植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定11202.pdf

《植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定11202.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定11202.pdf（9页珍藏版）》请在淘文阁 - 分享文档赚钱的网站上搜索。

1、植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定实验目的1了解创建烟草突变体库的方法；2理解每种方法的基本原理；3掌握农杆菌介导的转基因方法以及转基因产物筛选和鉴定的基本过程。实验原理随着越来越多植物的全基因组测序工作的完成，在此基础上开展功能基因组的研究是目前的核心研究内容之一。植物插入突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要内容，在此基础上也能进行正向遗传学及反向遗传学的研究。在创制突变体的策略上，传统方法是使用物理或化学诱变方法获得，其优点是可在尽可能短的时间内获得饱和突变体。与传统的物理和化学诱变方法相比，生物诱变(T-DNA 和转座子插人诱变)通常可标记突变基因，从而较为容易地分离鉴定靶基因。最

2、近数年，通过农杆菌介导的T-DNA 插入突变已成为国际公认的植物功能基因组学的主要研究方法之一。烟草是植物基因组研究的一种模式植物，其突变体库的创建是烟草功能基因组学研究中的重要内容，其目的是通过大规模的突变体库平台快速全方位的了解基因组中各个基因的功能。突变体的创制是遗传学研究的基础，也是分离基因和基因功能鉴定的最要途径。通过诱导培养，使烟草产生愈伤组织，利用土壤农杆菌感染愈伤组织，实现T-DNA 标签在烟草愈伤组织基因组中大量随机插人，利用植物细胞的全能性，经过抗性筛选，诱导分化，从抗性愈伤组织获得烟草突变体再生植株，获得各突变体的纯合材料，从而建立烟草突变体的数据库，然后分析突变性状与T

3、-DNA 的共分离关系，存在共分离的材料用适当的Tail-PCR 克隆技术获得T-DNA 的侧翼基因组序列，用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再进行下一步的分析（图实验4-1）。T-DNA 载体构建转化植物（T1，T-DNA 杂合子)收获T2 种子T23:1T-DNAT-DNADNATail PCR)DNAcDNA4-1 T-DNATAIL-PCRT-DNAT-DNATm57-62ADTm44-46DNAPCRT-DNA4-2TAIL-PCR2TAIL-PCR4-2 TAIL-PCRT-DNApCAMBIA1301LBA4404T-DNAT-DNAPCRHPTTAIL-PCRGene

4、BankPCRDark ReaderT-DNApMD83rcLBA4404Ex-taq DNA DNA 1kb laddeerGoldView1.2 CTAB100mmol/L Tris-HCl pH8.0 2w/vCTAB 1.4mol/L NaCl 40mmol/L b-20mmol/L EDTA 2.TE10mmol/L Tris-HCl pH8.0 1mmol/L EDTA 3.50 TAE1000ml Tris 54g 27.5g 0.5mol/L EDTA 20ml 4.105.(V:V241)6.707.I50 mmol/L25 mmol/L Tris.HClpH8.010 mm

5、ol/L EDTApH8.0100ml 8.III60ml 5mol/L11.5ml 11.528.5ml100ml 9.II0.4 mol/L NaOH2SDS30ml1:110.LB950mL(bacto-typtone)10g(bacto-yeast extract)5g NaCl 10g 200uL 5mol/L NaOHpH7.011212011.MSmg/L mg/L mg/L NH4NO31650 KI 0.83 2.0 KNO31900 H3BO36.2 0.5 CaCl22H2O 440 MnSO44H2O 22.3 Vb60.5 MgSO47H2O 370 ZnSO47H2

6、O 8.6 Vb10.l KH2PO4170 NaMoO42H2O 0.25 100 CoCl26H2O 0.025 CuSO45H2O 0.025 FeSO47H2O 27.8 50400mL 33g38g3.4g7.4g100200mL 0.556gEDTA0.746g100200mL Gly 0.040gVB1 0.002gVB6 0.010g2g0.010g1000200mL 166mg1240mg3380mg1720mg44mg5mg5mg50400mL 8.8g 12.MS0.2mg/L 6-BA0.02mg/L NAA3%0.6%6-BA 25mg1M NaOH50mLNAA25

7、mg1M NaOH50mL2,4-D50mg1M NaOH100mL0.5mg/mL 13.MS0.2mg/L 6-BA 0.02mg/L NAA3%0.6%100mg/L14.KANA50mg/mL1g KANA20mLRIF50mg/mL0.25g RIF50mLSTR30mg/mL0.6g STA20mL100mg/mL2g20mLB50mg/mLI 1.703010510335min0.5cm 0.5cm6mm2.MSNAA6-BAMSII 1.T-DNA20ml LBKana 50ug/mlRIFSTR27180rmin2ml20ml LB6OD6000.20.52.70301051

8、0335min0.5cm 0.5cm6mm3.80r/min510124.MS2635.100ug/L50ug/LB342000lx2616h4MS1.0.5mL65CATB6530min2.0.5mL24:112000rpm10min3.1-203060min8000rpm15min4.70%25.150.7%6.pMDC83rc13-5ml12000rpm1min2300I6-83300II6-84300III6-8512000 rpm 15min60.53min12min770%820ml-207.DNAPCRPCRGFPGFP-F:5-GCGGCGATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3GFP-R:5-TTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTG-310.2mlPCRPCR2510 PCR Buffer dNTP Mixture GFP-F GFP-R Ex-Taq DNA 14.2 ul 2.510.50.50.31 ul 2PCR94 94 58 72 72 sec 30 10 60 60 600 308.PCR9.1%PCR102L DNA MarkerDNA120V20minT-DNAGFPGFP735bp10.