小鼠MCAO总结8815.pdf

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1、小鼠 MCAO 模型 一、实验器材：1.手术器械：眼科剪 1、显微剪 1、钩镊 1、直镊 1、显微镊 2、止血钳 1、持针器 1、缝合线（2-0/5-0）、缝合针、麻醉剂：10%水合氯醛（350mg/kg）2.栓线：（2025g）、(2530g)；在栓线 10mm 的位置用黑色记号笔标记；75%酒精清洁后置 1:2500 单位肝素化生理盐水中备用。3.其他用品：酒精棉球、75%酒精、生理盐水、注射器（1ml、2ml）、黑色记号笔、固定鼠用粗线绳、鼠板 二、步骤：Zea Longa 线栓法 1.麻醉：10水合氯醛腹腔注射（350mg/kg）2.术前准备：仰卧位固定大鼠，备皮消毒 3.分离血管及挂

2、线：1)自胸骨柄到下颌骨间取长约 1cm 正中切口。见下颌下腺，将其分离至两侧；2)见右侧肩胛舌骨肌、胸骨舌骨肌、二腹肌形成的三角区，镜下分离此三角区内，暴露右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA）；3)首先分离 CCA 于其上挂线 1；4)随后向头侧分离 ECA 血管及其分支，于 ECA 上头尾侧分别挂线 2、3；5)然后清除 CCA 分叉部脂肪，观察 ECA 分支与 ICA 关系，分离 ICA 及 ECA 分支，于其上挂线 4；6)注意操作轻柔避免迷走神经、舌咽神经、气管损伤，避免过度牵拉血管使其严重移位或断裂。5.结扎：死结：线 1、2；活结：线 4；不系结：线 3

3、 6.剪口插入：1)将鼠台逆时针旋转 90，在 ECA 上距分叉 1用显微剪剪一切口；2)将标记好的线栓由此切口插入 CCA 中；3)将鼠台转回，将线栓从 CCA 拔出至分叉稍尾侧，右手将线栓转向滑入 ICA，右手拉开线4 活结，后继续插入 ICA，待有阻力时再进入少许，深度 1cm+，到达大脑中动脉与前交通之间；4)顺利插入后将丝线 4 扎紧，抽出线 3 减去多余线头。6.缝皮 7.术后：小鼠俯卧位，头略抬高，至于温湿度适宜环境。三、注意事项：1.雌性鼠对于牵拉等操作的反应更强烈，故建议选择雄性大鼠作为实验对象。2.大鼠解剖学变异：一般而言，Fisher-344 大鼠 MCA 解剖变异较小，

4、闭塞后形成的梗死体积一致性好；Wistar-Kyoto 大鼠变异相对最大；而 Sprague-Dawley 大鼠介于两者之间。3.麻醉：10%水合氯醛腹腔注射（30ml/kg），一般可持续 1。如按标准体重计算的麻醉剂量效果欠佳，可使用总量的 10%进行追加。需注意反复多次或过量追加易造成动物死亡，或导致清醒推迟而影响再灌注前评分，从而使再灌注时间不能统一界定在 2h。水合氯醛可使动物呼吸频率下降 50%左右,但一般不会导致动物窒息而死亡。术中严密观察动物呼吸频率、深度及有无痰鸣音等。4.分离气管前肌肉时注意保护好甲状腺和甲状旁腺。甲状腺呈鲜红色，紧密贴在气管前壁上，甲状旁腺位于甲状腺外上方，

5、颜色略淡。血管分离要到位，使用电凝器可明显减少小血管的出血，从而保证手术野清晰，尤其是肌肉内部的血管和 ECA 的一些细小分支，未明确时不可随意离断。结扎血管时要注意力度和方向，由于血管被膜被分离后血管表面相当光滑，结扎不牢可能导致难以控制的出血；术中还要注意保护与血管紧密相依的神经，注意观察神经的颜色、反光性和轻触时的感觉，切勿损伤或离断。牵拉迷走神经时可见动物呼吸明显减慢甚至血液呈深紫色，出现肢体末端紫绀。在无法给予辅助通气时，应暂停操作。一般来说，动物呼吸可恢复到麻醉后的平稳状态，血液颜色也可恢复到正常，这时再继续手术较为安全。5.关于是否结扎 PPA 文献报道尚不一致。可沿 ICA 一

6、直分离至看到其入颅分支与 PPA 分叉处，观察线栓走行状况，若顺利将长度约 1cm 的线栓插入，则可固定线栓而无需对 PPA 进行操作；如只进入 5mm 左右即遇到明显阻力，则线栓进入 PPA 的可能性很大，此时可将线栓撤离至 ECA/ICA 处，提起 PPA，以帮助线栓沿 ICA 进入颅内而最终阻塞MCA。6.Koizumi 等 1986 年首次报道不开颅经 CCA 插入尼龙线栓致 MCA 闭塞；之后，Longa 等进行了改良，将栓线从 ECA 插入，再灌注时将栓线抽回 ECA 内，通过 CCA 实现再灌注。Koizumi 使用的丝线末段均匀包被硅胶，直径增加近 3040%，插入后不仅可伸入

7、大脑前动脉 ACA）近端，肯定阻塞 ACA 及前交通动脉，而且阻塞 MCA 及后交通动脉开口处，彻底阻塞 MCA 及其所有侧枝供应血管，形成供应区域完全缺血，因此局部梗死面积大，均匀一致，各动物间差异较小。Longa 使用的 4-0 尼龙线末端球形扩大，但并非直接闭塞 MCA，而是依靠结扎同侧 ICA 和其球形扩大的末端伸入 ACA 腔内、阻断经前交通动脉来自对侧 ACA 的血流形成局灶性脑缺血，但不能阻断来自后交动脉的侧枝供应，且丝线末端伸入 ACA 腔内位置不同，所起作用差异很大，因此形成的梗死面积很小，各动物之间差异较大。宋红松等建议采用 Koizumi 方法。丁香园：1.注意尽量不要损

8、伤在颈内颈外分叉下的交感神经节。2.栓线进入后颈内动脉后即可逐渐插入了，有时候很顺利一插到底，但有时候在中间就怎么也进不去了，这是因为在血管入颅穿过颅骨时有一个狭窄或者角度。因此，碰上这种明显阻力时，一定不能盲目向前使力插，越插栓线前端变形越进不去且容易损伤血管。这时候正确的作法是往外抽出较多栓线，也许会有一定的动脉血流出，不必慌，只要顺着血管走行调整一下进线角度轻柔的使劲，一般都能进去，反复试几次还不行最好换根栓线，很可能前端也经变形角度变了！颈内动脉的走向为内上方,可以用眼科镊夹住鱼线插,但进去后要注意,别太用力,要不血管就要破了 3.栓线不能在血管里反复进退，否则及容易造成蛛网膜下腔出血

9、，而且很容易误解为模型成功，因为这时的神经功能改变也很明显，但并不是由于栓塞引起的 4.大鼠仰卧时，ICA 从 CCA 分出后下行（向背侧）约 5mm 又分为两支 A，即走向乳突泡（Mastoid bulla）的 翼腭 A 和进入颅内的 ICA 的延伸部分。因为翼腭 A 的走向几乎和分支前的 ICA 走向相同，而 ICA 的延伸部分则是改向头侧走行，所以插线时会很自然的进入翼腭 A。进线时，用镊子将 ICA 轻轻往头侧推一下，使 ICA 和其延长的分支成一直线，同时顺势插线，可很容易的进入颅内。或使栓线有一定程度的弯曲，且只要保证栓线向屋顶方向弯曲，一般都能将线插如颅内，决不会进入翼腭A。5.

10、注意手的感觉，轻缓推进，直至感觉到阻力为止（当遇到阻力后，再插线会见到线弯曲）。可能有人会说，把血管插破了也未感觉到阻力或线遇阻后的弯曲。一个原因是线太硬，另一主要原因是当栓线从血管切口插入后为防止血液从此处流出，需要结扎一条细线，这条线结扎的松紧程度很关键，应在不流血的情况下尽可能的松，这样你会发现进线时很轻松，一旦遇到阻力，就会感觉到。后者至关重要，请体会。6.栓线一旦进入 ACA，就要把上面提到的那根细线适度扎紧（“适度”很重要，会影响到再灌流时大鼠的生死存亡），此时的关键是动作轻柔，不要使 ICA 有任何的牵拉，否则栓线会脱出 ACA，可能会造成缺血失败。血管外的栓线不要留得过长，更不

11、要缝在皮外，大鼠醒来后会自己拔出。7.如果你用的是中长效麻醉剂，插线成功后，固定丝线，然后让其俯卧位，而且稍稍抬高其颈部，才能确保模型成功。8.术后一定要注意保暖。9.插入线拴要轻柔熟练，速度尽可能快，以避免时间长了血管内血栓形成。10.手术后评分的主观因素很大，有用 5 分制和 11 分制的，我个人认为用 5 分制比较准些。11.大鼠大脑中动脉永久性闭塞性脑缺血模型，梗死体积出现的最小时间点可能为 2h，体积随时间进行性增大，至 12h 基本趋于稳定 12.整个试验是很费动物的，存在 15-30的淘汰率（如果你做的好），但注意严格控制自己淘汰的动物（纪录具体情况）。13.除了刚才说的蛛网膜下

12、腔出血外，还有一些老鼠肺出血明显，整个肺暗红，我也想不出原因，不知道是不是医学临床所说的脑肺综合症.14.术后处理：由于术后动物尚未清醒,因此护理也很重要。但为保证栓线成功,达到预期的阻塞时间,防止栓线脱落暂时把动物留在手术台上,保证动物不会因挣扎而把栓线过早脱落,但仍需监测体温,并注意保暖。再灌注后动物可放入笼中。另外笼中应保持干燥,没有积水及粉尘,防止动物误吸而窒息。我们在实验中发现一些模型症状不典型甚至没有症状,都是由于动物苏醒后极力挣扎使栓线过早脱落所致。手术后大鼠存活期可以满足通常的实验需求,一般来讲,随着栓塞和再灌注损伤时间的延长,死亡率会上升。大鼠在术后 2448 小时最容易死亡

13、,这种死亡是严重脑缺血损伤造成的,较直接的因素是脑水肿。用线栓制作持续性局灶性脑缺血模型时,术后要肌注庆大霉素预防感染;如果动物模型要生存 1 周以上,必要肌注速尿,防止因脑水肿动物在短期内死亡。术后饮水中加入葡萄糖,保证动物术后有充足的能量生存到实验要求的时间。舍去标准：栓线插入深度不足 18 mm,且无明显神经功能缺损表现或症状很轻的大鼠 蛛网膜下腔出血、MCA 起始部或其附近的 willis 环动脉有凝血块的大鼠，因为这是出血性脑损伤或永久性脑缺血损伤，而非 MCAO/Reperfusion 损伤。3）手术时出血较多，症状很重的动物。死亡原因分析：首先要找出死亡原因，解剖死亡大鼠的脑，先看是否有蛛网膜下腔出血，如有出血，表明死因是插线太深，以后注意插线深度；如无出血，则还要再看是否有严重的半球水肿，如水肿严重，则表明死因是脑缺血时间太重，需要缩短缺血时间；如既无出血，又无明显的脑水肿，那就要注意动物状态或生活环境是否太差。