上清液发酵上清液发酵上清液保存时间新鲜发酵4个月冷冻层冷冻层冷冻层冷冻层3372286423561852119230245一1647月月月个个个，几，门注:标准品为引扣p留由1，对照品为新鲜发醉上清液从表2一01数据可知阿卡波糖发酵上清液印H.73)在一0保藏1个月时效价就开始降低，随着时间加长，效价降低得更多，冷冻层一0保藏3个月时效价基本降低一半。33.23稳定pH值范围表2一1调发酵上清液不同州值效价考察样品pH值效价和留ml)变化百分率(%)幼7.34565910标准品原液未调州原液调班原液调声原液调声原

37、液调PH原液调声原液调pH4002159196220252074对照品一9.12石.21一，94110010.503一06分析表2一n数据，以发酵液自然发酵的班值.73HPLc检测的效价作对照，阿卡波糖发酵上清液在pH值偏酸时效价偏低，偏碱时效价偏高，所以阿卡波搪发酵上清液存在一个效价稳定的pH值，即在6一之间。4讨论1.调发酵上清液不同pH值进行效价检测，发现在HP值偏酸时效价偏低，偏碱时效价偏高。这一规律与标准品调不同pH值效价考察结果相一致。分析由于阿卡波糖pKa值为51，在溶液中成离子或分子形式受pH值影响很大，当溶液环境为酸性低于其pKa时，溶液中阿卡波搪大部分以离子形式存在，在HP

38、Lc检测时含量变少导致效价偏低，当溶液环境为碱性高于pKa时，溶液中阿卡波糖大部分以分子形式存在，HPLc检测时含量变多导致效价偏高。沈阳药科大学硕士学位论文第二章HPLC检测阿卡波糖含量方法的确立及理化性质的考察5小结1.首先确定了阿卡波糖标准品浓度在01伽省ml一8。，乡切1之间线性良好，可以用外标法来计算发酵上清液的效价。其次，确定了HPLc检测阿卡波糖发酵上清液时的稀释倍数为4倍。2.考察了阿卡波糖标准品的理化性质，首先是溶解度，在水溶液中溶解度达到714m留lul时溶液已很粘稠欲接近饱和但仍未饱和.其次是稳定性，第一点是保藏稳定性考察，确定了阿卡波糖标准品在4冰箱里保存至四个月时，效

39、价几乎不变。第二点是稳定PH值范围，标准品在四值5一5一8的水溶液中比较稳定。第三点是热稳定性考察，阿卡波糖标准品在酸性训(4、碱性叫)9时47旋转蒸发不稳定，易分解而导致效价降低，其中酸性条件下比碱性条件下降低得要明显。第四点是旋光性考察，标准品在PH值为15时旋光度比其它声值时都要大，其它pH值的标准品溶液旋光度基本都一致。3.考察了阿卡波糖发酵上清液的理化性质，阿卡波糖发酵上清液在04时加热一小时活性基本无变化，同时确定在水浴4740分钟内阿卡波糖活性物质基本不会损失。保藏稳定性考察确定在一。保藏至3个月时效价基本降低一半。确定了效价稳定的声值范围在6一7之间。沈阳药科大学硕士学位论文第

40、三章利用静态及动态吸附法筛选树脂第三章利用静态及动态吸附法筛选树脂本实验要分离纯化的阿卡波糖是一种弱碱性、极性大且易溶于水的物质。同时考虑到其工艺应用于工业生产，故选用大孔吸附树脂及离子交换树脂这二种成本低、环境污染小的树脂来进行分离提取，由于菌种发酵产生的次级代谢产物成份非常复杂，除阿卡波搪外还含有很多物质，例如菌体代谢产生的色素、糖类似物、蛋白及无机盐等，所以阿卡波糖发酵液是多种化合物的混合物，并且发酵液颜色呈红棕色。本实验将针对这些杂质进行分离提取，首先从去除色素出发，采用静态吸附法11刀利用大孔吸附树脂和离子交换树脂分别吸附发酵上清液后，观察吸附后溶液像色的变化，初步筛选出一种去除色素

41、效果较好阴的树脂，并且通过HPLc检测来筛选吸附阿卡波糖最多或吸附杂质最多的树脂，然后用初步筛选出的几种树脂进行动态实验考察解吸情况及洗脱剂类型。第一节静态吸附法初步筛选树脂1实验材料1.1实验试剂大孔吸附树脂DCI、DCZ、DC3、DC4离子交换树脂认1、认2、】A3、认4、认5、认6盐酸氢氧化钠无水乙醇(分析纯)1.2实验仪器SHZ一D(1)循环水式真空泵HD吐ACCRZIG冷冻离心机KYllo摇床2实验方法由于溶液pH值影响溶液中阿卡波糖的解离程度，上海树脂厂丹东树脂厂沈阳市东兴试剂厂天津市博迪化工有限公司天津市百世化工有限公司巩义英峪予华仪器厂日本日立公司上海福玛实验设备有限公司以需要

42、将发酵上清液调成不同pH值来进行吸附考察l7随之也会影响树脂的吸附能力，所。据文献报道19发现阿卡波糖在酸沈阳药科大学硕士学位论文_一一垦空七丝哩鱼些喳型些竺燮丝性条件下易质子化形成盐类可与离子交换树脂进行交换吸附，而碱性条件下易烯醇化可通过氢键吸附于大孔吸附树脂上。故将发酵上清液调成pH为5、6、7、8四个不同pH值进行大孔吸附树脂的静态考察，将发酵上清液调成2.5、4、5.5和7四个不同pH值进行离子交换树脂的静态考察。2.1静态吸附树脂用量的考察2.1.1大孔吸附树脂2.11.1树脂预处理称取DCI、DCZ、DC3及D4c四种大孔吸附类型树脂，用无水乙醇浸泡24小时使其充分溶涨。在烧杯中

43、反复多次洗涤后，再用蒸馏水洗至无醇味。然后将四种树脂利用抽滤泵抽干其中的水份，干燥后将每种型号树脂各称取4份，分别装入50耐的三角瓶中。2112样品预处理取发酵液上清液4份，每份04血用02%HCI或。.1%Na0H分别调成HP为5、6、7、8静置半小时，用低温冷冻离心机在12，oor/:吐in下离心10分钟，取上清液作为静态吸附的样品。2.1.1.3静态吸附在装有Dcl、DCZ、oC3、D4C树脂的soml三角瓶中分别加入Hp值为5、6、7、8的上清液各10nil。将它们固定于摇床上室温摇置15个小时后，取下观察溶液颜色变化，并用HPLC检测溶液中阿卡波糖的含量，用下面公式计算吸附量和吸附率

44、。咖始浓度一吸附后浓度)x溶液体积吸附量(mg/g)=一树脂重量由始浓度一吸附后浓度)吸附率%)，一X100%初始浓度2.1.1，4HPLC检测:按照第二章所确定的2.1方法进行检测。2.1.2离子交换树脂21.2.1树脂预处理本次实验所用的离子交换树脂均为阳离子交换树脂，称取认1、IAZ、1八3、LA4、LAS、认6各59用蒸馏水浸泡24小时后用蒸馏水反复洗涤，然后用4%盐酸30Inl在小烧杯中反复洗涤转成氢型，转型后再用蒸馏水洗至中性即可。然后将6种树脂利用抽滤泵抽干其中沈阳药科大学硕士学位论文.-一一一一一兰壁匕塑迪型丝型塑的水份，干燥后将每种型号树脂各称取4份，分别装入soml的三角瓶

45、中。21.2.2样品预处理取发酵液上清液4份，每份04而用.02%的稀盐酸分别调成pH为.25、4、5.5、7后静置半小时，用低温冷冻离心机在12，O0r2inln下离心10分钟，取上清液作为静态吸附的样品.2.1.2.3静态吸附在装有认1、IAZ、认3、认4、IAS、认6树脂的50nil三角瓶中分别加入pH值为.25、4、5.5、7的上清液各10ml。将它们固定于摇床上室温摇置15个小时后，取下观察溶液颜色变化，并用HPLc检测溶液中阿卡波糖的含量，用下面公式计算吸附量和吸附率。(初始浓度一吸附后浓度)x溶液体积吸附量(mg/g)=一树脂重量(初始浓度一吸附后浓度)吸附率(%户一x1OO%初始浓度2.1.2.4HPLc检测:按照第二章所确定的2.1方法进行检测。22静态吸附上清液量的考察2.21大孔吸附树脂将每份的树脂用量为1一69，发酵上清液的用量为2siln。方法同.