枸杞甜菜碱含量测定方法的比较研究报告37443.pdf

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1、 .-可修编.（中文标题：黑体，二号）枸杞甜菜碱含量测定方法的比较研究 parative study on methods for determination of betaine from Lycium barbarum L.（英文标题：Times New Roman，20）院 系：生命科学学院 专 业：生物技术 年 级：2003 级 学 号：姓 名：马佳卉 指导教师：X 自萍（黑体，三号）2 枸杞甜菜碱含量测定方法的比较研究（标题：黑体二号）摘 要（黑体，小四）：本实验利用甲醇加热回流提取枸杞甜菜碱，提取物经活性炭脱色、雷氏盐沉淀、分光光度法测定不同产地枸杞甜菜碱含量；或直接利用 NH2柱

2、未经衍生高效液相色谱法测定枸杞甜菜碱含量。通过比较分光光度法和高效液相色谱法测定的枸杞甜菜碱含量，选择适宜的甜菜碱含量测定方法。由实验结果可知，NH2柱未经衍生高效液相色谱法快速、简便、重复性好，所测甜菜碱含量明显高于分光光度法。本研究表明 NH2柱未经衍生高效液相色谱法能快速准确地测定枸杞甜菜碱含量，可用于枸杞的质量控制.（仿宋，小四，1.5 倍行距）关键词：枸杞子；甜菜碱；分光光度法；高效液相色谱法 parative study on methods for determination of betaine from Lycium barbarum L.（Times New Roman，1

3、8，加粗）Abstract（Times New Roman，14，加粗）:To apply methanol-refluxed extraction method to extract betaine from Lycium barbarum L.,extraction was decolored by active carbon,precipitated with Remecke salt and the contents of betaine from different producing areas were determined by spectrophotometry;and th

4、e contents of betaine were directly determined by HPLC with NH2 stationary phase without derivatization of betaine.The suitable determination method was selected through paring the methods of spectrophotometry and HPLC in determining the 3 content of betaine from Lycium barbarum L.From the result we

5、 can see that HPLC is rapid,accurate,and the contents of betaine determined by HPLC were higher than spectrophotometry.This study showed that HPLC with NH2 stationary phase without derivatization of betaine can be applied to determine the content of betaine from Lycium barbarum L.rapidly and accurat

6、ely.（Times New Roman，12，1.5 倍行距）Keywords:Lycium barbarum L;betaine;spectrophotometry;HPLC 目 录（黑体，三号）前 言 4 1.材料与器材 5 1.1 原料 5 1.2 试剂 6 1.3 仪器与设备 6 2实验方法 6 2.1 分光光度法测定枸杞甜菜碱含量 6 2.1.1 实验原理 6 2.1.2 枸杞甜菜碱供试品溶液的制备 6 2.1.3 甜菜碱标准曲线的建立 6 2.1.4 供试品溶液的含量测定 7 2.2 高效液相色谱法测定枸杞甜菜碱含量 7 2.2.1 色谱分析条件 8 2.2.2 枸杞甜菜碱供试品

7、溶液的制备 8 4 2.2.3 对照品溶液的制备 8 2.2.4 甜菜碱标准曲线的制备 8 2.2.5 供试品溶液的含量测定 8 2.2.6 方法学考察 9 2.2.7 回收率实验 9 3.结果与分析 9 3.1 分光光度法与高效液相色谱法测定枸杞甜菜碱含量结果 9 3.2 高效液相色谱法测定枸杞甜菜碱含量的方法分析 10 4.讨论 10 参考文献 11 辞 13（宋体，小四，1.5 倍行距）前 言（黑体，四号）（宋体，小四，1.5 倍行距）XX 枸杞（Lycium barbarmL.）系茄科枸杞属盐生植物，具有很强的耐盐碱、耐瘠薄、抗旱、抗风沙等特性，集中种植在 XX、XX、内蒙等地区，是西

8、北生态建设的先锋树种1，也是西北干旱地区的重要经济作物。其果实，枸杞子是我国重要的药用植物资源和药食同源的名贵中药材，具有多种生理活性和保健功能。明朝李时珍在本草纲目中就有枸杞功效的记述2：“主五内邪气，热中消渴，补精气诸不足，易颜色，变白，明目安神，令人长寿”。现代药理学研究表明3，枸杞子具有增强免疫力、降血压、降血脂、防衰老、抗氧化、抗肿瘤等多方面的药理作用。5 近年来的研究发现，枸杞的主要化学成分有枸杞多糖(LBP)4,5、枸杞黄酮6、甜菜碱（betaine）7、类胡萝卜素及类胡萝卜素酯8、维生素C9、莨菪亭(scopoletin)10、多种氨基酸及微量元素 K、Na、Ca、Mg、Cu、

9、Fe、Mn、Zn、P 等成分11。此外，尚从枸杞中分离得到环肽(Cyclicpeptides)及枸杞素 AD12、脑甙脂类13等。其中，枸杞多糖为枸杞主要活性成分，具有增强免疫作用；甜菜碱、玉蜀黍黄素及玉蜀黍黄素二棕榈酸、脑甙脂类对四氯化碳引起的肝损害有保护作用；枸杞素 A 和 B 有抑制血管紧 X 肽转化酶的活性14。甜菜碱(Betaine)化学名称三甲基胺乙丙酯(C5H11NO2)，系甘氨酸的三甲基衍生物，是一种广泛分布于动植物组织中的季铵型水溶性生物碱，是人体惟一可替代叶酸或S-腺苷蛋氨酸作为甲基供体、参与蛋氨酸循环及卵磷脂合成的物质，是枸杞15、肉苁蓉16-17等多种传统中药的重要活性

10、成分。据文献报道18，甜菜碱具有促进脂肪代谢、抗脂肪肝、保护肾脏、降压、缓和应激、增进食欲、稳定维生素等多种药理作用。通过测定人体内组织或排泄物中的甜菜碱含量，有助于临床诊断人体的代谢异常。此外甜菜碱作为生物刺激剂，可促进家畜生长，增加产蛋量，作为两性表面活性剂、保湿剂、食品添加剂、防腐剂等，已广泛用于化工、食品等行业。近年来，甜菜碱对植物抗逆、抗旱盐性的作用逐渐受到关注，一些研究认为1920，甜菜碱的积累能提高细胞的渗透调节能力，在一定程度上提高细胞SOD、POD 等细胞保护酶的活性，抑制过氧化作用产物丙二醛(MAD)的积累，维持细胞膜的稳定性和完整性，而且甜菜碱可作为渗透调节物参与稳定生物

11、大分子物质的结构与功能。甜菜碱作为枸杞果、叶、柄中主要的生物碱之一，在体内起甲基供体作用，是枸杞中对脂质代谢或抗脂肪肝作用的主要活性物质21。因此，枸杞甜菜碱的提取分离、定量测定已受到广泛的关注。目前枸杞甜菜碱含量测定有分光光度法、薄层扫描法、非水滴定法和高效液相色谱法等。6 药典中枸杞甜菜碱的含量测定采用薄层扫描法22，此法多用甲醇、正丁醇提取样品，以不同比例的氯仿-甲醇-水或其他展开剂在硅胶薄层板上展开，用改良碘化铋钾试剂显色后进行扫描测定，且多采用双波长扫描法，能消除有机成分的干扰及操作误差,使测定的灵敏度和精确度显著提高。杨东辉等7用薄层扫描法测定了枸杞浸膏中甜菜碱的含量，结果表明该法

12、快速、灵敏、显色方便、选择性好，但层析过程常会出现拖尾现象，且展开时的温度、展开剂的极性和蒸汽饱和度都会影响色谱条件的恒定，从而影响分离效果和方法的重现性23。非水滴定法测定快速、简便、准确，但要求在实验过程中避免有水分存在24。分光光度法是目前常用的一种含量测定方法，该法快速、简便、灵敏，通过线性化X围试验、加样回收率测定、稳定性试验等都证明该法结果稳定，切实可行。包文芳25等用分光光度法测定了糖蜜中的甜菜碱含量；X桂花26等用此法在525nm处测定了枸杞半成品饮料中的甜菜碱含量，并应用活性炭脱色法进行了测定前处理，有效地去除了样品中的干扰成分，提高了测定结果的精确度。高效液相色谱法作为一种

13、现代分离分析技术，已逐渐应用于中药化学成分的分离分析和含量测定，在植物甜菜碱含量测定方面的应用也日益广泛2729，但由于甜菜碱结构中无共轭体系，仅能用折射仪检测或在低紫外吸收波长(190220nm)测定，条件要求较高，且灵敏度或选择性均不够理想。因此，一般采用的高效液相色谱法都是对甜菜碱提取物进行柱前衍生后测定的，此法破坏了甜菜碱提取物的原始成分30。Young等31报道采用NH2柱未经衍生可直接测定北方枸杞甜菜碱的含量，方法快速、简便。本文拟利用甲醇加热回流提取枸杞甜菜碱，通过比较分光光度法和NH2柱未经衍生高效液相色谱法测定不同产地枸杞子中甜菜碱含量，验证NH2柱未经衍生高效液相色谱法在枸

14、杞甜菜碱含量测定上的可行性，为快速简便地测定枸杞甜菜碱含量提供方法依据。1材料与器材（宋体，四号，一、二级标题加粗）7 1.1 原料 选择 XX 枸杞“宁杞号”2005 年夏季盛果期果实为材料，为尽可能减小田间管理水平对枸杞品质的影响，在采样时尽量选择枸杞树龄、植株密度、水肥条件、枝条修剪水平和成熟度一致的样品。测定前样品均在 50恒温条件下烘干至恒重。（宋体，小四，1.5 倍行距）1.2 试剂 乙腈为色谱纯；甲醇、丙酮、盐酸、雷氏盐均为分析纯；活性炭为化学纯；甜菜碱对照品购自 Sigma 公司。1.3 仪器与设备 CBM-20A 高效液相色谱仪（日本岛津公司）、SPD-20A 检测器、二元梯

15、度泵、XX 汉邦LichrospherNH2250mm4.6mm（5m）色谱柱、LC-Solution 色谱工作站、Milli-Q A10型纯水仪(MILLIPORE)，PB303-E 电子天平（METTLER-TOLEDO 仪器公司）、长源水浴控温仪（长源实验设备厂）、R201D-11 旋转蒸发仪（XX 亚荣生化仪器厂）、SHB-循环水式多用真空泵（XX 长城科工贸 XX）、T6 新世纪紫外可见分光光度计（普析通用仪器 XX）、回流装置、G4 垂熔漏斗、抽滤瓶、布氏漏斗、容量瓶。2实验方法 2.1 分光光度法测定枸杞甜菜碱含量 2.1.1 实验原理23,26 甜菜碱学名三甲基胺乙丙酯,水解后

16、与硫氰化铬铵(雷氏盐)生成紫红色沉淀：C6H11O 2NH+Cr(NH3)2(S)4C6H11O2NHCr(NH3)2(S)4 将甜菜碱与雷氏盐在酸性条件下反应制成雷氏盐沉淀，并用 70%丙酮溶解，呈粉红色。8 在 525nm 处以 70%丙酮作空白对照测定吸光度值，绘制标准曲线，然后利用该标准曲线测定被检物中甜菜碱含量。2.1.2 枸杞甜菜碱供试品溶液的制备 参考中华人民 XX 国药典中枸杞甜菜碱的提取方法22，具体操作过程如下：精确称取过 40 目筛的干燥枸杞粉末 2.000g，加 80甲醇 50ml（料液比 1：25），7075回流提取 1h，放冷滤过。用 80甲醇 30ml 分次洗涤残

17、渣和滤器，合并滤液和洗液，浓缩至 10ml。用盐酸调 pH 值至 1，加入活性炭 1.000g，加热煮沸，放冷，滤过。用水 15ml分次洗涤，合并洗液与滤液，加入新配制的 2.5%雷氏盐溶液 20ml，搅匀，10以下放置 3h。用 G4 垂熔漏斗滤过，沉淀用少量冰水洗涤，抽干，残渣加 70丙酮溶解，并转移至 25mL容量瓶中，加 70丙酮至刻度，摇匀，即为枸杞甜菜碱供试品溶液。2.1.3 甜菜碱标准曲线的建立 精确称取甜菜碱对照品 0.1000g，蒸馏水溶解并定容于 10mL 容量瓶中，即得 10.0 mg.ml-1甜菜碱标准液。分别精确移取甜菜碱标准液 0.4，0.6，0.8，1.0，1.2

18、ml 至 10mL比色管中，冷水浴放置 10min。取出后分别加入 6ml 新配置的 2.5雷氏盐溶液，然后用蒸馏水补充至刻度。冷水浴放置 3h，G4 垂熔漏斗过滤，用少量冰水洗沉淀，抽干，70丙酮溶解沉淀，并转移至 10mL 容量瓶中，用 70丙酮定容。以 70丙酮作空白对照，在 525nm 测定吸光度值。以其吸光度值（A）为横坐标，浓度(C)为纵坐标，绘制标准曲线。得线性方程 C=1.0578A+0.0794，相关系数 r=0.9972，表明甜菜碱在 0.41.2mgml-1X 围内有良好的线性关系。甜菜碱标准曲线见图 1 所示。9 甜菜碱标准曲线00.20.40.60.811.21.40

19、0.20.40.60.811.2吸光度值(Abs)浓度(mg/ml)图 1 甜菜碱标准曲线 2.1.4 供试品溶液的含量测定 以 70%丙酮为空白溶液，将供试品溶液于 525nm 处测定吸光度值。根据标准曲线计算枸杞甜菜碱百分含量。样品甜菜碱含量计算公式：样品甜菜碱含量(%)=C 样V 样/W 样100。其中：C 样标准曲线上查到的样品浓度 V 样样品溶液的体积 W 样样品质量 2.2 高效液相色谱法测定枸杞甜菜碱含量 参考 Young 等31利用高效液相色谱测定北方枸杞甜菜碱含量和聂国朝32利用高效液相色谱分析枸杞甜菜碱指纹图谱的方法，对枸杞甜菜碱的色谱分析条件进行改进优化，具体过程如下：2

20、.2.1 色谱分析条件 10 通过对波长、流动相、流速、洗脱方式的优化确定了枸杞甜菜碱提取物色谱分析条件为：乙腈：水（85：15）为流动相；等度洗脱；检测波长 195nm；流速 0.7mlmin1；柱温30；进样量 5L。2.2.2 枸杞甜菜碱供试品溶液的制备 精确称取过 40 目筛的干燥枸杞粉末 2.000g，加入 50ml 纯甲醇（料液比 1：25），7375加热回流提取 1h，放冷过滤，30ml 纯甲醇分次洗涤残渣和滤器，合并滤液和洗液，40减压浓缩至干。超纯水定容至 10mL 容量瓶中，即为枸杞甜菜碱供试品溶液。色谱分析时，供试品溶液过 0.45m 水系微孔滤膜。2.2.3 对照品溶液

21、的制备 精确称取甜菜碱对照品 0.2500g，用超纯水溶解定容于 25mL 容量瓶中，制成 10.0mg ml1的贮备液，甜菜碱标准对照品溶液由此稀释得到。色谱分析时，对照品溶液过 0.45m 水系微孔滤膜。2.2.4 甜菜碱标准曲线的制备 分别精确量取 10.0mgml1的甜菜碱贮备液 0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 于 10mL 容量瓶中，超纯水定容，制成 0.5、1.0、2.0、4.0、5.0mgml1的甜菜碱对照品溶液。各吸取5L 进样，按 2.2.2.1 所述色谱条件进行分析。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线并进行回归计算，得甜菜碱回归方程 Y=833116.1

22、X+219584.4，r=0.9988。表明甜菜碱在 0.5-5.0mgml1X 围内线性良好。2.2.5 供试品溶液的含量测定 分别吸取 5L 甜菜碱供试品溶液进样，按 2.2.2.1 色谱条件进行色谱分析。枸杞甜菜碱提取物组成相同，所有组分均在 40min 内洗脱出柱，典型色谱图如图 2 所示。对照品甜菜碱保留时间为 16.58min，与供试品溶液色谱图中的 5 号峰保留时间一致，确定 5 号峰为甜 11 菜碱峰。利用 LC-Solution 色谱分析软件对甜菜碱色谱峰的峰面积峰高进行积分，根据对照品回归方程计算甜菜碱含量。123456780.05.010.015.020.025.030.

23、035.0min0.0 00.2 50.5 00.7 51.0 01.2 51.5 01.7 52.0 02.2 52.5 0(x10 0,000)图 2 枸杞样品甜菜碱色谱图 2.2.6 方法学考察 (1)精密度实验：取 1样品的供试品溶液，连续进样 5 次，记录色谱图，相对保留时间 RSD0.9%，相对峰面积 RSD 为 2.0%-3.2%，表明仪器精密度良好。(2)稳定性实验：取 1样品的供试品溶液，分别在 0，2，4，8，12，24 h 进样，记录色谱图，相对保留时间 RSD0.79%，相对峰面积 RSD 为 1.8%-3.13%，表明供试品在 24h内稳定。(3)重现性实验：制备 5

24、 份 1样品的供试品溶液，进样，记录色谱图，相对保留时间RSD0.84%，峰面积 RSD 为 2.5%-4.2%，表明方法重现性良好。2.2.7 回收率实验 已知含量的样品供试品溶液中，加甜菜碱对照品适量，按 2.2.1 色谱条件进行色谱分析，测定平均回收率为 98.9%（n=5），RSD 为 3.12%。3结果与分析 3.1 分光光度法与高效液相色谱法测定枸杞甜菜碱含量的结果比较 12 分光光度法和高效液相色谱法测定的不同产地 XX 枸杞甜菜碱含量见表 1 所示。表 1 分光光度法和高效液相色谱法测定不同产地枸杞甜菜碱含量结果（三线表表内文字为五号或根据内容编排）测定方法 甜菜碱含量 样品编

25、号及 （%）产地 分光光度法 高效液相色谱法 1#XXXX 南梁农场 0.923 1.498 2#XXXX 枸杞研究所 0.570 1.043 3#XX 中宁恩和乡 1.125 1.608 4#XX 中卫镇锣 0.815 1.144 5#XXXX 黑城乡 0.865 1.208 6#XXXX 园林场 0.948 1.311 7#XX 中宁舟塔乡 1.075 1.361 8#XX 同心河西镇 0.983 1.359 由表 1 可知：利用高效液相色谱法测定的枸杞甜菜碱含量明显高于分光光度法。从两种方法的前处理过程来看，采用分光光度法需要对甜菜碱初提物进行活性炭脱色、雷氏盐沉淀等多个步骤，此处理方法

26、较繁琐、耗时较长、且其中活性炭脱色和雷氏盐沉淀过程均会造成样品甜菜碱的损失，影响测定结果的准确度和重复性。而高效液相色谱法不需要对样品进行前处理，不仅避免了操作步骤太多带来的样品损失问题，而且分析速度快、灵敏度高，重现性好。3.2 高效液相色谱法测定枸杞甜菜碱含量的方法分析 3.2.1本实验过程中，选择不同比例的乙腈：水为流动相进行优化，结果表明：乙腈：水（85：15）为流动相，流速：0.7 mlmin1，柱温：30，分离度较好，达到基线分离。3.2.2 本实验对检测波长进行了选择：甜菜碱结构中无共轭体系，但在低紫外区（190220nm）有吸收，本研究借鉴文献报道31，应用 NH2色谱柱，未经

27、衍生化处理，保留了枸杞中甜菜碱提取物的原始成分，通过比较 193、195、210nm 三个不同波长处的色谱图，结 13 果表明：195 nm 处色谱峰信息丰富，各组分均有较大吸收，最后确定色谱分析波长为 195 nm。3.2.3 目前采用的高效液相色谱法大多是对甜菜碱提取物进行柱前衍生后测定含量的，此方法破坏了甜菜碱提取物的原始成分。而利用 NH2柱无需对甜菜碱提取物进行衍生，可直接测定枸杞中甜菜碱的含量，保留了枸杞中甜菜碱提取物的原始成分，方法简便、快速。4讨论 随着现代分离分析技术的发展，高效液相色谱法因兼具分离和分析功能，且具有快速、准确、重现性好等优点，已被广泛应用于中药化学成分的分离

28、分析和含量测定，在植物甜菜碱含量测定方面的应用也逐渐增加。本文分别利用 NH2柱未经衍生高效液相色谱法和分光光度法测定了不同产地 XX 枸杞中甜菜碱的含量，并将两种方法测定的枸杞甜菜碱含量进行了比较。结果表明高效液相色谱法测定的枸杞甜菜碱含量明显高于分光光度法，且该方法简便、快速、重复性好。因此，NH2柱未经衍生高效液相色谱法值得在枸杞甜菜碱含量测定方面推广应用。参考文献（黑体，三号）1 白寿宁.XX 枸杞研究M.:XX,1999.1113.2 刑世瑞.XX 中药志（上卷）M.：XX 人民,2005.5167.3 孙志刚.XX枸杞药理研究进展J.西北药学杂志，2001，3(16):133134

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