琼脂糖凝胶电泳注意事项及操作流程1546.pdf

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1、琼脂糖凝胶电泳注意事项及操作流程 凝胶电泳操作注意事项：1.缓冲系统：在没有离子存在时;电导率最小;DNA 不迁移;或迁移极慢;在高离子强度的缓冲液中;电导很高并产热;可能导致 DNA 变性;因此应注意缓冲液的使用是否正确.长时间高压电泳时;常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的.2.琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖;其杂质含量不同;影响 DNA 的迁移及荧光背景的强度;应有选择地使用.3.凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致;溶解的凝胶应及时倒入板中;避免倒入前凝固结块.倒入板中的凝胶应避免出现气泡;影响电泳结果.4.样品加入量：一般情况下;0.5cm 宽的梳子可加 0

2、.5ug 的 DNA 量;加样量的多少依据加样孔的大小及 DNA 中片段的数量和大小而定;过多的量会造成加样孔超载;从而导致拖尾和弥散;对于较大的 DNA 此现象更明显.5.电泳系统的变化会影响 DNA 的迁移;加入 DNA 标准参照物进行判定是必要的.6.DNA 样品中盐浓度会影响 DNA 的迁移率;平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响.7.DNA 迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度;迁移分子的形状及大小.采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子;制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度.小片段的 DNA 电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率.琼脂糖加样时候注意事

3、项：1、用移液抢将样品加至点样孔.每孔点样的体积一般少于 25ul;因此吸取每一个样品时;操作要稳当且细心.2、常加一定量的蔗糖来增加样品的浓度;以使每个样品停留在各自的点样孔中.3、在样品中加入水溶性的阴离子追踪染料如溴酚蓝;用以看出样品移动的距离.4、在一个或几个孔中加入标准分子质量样品;电泳结束后;根据已知分子质量的带的相应位置可用来做出标准曲线.5、电泳一般是在追踪染料泳动到胶的 80%部位时停止.注意电泳期间;电泳槽盖要安全盖好;以防止液体蒸发;又可以降低电击的可能性.6、电泳结束后;将胶浸没在 1mg/L 的溴化乙锭 EB 中;5min 后即可看到 DNA带;EB 通过插入在双螺旋

4、的配对核苷酸之间同 NDA 结合.另一种方法是电泳时;在胶中加入 EB.7、在紫外灯下;由于 EB 发出强烈的橘红色的荧光;所以可以看到 DNA 带.利用这种方法检测的界限是每条带约 10ng DNA.带上塑料安全眼镜可防止紫外光对眼睛的伤害.可用尺子来测量每条带至点样孔的距离.同样;利用特制的照相机和调焦器;也可以对凝胶拍照.8、如果要对某一条带如质粒进一步分析;可用小刀将含该带的凝胶切割下来;从带中回收 DNA.琼脂糖核酸电泳实验操作流程 1.用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净;放在制胶平板上;封闭模具边缘;架好梳子；2.根据欲分离 DNA 片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确

5、称量琼脂糖干粉;加入到配胶用的三角烧瓶内;定量加入电泳缓冲液一般 2030 ml；3.放入到微波炉内加热熔化.冷却片刻;加入一滴荧光染料;轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液;倒入电泳槽中;待其凝固；4.室温下 3045 分钟后凝胶完全凝结;小心拔出梳子;将凝胶安放在电泳槽内；5.向电泳槽中倒入电泳缓冲液;其量以没过胶面 1mm 为宜;如样品孔内有气泡;应设法除去；6.在 DNA 样品中加入 10体积的载样缓冲液 loading buffer;混匀后;用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；7.接通电源;红色为正极;黑色为负极;切记 DNA 样品由负极往正极泳动 靠近加样孔的一端为负.一般 60100V 电压;电泳 2040min 即可；8.根据指示剂泳动的位置;判断是否终止电泳；9.电泳完毕;关上电源;在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置;并与核酸分子量标准 Marker 比较被扩增产物的大小.琼脂糖凝胶浓度与线形 DNA 的最佳分辨范围 琼脂糖凝胶浓度线形 DNA 的最佳分辨范围 bp 0.5%1;00030;000 0.7%80012;000 1.0%50010;000 1.2%4007;000 1.5%2003;000 2.0%502;000